文│孫娟（山東省聊城市茌平區(qū)動物疫病預防控制中心）

羊李氏桿菌病又被稱為轉(zhuǎn)圈病，該病是由單核細胞增多性李氏桿菌感染導致的一種傳染性疾病。該病主要通過呼吸道、消化道、受損皮膚等途徑感染。該病多為散發(fā)，但病死率較高。妊娠期母羊感染后可出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀，羔羊感染后快速死亡。該病對我國養(yǎng)羊業(yè)危害巨大。

一、李氏桿菌生物學特性

1.血清型。單增李氏桿菌含有特異性表面蛋白、鞭毛抗原和菌體抗原。目前共發(fā)現(xiàn)13種血清型，分別為3a、3b、3c、1/2a、1/2b、l/2e、4a、4b、4e、4d、4ab、4c或7型。其中4b型危害最為嚴重，占總病例的50%。

2.形態(tài)結(jié)構(gòu)。單增李氏桿菌是一種革蘭氏陽性菌，菌體形狀呈兩端鈍圓、略彎曲、大小約為0.4～2微米、無芽孢。22℃時可形成鞭毛，具有運動性。隨著溫度升高至37℃時，鞭毛數(shù)量降低至一根，運動性能下降。

3.培養(yǎng)。單增李氏桿菌為兼性厭氧菌，生長環(huán)境為1～45℃，通常在35℃條件下活性最強。20～25℃環(huán)境下穿刺培養(yǎng)2～5天，其可生長為倒立的傘狀。常溫條件下培養(yǎng)可通過顯微鏡觀察到細菌在培養(yǎng)基內(nèi)呈翻轉(zhuǎn)運動。單增李氏桿菌對營養(yǎng)要求較低，可在普通瓊脂培養(yǎng)基上正常生長。培養(yǎng)1～2天后，培養(yǎng)基上可生長出輪廓明顯的菌落，菌落多呈藍灰色透明狀，陽光斜射可表現(xiàn)出藍綠光澤。在血液葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)可形成光滑的圓形菌落，且出現(xiàn)β-溶血環(huán)。液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24小時后可出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，連續(xù)培養(yǎng)一段時間可觀察到沉淀。

4.生化特性。單增李氏桿菌常溫下可發(fā)酵分解產(chǎn)生葡萄糖、果糖、乳糖等，但無法發(fā)酵木糖、甘露醇、阿拉伯糖等。硫化氫、甘露醇、賴氨酸還原試驗為陰性，不產(chǎn)生H2S和靛基質(zhì)，馬尿酸鈉、過氧化氫、甲基紅試驗為陽性。

5.抗性。單增李氏桿菌對外界環(huán)境適應(yīng)性較強，可在高溫、高滲透壓、酸、堿性環(huán)境下生存。通常1～45℃內(nèi)均可生長，且在30～37℃環(huán)境下具有較強的活力。同時，可在-0.1～0.4℃中生存，是一種耐冷的病原菌。另外，該病原菌對高溫環(huán)境耐受性較強，60℃條件下20分鐘方可滅活。同時，對酸耐受性強，pH 5.6～9.4范圍內(nèi)均可生長。除此之外，單增李氏桿菌對鹽具有較強抵抗力，10%氯化鈉條件下可大量生長。病原菌對干燥抵抗性強，可在干燥的日糧中長期存在。但病原菌對酒精、新潔爾滅等消毒劑以及紫外線較為敏感。

二、鑒別

1.剖檢變化

（1）腦炎型。對病羊解剖可發(fā)現(xiàn)病羊肝腫大，存在彌散性壞死病灶。胃黏膜、腸系膜淋巴結(jié)、肝、腎、脾等器官炎癥明顯，且多有充血或水腫現(xiàn)象。腦積液增多，腦干質(zhì)地變軟。血液和組織中含有較多的多形核細胞，血管周圍存在大量壞死灶。

（2）子宮型。對妊娠期病羊解剖可發(fā)現(xiàn)胎盤病變明顯，且絨毛上皮出現(xiàn)壞死，頂端分泌大量膿性滲出物。子宮內(nèi)胚胎早期死亡且自溶。淋巴結(jié)、胃腸黏膜、氣管黏膜等有明顯的充血現(xiàn)象，且肝、脾存在大量壞死病灶。

