劉建峰， 余瑤， 朱巧玲， 凌丹燕， 胡海濤， 郭威， 路梅*

(1.武義縣俞源鄉(xiāng)人民政府， 浙江 金華 321200； 2.浙江師范大學 化學與生命科學學院， 浙江 金華 321004)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)又名金線蘭、花葉開唇蘭，為蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬(Anoectochilus)多年生草本植物，喜涼爽、潮濕、沒有陽光直射的環(huán)境，主產(chǎn)于我國浙江、福建、廣東、臺灣等地的丘陵地帶和山區(qū)。金線蓮是我國名貴中藥材，整個植株都可以入藥，俗稱“金草”“藥王”，具有清熱涼血、除濕解毒等藥效[1-2]。此外，金線蓮的葉片卵圓形或卵形，上面暗紫色或黑紫色，具金紅色帶有絹絲光澤的美麗網(wǎng)脈，具有很好的觀賞價值。

近幾年，因為較高的藥用和觀賞價值，野生金線蓮的產(chǎn)量已無法滿足市場的需求，人工栽培生產(chǎn)規(guī)模逐漸增大。在金線蓮的栽培過程中，因潮濕的環(huán)境，極易出現(xiàn)多種病蟲害，造成重要的經(jīng)濟損失。軟腐病就是金線蓮苗期的主要病害之一，具有發(fā)病快、傳染性高、危害性強等特點。一直以來，細菌性軟腐歐文氏菌黑莖病變種Eruiniacarotovoravar.atroseptica(Hellmers et Dowson)Dye[3]被認為是引起金線蓮軟腐病的主要致病菌，其可以通過氣孔或昆蟲、雨水、農(nóng)具等造成的傷口侵入并感染整個植株。本實驗室在對引起金華地區(qū)金線蓮軟腐病的致病菌分離鑒定中，發(fā)現(xiàn)菌株J-4能侵染葉片，引發(fā)活體金線蓮軟腐癥狀；經(jīng)形態(tài)學和分子生物學相結(jié)合的方法，該菌株被鑒定為方中達迪基氏菌(Dickeyafangzhongdai)，并對其生理生化特性進行了分析，為生產(chǎn)中病害的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

菌株J-4分離自浙江省金華市金線蓮苗木種植基地的軟腐病株。

1.2 病原菌的分離和純化

挑選具有典型軟腐病癥狀的植株材料，先用清水沖洗表面，然后從葉片病健交界處剪取大小0.5 cm×0.5 cm病樣材料，置于1% NaClO溶液中消毒10 min；之后用無菌水漂洗3次，用滅菌濾紙吸干表面水分后放入EP管中；向管中加入500 μL無菌水，用無菌研磨棒將組織輕輕搗碎，靜置15 min；用無菌水將研磨液稀釋1 000倍，用接種環(huán)在營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)。28 ℃培養(yǎng)3 d后，觀察平板菌落生長情況。將單菌落接種純化培養(yǎng)，純菌接種于4 ℃斜面保存。

1.3 病原菌的致病性檢測

參照《植病研究方法》(第三版)[4]，選取組培瓶中的圓葉金線蓮幼苗用于試驗。供試菌株接種于NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)過夜。次日，用針刺接種法接種，菌液濃度為3×108mL-1。以NB培養(yǎng)基為空白對照，重復3次，每組6～8片葉。處理后的金線蓮苗28 ℃保濕培養(yǎng)。觀察病害的發(fā)生情況，選取發(fā)病癥狀較典型的材料，進行病原菌的再分離鑒定。

1.4 生理生化特性分析

在NA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原菌48 h后，觀察病原菌的菌落形態(tài)和光學顯微下菌體的形狀特征及其大小。

參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)[5]和《植物病原細菌鑒定試驗指導》(第三版)[6]對J-4進行革蘭氏染色、乙酰甲基甲醇試驗(V.P.試驗)、甲基紅(M.R.)試驗、淀粉水解試驗，以及明膠液化、吲哚產(chǎn)生、H2S產(chǎn)生、唯一碳源等細菌純培養(yǎng)鑒定等常規(guī)實驗，并進行生理生化特性研究。

