羅金燕， 謝婷， 陳磊， 杜偉， 張健男， 朱潔， 安千里， 李斌*

(1.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心， 上海 201103； 2.浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所， 浙江 杭州 310058；3.寧夏回族自治區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站， 寧夏 銀川 750001； 4.溫州市植物保護(hù)與土壤肥料管理站， 浙江 溫州 325000)

黃瓜綠斑駁花葉病毒在世界范圍內(nèi)分布廣泛，其寄主主要為葫蘆科作物，對(duì)瓜類作物危害極大。危害西瓜時(shí)，前期主要癥狀為花葉斑駁，在西瓜生長(zhǎng)后期還可能引起果肉組織嚴(yán)重纖維化導(dǎo)致空腔，形成“倒瓤”，嚴(yán)重影響果實(shí)的食用與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。CGMMV一旦暴發(fā)就會(huì)給西瓜產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，2005年我國(guó)遼寧蓋州CGMMV大暴發(fā)，造成當(dāng)?shù)匚鞴洗竺娣e絕收[2]。CGMMV可穩(wěn)定存在于種子表皮與內(nèi)種皮，帶毒種子是CGMMV傳播的主要途徑，目前生產(chǎn)上主要以種子干熱消毒預(yù)防為主，輔以藥劑等手段進(jìn)行綜合防控，但干熱消毒通常影響種子活力。

納米顆粒通常是指被定義為1～100 nm的粒子，由于其獨(dú)特的理化特性和良好的抗菌性能，近年來(lái)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上被廣泛使用，為病害綠色防控提供了新策略。氧化鋅納米顆粒(ZnO NPs)和二氧化硅納米顆粒(SiO2NPs)對(duì)人體無(wú)毒且易于制備，有研究[3]表明，ZnO NPs或SiO2NPs可通過(guò)直接影響病毒和提高植物自身的防御能力來(lái)保護(hù)本氏煙免受TMV侵害。二氧化鈦納米顆粒(TiO2NPs)也是最常制備的納米顆粒之一，研究[4]表明，TiO2NPs可能通過(guò)激發(fā)活性氧(ROS)產(chǎn)生來(lái)防治植物病害。這些研究證明納米顆粒在植物病毒防控中具有較好的潛力。

本研究選用ZnO NPs、TiO2NPs和SiO2NPs這3種商品化的納米顆粒，制備成2 mmol·L-1的溶液對(duì)健康西瓜植株進(jìn)行葉面噴施，連續(xù)處理3 d后接種CGMMV，以無(wú)菌水處理為對(duì)照，待植株發(fā)病后檢測(cè)各個(gè)處理組植株的生物量、葉綠素含量與病毒積累量，以此初步探究商品化納米顆粒對(duì)CGMMV的防控效果。

1 材料與方法

1.1 供試西瓜品種和納米材料

供試西瓜品種為市購(gòu)的早佳8424西瓜種子。供試納米材料：ZnO NPs(平均粒徑為30 nm)(上海麥克林生化科技有限公司)；TiO2NPs(平均粒徑為20 nm)(上海麥克林生化科技有限公司)；SiO2NPs(平均粒徑為30 nm)(上海超威納米科技有限公司)。

1.2 供試西瓜植株的處理

用玻璃瓶盛2/3體積的蒸餾水，取適量供試西瓜種子倒入玻璃瓶中，50 ℃水浴40 min，在育苗盤中鋪一層用蒸餾水潤(rùn)濕的尼龍紗布，將西瓜種子放在上面并置于28 ℃溫箱中催芽2～3 d，發(fā)芽的西瓜種子移栽到花盆里，置于28 ℃，光照16 h，黑暗8 h的溫室中生長(zhǎng)。

1.3 納米顆粒的噴施

當(dāng)西瓜幼苗長(zhǎng)至二葉一心期，將ZnO NPs、TiO2NPs、SiO2NPs 這3種商品化納米顆粒分別配制成終濃度為2 mmol·L-1的懸浮液，超聲振蕩30 min使納米顆粒完全分散，在西瓜真葉葉面噴施，用量為5 mL，對(duì)照植株噴施等量無(wú)菌水(ddH2O)；連續(xù)噴施3 d，讓納米顆粒滲透到植物體內(nèi)，每個(gè)處理選用10株西瓜苗，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以確保數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。

1.4 CGMMV的接種

第3天噴施納米顆粒的西瓜幼苗，在處理后的24 h內(nèi)接種CGMMV。具體方法為取系統(tǒng)感染CGMMV的西瓜老葉，將植物葉片按照1∶10的比例(m/V，g·mL-1)在接種Buffer(0.01 mol·L-1PBS)中研磨成勻漿，在800目石英砂覆蓋的兩片西瓜真葉上摩擦接種CGMMV；接種病毒后的西瓜苗移至防蟲(chóng)溫室中，設(shè)置生長(zhǎng)參數(shù)為：光照28 ℃，16 h；黑暗25 ℃，8 h；濕度為75%；1～2周植株發(fā)病后通過(guò)調(diào)查病毒的增殖和西瓜植株的發(fā)病嚴(yán)重程度以及生物量、葉綠素含量等生理指標(biāo)的變化，以評(píng)估各納米顆粒對(duì)CGMMV感染的影響。