（3）敗血型。對病羊解剖可發(fā)現(xiàn)病羊脾腫大，存在大量粟狀壞死病灶。同時伴有鼻炎、出血性結(jié)膜炎、腦膜充血。

2.實驗室檢查

（1）鏡檢。無菌條件下采集病死羊肝進行涂片，隨后進行染色、鏡檢可發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陽性菌，菌體兩端鈍圓，單個或成對相連，無莢膜和芽孢。

（2）分離培養(yǎng)。無菌條件下采集病死羊肝組織樣本，將其按照1∶5的比例與生理鹽水進行混合，隨后研磨并將其分別接種于血液瓊脂培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。其中血液瓊脂培養(yǎng)基分別放置于37℃、厭氧和有氧條件下培養(yǎng)1～3天。培養(yǎng)結(jié)束后可發(fā)現(xiàn)肉湯變渾濁，無氣泡產(chǎn)生。血液瓊脂培氧基上生長出大量圓形透明菌落，菌落表面光滑，周圍有溶血環(huán)。透光檢查發(fā)現(xiàn)菌落為藍灰色，進一步培養(yǎng)后，藍灰色菌落逐漸變?yōu)榛野咨?，透明程度降低。挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，并將其分別接種于0.05%和0.1%的亞蹄酸鉀血液瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，放置于37℃條件下培養(yǎng)1～3天，可發(fā)現(xiàn)0.05%濃度的培養(yǎng)基上生長出大量灰白色菌落，且菌落經(jīng)過72小時顏色變?yōu)榧t色。0.1%濃度的培養(yǎng)基內(nèi)生長大量黑色菌落。若將可疑菌落接種于血清葡萄糖甘油肉湯和10%氯化鈉的血清葡萄糖甘油瓊脂內(nèi)，置于37℃條件下培養(yǎng)1～3天，可發(fā)現(xiàn)前者混濁，底部出現(xiàn)沉淀物。培養(yǎng)初期震蕩培養(yǎng)基，沉淀物呈螺旋狀上升，培養(yǎng)后期震蕩沉淀成顆粒狀。后者培養(yǎng)基內(nèi)會出現(xiàn)大量圓形透明菌落，菌落表面光滑呈藍色。培養(yǎng)后期發(fā)現(xiàn)菌落逐漸變?yōu)椴煌该鞯幕野咨?/p>

（3）運動性檢查。運動性檢查也是鑒別單增李氏桿菌的重要方式之一。取血清葡萄糖甘油肉湯純培養(yǎng)物在半固體培養(yǎng)基內(nèi)進行穿刺接種，并放置于20℃條件下培養(yǎng)三天。鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體可移動，且沿穿刺線生長至兩側(cè)呈倒立傘狀。或放置于37℃條件下培養(yǎng)三天，發(fā)現(xiàn)其菌體運動性能減弱甚至消失。菌體沿穿刺線稍向兩側(cè)生長。

三、檢測方法

單增李氏桿菌對外界環(huán)境具有較強的抵抗力，是目前世界上危害最為嚴重的病原菌之一，一旦污染日糧會給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失。近年來隨著疫情的不斷發(fā)生，單增李氏桿菌檢測逐漸引起重視。其檢測方法也不斷向快捷、靈敏、準確方向發(fā)展。目前該病原體的檢測方式主要分為傳統(tǒng)檢測、分子生物學檢測以及免疫學檢測三種。

1.傳統(tǒng)檢測。單增李氏桿菌傳統(tǒng)檢測方法主要是將疑似病例采集的樣品進行分離培養(yǎng)。隨后將培養(yǎng)基上生長的菌落進行生化反應(yīng)分析，并在顯微鏡下觀察其運動，同時進行溶血實驗，最后再進行血清型分析鑒定。傳統(tǒng)檢測方法靈敏度高、特異性強，可定性、定量檢測且檢測成本較低，但檢測過程較慢，影響檢測結(jié)果的因素較多。

傳統(tǒng)檢測方法中美國食品藥品管理局的增菌法和冷增菌法是目前國際上公認的有效檢測方法之一。增菌法適用于分離乳汁中的病原菌，將樣品接種在含放線菌酮的肉湯內(nèi)進行培養(yǎng)，隨后通過劃線法分離細菌，細菌在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)一段時間形成菌落后，提取可疑菌落進行生化反應(yīng)和血清型鑒定。冷增菌法是將采集的樣本置于4℃條件下培養(yǎng)，每7天進行一次細菌分離，連續(xù)分離培養(yǎng)兩個月。最后，進行病原菌生化反應(yīng)和血清型鑒定。