1.5 分子生物學分析

1.5.1 DNA提取

挑取NA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)的單菌落置于150 mL NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h，得到菌懸液。然后按照TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒方法操作，進行DNA的提取。提取后的DNA置于冰箱-20 ℃保存，備用。

1.5.2 16S rDNA序列分析

PCR擴增采用細菌通用引物27 F(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′)和1492 R(5′TACGGYTACCTTGTTACGACTT3′)，反應體系為25 μL，以NB培養(yǎng)基為模板做陰性對照。反應體系包括2.5 μL 10×PCR buffer，1.0 μL 2.5 mmol·L-1dNTP，0.5 μL Taq DNA聚合酶，1.0 μL 10 μmol·L-1上游引物與下游引物，1.0 μL菌液，18 μL ddH2O。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用美國UVP公司的GelDoc-IT凝膠成像儀觀察并拍照。PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中進行BLAST同源性比對分析，并采用軟件MEGA 7.0的Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定病原菌J-4的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌致病性檢測結(jié)果

金線蓮細菌性軟腐病發(fā)病突然，擴展迅速，危害嚴重。先是苗床植株零星發(fā)病，初始病原從葉片或莖部侵入，形成水浸狀褐色不規(guī)則病斑；隨后病原菌通過維管束迅速傳播，2～3 d整個植株呈現(xiàn)軟腐狀態(tài)；并且通過自然接觸侵染周邊健康植株。7～10 d的時間，病害擴展到整個苗床，近80%的苗木出現(xiàn)倒伏軟腐現(xiàn)象(圖1中A)。

A—田間自然發(fā)病；B—J-4菌株接種24 h。圖1 金線蓮細菌性軟腐病癥狀

從采集的病樣中共分離純化得到11個單菌落，根據(jù)菌落特征(顏色、質(zhì)地等)分成3類，分別標記為J1-6、X1-3、L1-2。經(jīng)回接健康圓葉幼苗發(fā)現(xiàn)，分離菌株J-4接種活體金線蓮，可以引起和自然發(fā)病相同癥狀的細菌性軟腐病。接種J-4菌株8 h后，葉片接種部位呈現(xiàn)明顯水漬化，并迅速擴散；接種24 h后，接種葉近全葉褐色水漬化，水漬化經(jīng)由葉柄開始向莖部擴散(圖1中B)。采集圓葉發(fā)病葉片，進行病原菌的再分離純化，得到和J-4具有同樣培養(yǎng)性狀的菌株。因此，依照植物病原菌分離鑒定的柯赫氏法則[4]判斷，菌株J-4是引起金華地區(qū)金線蓮軟腐病的主要病原菌。

2.2 病原菌的形態(tài)特征

菌株J-4在NA固體培養(yǎng)基中28 ℃過夜培養(yǎng)后，菌落淺乳黃色、近圓形、有著光滑的表面，相對于菌落四周而言中央稍凸起，黏性，水浸狀(圖2)。菌體短桿狀，具有運動性，一般大小為2.0 μm×0.6 μm。

圖2 菌株J-4的形態(tài)特征

2.3 生理生化反應

菌株J-4革蘭氏染色為陰性。生理生化實驗結(jié)果表明，菌株J-4具備在39 ℃以及含有7% NaCl培養(yǎng)基中生長的能力。J-4不能水解淀粉、不能分解半胱氨酸產(chǎn)生H2S，在甲基紅試驗和V.P.試驗中顯示陰性；可液化明膠、分解蛋白胨生成吲哚；可以利用蔗糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、(+)蜜二糖、(+)棉子糖、D-甘露醇、肌醇作為碳源，不能利用D-麥芽糖、古老糖、D-海藻糖、D-塔格糖、D-纖維二糖、α-葡萄糖、D-山梨醇、側(cè)金盞花醇等作為碳源(表1)。