1.5 生物量的檢測(cè)

1～2周植株發(fā)病后，分別測(cè)量各個(gè)組別的株高、總鮮重、總干重。將植株的根際土壤洗干凈，擦干后測(cè)量ZnO NPs、TiO2NPs、SiO2NPs、對(duì)照4個(gè)處理組的株高、鮮重；將新鮮植株用錫箔紙包裹，放置于烘箱中105 ℃烘48 h以上，至質(zhì)量不再變化后測(cè)量該恒重，從而計(jì)算出各個(gè)組別的干重。

1.6 葉綠素含量的檢測(cè)

待1～2周植株發(fā)病后，將每個(gè)處理組植物的第4片真葉混合形成一個(gè)生物重復(fù)，采用80%丙酮浸提比色法[5]提取葉綠素，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定色素提取液在波長(zhǎng)663 nm和645 nm處的吸光度，以80%丙酮作為空白對(duì)照調(diào)透光率100%，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。將測(cè)得的吸光度(D)代入公式(1)、(2)、(3)中，計(jì)算葉綠素a、b濃度與總濃度，再將葉綠素a、b濃度與總濃度代入公式(4)中求出所測(cè)材料單位的葉綠素a、b含量與總含量。

葉綠素a=12.7×D663-2.69×D645；

(1)

葉綠素b=22.9×D645-4.68×D663；

(2)

葉綠素a+b=20.21×D645+8.02×D663；

(3)

葉綠素總含量=(葉綠素a+b)×V÷1 000×m×n。

(4)

式中:V為提取液總體積；m為取樣鮮重;n為稀釋倍數(shù)。

1.7 CGMMV外殼蛋白基因的表達(dá)

通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)植株CGMMV基因表達(dá)，以判斷植株是否被病毒侵染。接種后7 d采集葉片樣本，將每個(gè)處理植物的葉子混合形成一個(gè)生物重復(fù)。利用TRIzol法提取西瓜葉片的總RNA，電泳檢測(cè)RNA的完整度，以提取的總RNA為模板合成cDNA，以合成的cDNA作為RT-PCR的模板，使用CGMMV外殼蛋白特異性引物[6](CGMMV-F/R：5′-ATGGCTTACAATCCG ATCACAC-3′/5′-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC-3′)進(jìn)行RT-PCR。

1.8 CGMMV病毒粒子的ACP-ELISA檢測(cè)

通過(guò)ACP-ELISA方法定量檢測(cè)CGMMV病毒的含量。具體方法是先將植物組織按1∶20比例(m/V，g·mL-1)在1×PBS中研磨成勻漿，離心后將上清加于96孔ELISA微孔板上(每孔100 μL)，4 ℃過(guò)夜包被，每個(gè)處理3次重復(fù)。參考何宛芹[7]的方法進(jìn)行ACP-ELISA，略有改動(dòng)，使用CGMMV一抗(1∶5 000倍稀釋)，在顯色時(shí)使用AP顯色底物溶液；顯色完成終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀(Bio-Rad 680)進(jìn)行光密度吸光值D405的測(cè)量，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用鄧肯式新復(fù)極差法(DMRT)進(jìn)行分析和顯著性測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米顆粒處理對(duì)西瓜生物量的影響

接種1～2周后，西瓜植株出現(xiàn)CGMMV癥狀，但處理組和對(duì)照組病害癥狀差異不明顯；長(zhǎng)勢(shì)觀察發(fā)現(xiàn)3種納米顆粒處理的植株株高與對(duì)照組植株相比無(wú)顯著差異；ZnO NPs處理植株與對(duì)照植株的生物量相比也無(wú)明顯差異，但TiO2NPs和SiO2NPs處理的西瓜植株長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于對(duì)照(圖1)，說(shuō)明體外噴施這2種商品化納米顆?？梢栽黾痈腥綜GMMV西瓜植株的總鮮重和總干重，2個(gè)處理組別的總鮮重與總干重均顯著高于對(duì)照組(表1)。

圖1 噴施納米顆粒對(duì)感染CGMMV西瓜植株長(zhǎng)勢(shì)和葉片的影響

2.2 納米顆粒處理對(duì)葉綠素含量的影響

CGMMV侵染的一個(gè)典型癥狀就是植株葉片褪綠黃化，因此，葉綠素含量的檢測(cè)不僅可以評(píng)判植株長(zhǎng)勢(shì)，也能在一定程度上反映植株感染CGMMV的發(fā)病程度。將每個(gè)處理植物的第4片真葉混合形成一個(gè)生物重復(fù)，采用80%丙酮浸提比色法檢測(cè)葉綠素含量。結(jié)果表明，在感染CGMMV的情況下，體外噴施商品化ZnO NPs的西瓜植株葉綠素含量與對(duì)照植株無(wú)明顯差異；但噴施商品化TiO2NPs、SiO2NPs的西瓜植株葉綠素含量顯著高于對(duì)照植株(圖1、表1)。