我國單增李氏桿菌檢測起步晚，目前檢測方法包括國標法和小鼠毒力試驗兩種。上述方法均需增菌和分離提純，其中小鼠毒力試驗法操作簡單、快速。

2.免疫學檢測。該方法檢測原理是依據(jù)抗原抗體反應(yīng)進行檢測。檢測時采集少量樣品即可精確檢測出抗原，且檢測結(jié)果不受基質(zhì)的影響。免疫學檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫技術(shù)、免疫磁珠分離技術(shù)等。免疫學檢測方法操作簡單靈敏性高、特異性強、檢測結(jié)果易于判斷。

（1）膠體金免疫技術(shù)。該方法是使用膠體金作為標記物的一種免疫標記技術(shù)，主要分為快速免疫層析法和快速斑點金滲濾法。其中快速免疫層析法對李氏桿菌檢測靈敏度高達85%以上。通?？墒褂脵幟仕徕c制備膠體金標記單增李氏桿菌抗體免疫層析檢測板。

（2）酶聯(lián)免疫吸附法。酶聯(lián)免疫吸附法是目前應(yīng)用最為廣泛的一種免疫學檢測方法，該方法主要針對鞭毛抗原。酶聯(lián)免疫吸附法檢測李氏桿菌通常2～3小時可出檢測結(jié)果，PCR聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附法可在5小時內(nèi)檢測出10個單增李氏桿菌菌落。酶聯(lián)免疫吸附法操作簡便、易被標準化。

（3）免疫磁珠分離技術(shù)。本檢測技術(shù)主要依據(jù)抗原抗體結(jié)合的特異性。抗原與抗體結(jié)合后利用磁性進行分離，從而獲得對富集于微粒上的單增李氏桿菌，為后續(xù)檢測提供便利。

3.分子生物學檢測。常用的分子生物學檢測方法，包括聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）、免疫磁珠分離與PCR結(jié)合法、基因芯片技術(shù)等。

（1）PCR。PCR檢測法在單增李氏桿菌檢測上廣泛應(yīng)用，檢測人員可使用傳統(tǒng)的分離鑒定方法以及PCR方法，從而對病原菌進行檢測比較。與常規(guī)檢測法相比，PCR檢測法要求較低。另外，PCR檢測法還可與其他檢測技術(shù)相結(jié)合，從而有效提高檢測靈敏度和特異性，例如高速離心等，同時也可有效降低檢測量。

（2）免疫磁珠分離與PCR結(jié)合法。免疫磁珠分離與PCR結(jié)合法以核酸探針技術(shù)為基礎(chǔ)，核酸探針技術(shù)的應(yīng)用是單增李氏桿菌分子水平檢測的標志技術(shù)?？赏ㄟ^利用32P標記探針，從而進行斑點雜交實驗。由于其僅與單核李氏桿菌發(fā)生反應(yīng)，因此具有良好的特異性。另外以RNA作為靶點研發(fā)的新型探針試劑盒，可大大縮短檢測時間提高檢測效果。免疫磁珠分離與PCR結(jié)合法特異性強，但對檢測人員要求較高，操作復雜，因此實際檢測過程中應(yīng)用范圍較窄。

（3）基因芯片技術(shù)。基因芯片技術(shù)是一種革命性技術(shù)，該技術(shù)基于基因表達和基因功能的研究，又被稱為DNA芯片技術(shù)。目前該技術(shù)可檢測6種李氏桿菌，其中單增李氏桿菌檢測限為200國際單位/克?；蛐酒夹g(shù)具有高融通、速度快、誤差小等特點。但實際檢測過程中仍需將病原菌進行純化富集處理，從而進一步提高檢測靈敏度和特異性，富集處理后還需進行PCR檢測。

四、結(jié)語

綜上所述，羊李氏桿菌病對羊群危害嚴重，嚴重制約我國養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展。因此，做好疾病的鑒別和檢測，及早發(fā)現(xiàn)疫情對降低養(yǎng)殖損失至關(guān)重要。養(yǎng)殖人員應(yīng)充分了解病原菌特性以及疾病檢測方法，做到早發(fā)現(xiàn)、早確診，早治療。