2.4 同源性分析

以菌株J-4的基因組DNA為模板，利用細菌通用引物27F/1492R進行16S rDNA序列PCR擴增和測序，得到片段大小為1 415 bp的序列(GenBank 登錄號為OM900031)。在GenBank中進行J-4菌株的16S rDNA序列同源性比對分析，該序列與Dickeyafangzhongdai(OK668082.1、MK400217.2、NR_151914)等菌株序列的同源性高達99%以上。以KlebsiellapneumoniaeEBT03為外群，用軟件MEGA 7.0構(gòu)建J-4菌株與其相近種屬細菌的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹。圖3顯示，溶果膠菌科的迪基氏菌屬(Dickeya)與果膠桿菌屬(Pectobacterium)分別聚在兩個分支上；迪基氏菌屬中的5個種(D.fangzhongdai、D.dadantii、D.dianthicola、D.solani、D.zeae)又各自聚在一個分支上，J-4與D.fangzhongdai聚在一起。因此，結(jié)合其形態(tài)和生理生化性質(zhì)，J-4可鑒定為腸桿菌目(Enterobacterales)溶果膠菌科(Pectobacteriaceae)迪基氏菌屬(Dickeya)中的方中達迪基氏菌(D.fangzhongdai)。

表1 菌株J-4形態(tài)和生理生化特征

圖3 基于16S rDNA序列同源性的病原菌J-4系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

細菌性軟腐病病原菌主要通過分泌果膠酶等胞外酶降解寄主植物細胞壁，導致病組織呈軟腐癥狀，病害迅速擴展，成片植物壞死。根據(jù)國內(nèi)外對軟腐病的研究發(fā)現(xiàn)，迪基氏菌屬中的多種細菌，如菊迪基氏菌(D.chrysanthemi)[7]、玉米迪基氏菌(D．Zeae)[8]、茄迪基氏菌(D．solani)[9-10]和方中達迪基氏菌(D.fangzhongdai)[11]可分別侵染春羽、水稻、土豆、香蕉等多種單子葉或雙子葉植物，引起細菌性軟腐病，造成嚴重的經(jīng)濟損失。

本文進行了浙江省金華市金線蓮細菌性軟腐病病原菌的分離鑒定，利用傳統(tǒng)細菌分類特征和分子生物學相結(jié)合的方法，最終確定病原菌為方中達迪基氏菌(D.fangzhongdai)J-4。D.fangzhongdai是迪基氏菌屬中近幾年才命名的一個新種，其標準菌株D.fangzhongdaiJS5T于2016年分離自患有樹干潰瘍病的中國砂梨(Pyruspyrifolia)[12]。D.FangzhongdaiJS5T為革蘭氏陰性菌，菌體桿狀、具游動性；39 ℃下可以生長，可分解代謝D-(-)-阿拉伯糖、(+)蜜二糖、(+)棉子糖、甘露醇和肌醇，但不能代謝5-酮D-葡萄糖酸酯和水解酪蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，J-4菌株具有和標準菌株JS5T同樣的生理生化特征。近幾年的國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，D.fangzhongdai不僅可以引起梨樹的潰瘍病，還可以引起香蕉[11]、蘿卜[13]、半夏[14-15]、蝴蝶蘭[16]等植物的軟腐病，已成為迪基氏菌屬中非常重要的一類病原細菌。

金線蓮喜歡涼爽潮濕的環(huán)境，如海拔為50～1 600 m的常綠闊葉林下或山谷中，不僅生長于中國，還分布于日本、泰國、印度、不丹等國家[1]。目前，國內(nèi)外對金線蓮的研究多集中于人工栽培技術[1-2]、藥物篩選和病害防治[3,17]等方面，對病害病原菌的分離鑒定研究很少。已報道的經(jīng)分離鑒定過的病原菌主要有引起軟腐病的歐文氏菌黑莖病變種(E.carotovoravar.atroseptica)[3]和引起莖腐病的尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchl)[18]等。本文首次對浙江金線蓮細菌性軟腐病病原進行分離鑒定，為病害的有效防治將提供有用參考。