郝芳敏， 丁偉紅， 馬二磊， 嚴蕾艷， 黃蕓萍， 王毓洪， 臧全宇

(寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院 寧波瓜菜育種重點實驗室， 浙江 寧波 315040)

細菌性果斑病(bacterial fruit blotch，BFB)由西瓜噬酸菌Acidovoraxcitrulli引起[1]，是在全球范圍內(nèi)危害西甜瓜產(chǎn)業(yè)的一種毀滅性細菌病害。該病害在西甜瓜整個生育期都能發(fā)生，西甜瓜的葉片、果實和幼莖都會受害，病害發(fā)生初期表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)水漬狀斑點，隨后病斑擴大變?yōu)楹稚珘乃啦“撸詈笾抡麄€葉片枯萎；果實受侵染會出現(xiàn)水浸狀凹陷斑點，嚴重時果實出現(xiàn)腐爛并致使種子帶菌[2]，對西甜瓜產(chǎn)業(yè)造成了極為嚴重的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失。

細菌性果斑病是典型的種傳細菌性病害[3]，是我國的植物檢疫性病害，防治細菌性果斑病最有效的方法是生產(chǎn)和使用無菌種子，使用健康種子可以有效的降低果斑病的暴發(fā)風險[4]。因此，建立一套快速、簡便、靈敏的檢測方法是當務(wù)之急。當前國內(nèi)外對于細菌性果斑病的檢測方法包括免疫富集PCR[5-6]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)[7]、免疫磁性分離PCR[8-9]、免疫凝聚試紙條[10]、實時熒光定量PCR[11]等方法。然而以上方法，均不能區(qū)分檢測到的細菌性果斑病菌是活菌還是死菌，容易出現(xiàn)假陽性，因此，急需建立一種快速有效檢測樣品中細菌性果斑病菌活菌的方法。疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)是一種特異性的活性染料，在強光下與死細胞DNA進行不可逆的共價結(jié)合，阻礙死細胞DNA進行PCR擴增[12]。使用PMA對菌懸浮液進行預(yù)處理后提取該DNA，結(jié)合qPCR進行擴增。qPCR擴增后的Ct值為活細胞的Ct值，排除了死細胞的干擾[13]。

本研究以細菌性果斑病菌的定量檢測為出發(fā)點，利用PMA對活/死細胞具有選擇性的特性，結(jié)合熒光定量PCR進行細菌性果斑病菌的檢測。對PMA作用于細菌性果斑病菌的最佳濃度及曝光時間進行摸索，然后對田間的西甜瓜種子進行細菌性果斑病菌的活菌檢測，旨在建立一種快速、靈敏、特異性強且可定量檢測細菌性果斑病菌的方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試Acidovoraxcitrulli菌株pslbtw36由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所趙廷昌研究員饋贈，供試甜瓜種子材料為田間隨機收集的西州蜜25種子。

供試菌株在LA培養(yǎng)基上活化，置于28 ℃培養(yǎng)箱24 h，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃搖培12 h。

1.2 實時熒光定量PCR標準曲線繪制

本研究采用探針法熒光定量PCR進行檢測[14]，上游引物A.citrulli-FP：5′-CTGATAATCCTCGGC TCAACAA-3′；下游引物A.citrulli-RP：5′-TGA GCGCATTTCTGACGAG-3′；探針A.citrulli-P：FAM-AAGAAATACGCCCTCGCCAATCTCC-BHQ1[14]，對菌株pslbtw36的基因組DNA進行熒光定量PCR檢測，擴增片段大小為121 bp，符合實時熒光定量PCR的擴增條件。將A.citrulli菌株pslbtw36基因組DNA按10倍梯度依次稀釋至30 ng·μL-1、3 ng·μL-1、300 pg·μL-1、30 pg·μL-1、3 pg·μL-1、300 fg·μL-1、30 fg·μL-1和3 fg·μL-1，直接取稀釋后的1 μL基因組DNA進行熒光定量PCR擴增，每個濃度3次重復(fù)，PCR反應(yīng)體系：1 μL DNA模板、0.4 μL正向引物A.citrulli-FP(20 μmol·L-1)、0.4 μL反向引物A.citrulli-RP(20 μmol·L-1)、10 μL 2×TransStart? Tip Green qPCR SuperMix(全式金，北京)、0.4 μL Passive Reference Dye Ⅱ，用ddH2O定容至20 μL，在PCR儀中進行擴增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，50 ℃退火30 s，擴增40個循環(huán)。熒光定量PCR擴增完成后，根據(jù)Ct值與其相對應(yīng)的基因組DNA濃度對數(shù)值構(gòu)建線性回歸方程，以基因組DNA濃度的對數(shù)值為橫坐標，Ct值為縱坐標，建立標準曲線。