表1 不同納米顆粒處理對(duì)感染CGMMV西瓜植株生物量、葉綠素含量和帶病毒量的影響

2.3 納米顆粒處理對(duì)外殼蛋白基因表達(dá)的影響

凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)利用TRIzol法提取的RNA較為完整(圖2中A)，通過(guò)RT-PCR在各個(gè)納米顆粒處理和對(duì)照組均擴(kuò)增到了CGMMV特定的 486 bp 片段，從一定程度上證實(shí)了所有測(cè)試的西瓜植株均被CGMMV成功感染(圖2中B)。

A—總RNA；B—RT-PCR圖2 納米顆粒處理感染CGMMV西瓜植株的外殼蛋白表達(dá)

2.4 納米顆粒處理對(duì)CGMMV含量的影響

ACP-ELISA中測(cè)得的D405值表示植株中含有的CGMMV外殼蛋白與CGMMV特異性抗體的結(jié)合量，即可以表征各個(gè)處理組CGMMV病毒外殼蛋白的積累量。結(jié)果(表1)顯示，與對(duì)照組相比，TiO2NPs、SiO2NPs和ZnO NPs預(yù)處理的西瓜植株CGMMV外殼蛋白積累量均顯著低于對(duì)照，表明這3種納米顆粒對(duì)CGMMV繁殖有一定的抑制作用。

3 小結(jié)

本研究測(cè)定了在西瓜葉面噴施ZnO NPs、TiO2NPs和SiO2NPs這3種商品化納米顆粒對(duì)系統(tǒng)感染CGMMV西瓜植株的生物量、葉綠素含量以及病毒積累量的影響，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)TiO2NPs和SiO2NPs處理的植株在感染CGMMV后的長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于無(wú)菌水對(duì)照植株，具體表現(xiàn)為植株總鮮重和總干重比對(duì)照組顯著增加，但各納米顆粒處理組與對(duì)照組的株高無(wú)明顯差異。此外，體外噴施TiO2NPs和SiO2NPs的感染CGMMV西瓜植株的葉綠素含量顯著高于對(duì)照植株，而ZnO NPs處理植株的生物量、葉綠素含量與對(duì)照植株無(wú)顯著差異。研究還發(fā)現(xiàn)，連續(xù)3 d葉面噴施3種納米顆?？娠@著降低CGMMV外殼蛋白積累量，初步推測(cè)可能是通過(guò)破壞CGMMV的方式減少了病毒的復(fù)制增殖。TiO2NPs和SiO2NPs增加西瓜植株生物量與葉綠素含量或許是因?yàn)樗麄冋T導(dǎo)了植物的抗病能力，從而部分抵消植株因病毒侵染所帶來(lái)的負(fù)面影響。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，納米顆粒的使用已被報(bào)道可以減少病原體的數(shù)量、控制病害和雜草以及提高作物的生長(zhǎng)速度[8]，但其僅在一定的濃度內(nèi)對(duì)植物有益，過(guò)高濃度的納米顆粒也可能會(huì)對(duì)作物產(chǎn)生毒性。有研究表明，在300 mg·L-1TiO2NPs劑量水平下玉米的葉片生長(zhǎng)受阻[9]。而本研究使用的納米材料濃度相對(duì)較低，基本上不會(huì)抑制植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。與較大的顆粒相比，納米顆粒具有更高的表面體積比，這不僅增加了納米顆粒的滲透性，還增強(qiáng)了其與組織和細(xì)胞的相互作用，滲入植株的納米顆粒還可能為植物提供生長(zhǎng)有益的微量元素從而起到促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。下一步研究可以著重關(guān)注納米顆粒直接噴施健康植株對(duì)植物長(zhǎng)勢(shì)與病程相關(guān)基因的表達(dá)變化。

CGMMV作為種傳的植物病毒病害，最有效措施是加強(qiáng)植物檢疫，選用無(wú)毒良種，力求將病毒封鎖在種植區(qū)外；一旦發(fā)生防治起來(lái)尤為困難，故生產(chǎn)上應(yīng)以預(yù)防為主。本研究結(jié)果表明，葉面噴施商品化納米TiO2和SiO2顆粒在病毒侵染初期可以對(duì)植物起到一定的保護(hù)作用，對(duì)病毒的復(fù)制增殖也有一定抑制作用。相對(duì)于一些化學(xué)藥劑見(jiàn)效快，但治標(biāo)不治本，且可能對(duì)植物產(chǎn)生藥害或抗藥性等副作用，納米顆粒往往具有對(duì)環(huán)境友好的殺菌殺毒特性，在病原細(xì)菌與真菌防控領(lǐng)域已初有成效，本研究表明，納米顆?？赡苤苯幼饔糜贑GMMV或間接誘導(dǎo)植物抗性，將來(lái)有望為CGMMV等植物病毒的防控提供一種有前景的替代方案。