1.3 PMA-qPCR樣品前處理

PMA的配制：將PMA在黑暗條件下溶于二甲基亞砜(DMSO)溶液，配制成1 mg·mL-1的母液，用錫箔紙包裹置于-20 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

細菌性果斑病菌活菌和死菌的制備：將新鮮A.citrulli菌懸液濃度調(diào)至1×107mL-1，并將菌懸液平均分為2份，一份靜置備用，另一份置于100 ℃水浴10 min進行熱致死，并取100 μL熱致死的菌懸液涂布于LA固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱48 h，驗證熱致死效果后備用。

PMA處理：將PMA在避光條件下加入菌懸液中，輕微振蕩混勻，在黑暗中靜置10 min，再將菌液取出開蓋置于冰上，距離燈管15 cm，650 W鹵鎢燈持續(xù)曝光10 min使PMA光解。將處理后的菌懸液置于100 ℃水浴鍋加熱10 min以釋放DNA，再作為模板進行熒光定量PCR檢測。

1.4 病原菌活細胞對PMA染料的耐受能力測定

將PMA避光加入到含有500 μL濃度為1×107mL-1細菌性果斑病菌A.citrulli活細胞菌懸液的1.5 mL離心管中，使PMA的終濃度分別為0、0.5、1、3、6、9、12和24 μg·mL-1，并按照1.3做PMA的靜置、曝光處理，進行熒光定量PCR檢測。

1.5 實時熒光定量PCR反應(yīng)中PMA抑制死細胞的最低濃度測定

將PMA避光加入到含有500 μL濃度為1×107mL-1的細菌性果斑病菌A.citrulli死細胞菌懸液的1.5 mL離心管中，使PMA的終濃度分別為0、0.5、1、3、6、9、12和24 μg·mL-1，并按照1.3做PMA的靜置、曝光處理，進行熒光定量PCR檢測。

1.6 不同曝光時間對PMA處理效果的影響

PMA染料的作用原理是在高強度的可見光曝光處理后，可與死細胞DNA進行不可逆的共價結(jié)合，阻礙死細胞DNA進行PCR擴增。為研究不同曝光時間對PMA處理效果的影響，將PMA分別避光加入到含有500 μL濃度為1×107mL-1細菌性果斑病菌A.citrulli死細胞和活細胞菌懸液的1.5 mL離心管中，使PMA的終濃度為9 μg·mL-1(經(jīng)過篩選出的最適濃度)，按照1.3節(jié)做PMA的靜置、曝光處理，分別將曝光時間設(shè)為0、1、3、5、8、10、15 min，并將處理后的菌懸液進行熒光定量PCR檢測。

1.7 死、活細胞混合體系的PMA-qPCR檢測

為驗證PMA-qPCR具有區(qū)分活、死細胞的能力，將PMA-qPCR用于檢測不同比例的死、活細胞混合液。將新鮮的細菌性果斑病菌A.citrulli配制成濃度為1×106mL-1的菌懸液，并于100 ℃水浴10 min進行熱致死，并分別加入不同濃度的新鮮活體菌懸液，使活細胞濃度占菌懸液總濃度的不同比例?；?、死細胞菌懸液按照1×105∶1×105、1×104∶1×105、1×103∶1×105、1×102∶1×105、1×101∶1×105、1×100∶1×105、1×10-1∶1×105、1×10-2∶1×105等體積混合均勻后，分別用傳統(tǒng)的熒光定量PCR和PMA-qPCR檢測。PMA-qPCR需要在混合后的菌懸液中避光加入PMA，使PMA的終濃度為9 μg·mL-1(經(jīng)過篩選出的最適濃度)，按照1.3節(jié)做PMA的靜置、曝光處理，并進行熒光定量PCR檢測。

1.8 PMA-qPCR檢測的假陽性驗證

將新鮮的細菌性果斑病菌A.citrulli配制成濃度為1×104、1×103、1×102、1×101、1×100、1×10-1mL-1和1×10-2mL-1的菌懸液，在100 ℃水浴10 min進行熱致死，分別采用傳統(tǒng)熒光定量PCR、PMA-qPCR和平板培養(yǎng)計數(shù)法進行檢測。PMA-qPCR需要在菌懸液中避光加入PMA，使PMA的終濃度為9 μg·mL-1(經(jīng)過篩選出的最適濃度)，按照1.3節(jié)做PMA的靜置、曝光處理，并將處理后的菌懸液進行熒光定量PCR檢測。

1.9 自然感染甜瓜種子的PMA-qPCR檢測

為評估PMA-qPCR法在田間自然感染的甜瓜種子的檢測效果，從田間收集不同材料的甜瓜種子進行檢測。首先每份材料取300 g的種子用pH值7.0的0.01 mol·L-1的磷酸緩沖液浸沒，室溫振蕩4 h(100 r·min-1)，再4 ℃浸泡過夜，再將浸泡液1 000 r·min-1離心1 min，去沉淀，上清液10 000 r·min-1離心10 min，棄上清，取沉淀，用無菌水進行懸浮，制成需要體積的懸浮液。取上清置于新的1.5 mL離心管中，分為a、b、c 3份。a組不做處理，直接進行qPCR檢測，b組用終濃度為9 μg·mL-1的PMA處理，并進行靜置、曝光，再進行qPCR檢測，c組置于100 ℃水浴10 min進行熱致死處理，加入終濃度為9 μg·mL-1的PMA靜置、曝光處理，之后進行qPCR檢測。所有樣品均要進行細菌性果斑病的選擇培養(yǎng)基EBBA平板分離培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 實時熒光定量PCR的靈敏度檢測及標準曲線繪制

將細菌性果斑病菌A.citrulli基因組DNA濃度調(diào)至30 ng·μL-1，進行10倍梯度稀釋，使?jié)舛确秶来螢?0 ng·μL-1、3 ng·μL-1、300 pg·μL-1、30 pg·μL-1、3 pg·μL-1、300 fg·μL-1、30 fg·μL-1和3 fg·μL-1。分別取1 μL不同濃度的基因組DNA作為模板進行熒光定量PCR擴增。結(jié)果表明，當DNA濃度>300 fg·μL-1時，熒光定量PCR擴增Ct值均小于35，當濃度<300 fg·μL-1時，Ct值大于35，為無效值(圖1)。所以認為熒光定量PCR的檢測下限為300 fg·μL-1，以A.citrulli基因組DNA濃度的對數(shù)值為橫坐標，Ct值為縱坐標，建立回歸方程，回歸方程為y=-3.255 9x+44.614，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9，線性關(guān)系良好，因此，在后期研究中可根據(jù)熒光定量PCR的Ct值來計算檢測樣品對應(yīng)的基因組DNA濃度。

圖1 熒光定量PCR擴增Acidovorax citrulli基因組DNA的標準曲線

2.2 抑制死細胞qPCR擴增的PMA最適濃度優(yōu)化

根據(jù)PMA阻礙死細胞DNA進行PCR擴增的原理，進行PMA處理死細胞DNA的濃度篩選，既可抑制死細胞DNA的擴增，又不會影響活細胞DNA的擴增。首先將細菌性果斑病菌A.citrulli菌懸液濃度調(diào)至1×107mL-1，一組做熱致死處理，另一組不做處理，分別加入不同濃度的PMA預(yù)處理，并進行qPCR擴增。結(jié)果表明，當PMA終濃度≤12 μg·mL-1時，A.citrulli活細胞DNA的qPCR擴增Ct值與不加PMA初始對照之間無顯著差異(圖2)；當PMA終濃度≥9 μg·mL-1時，A.citrulli死細胞DNA的qPCR擴增Ct值不再顯著升高(圖3)。因此，當PMA終濃度為9 μg·mL-1時，既能完全抑制A.citrulli菌懸液死細胞DNA擴增，又對活細胞DNA擴增無顯著影響，表明PMA濃度為9 μg·mL-1時，可作為PMA-qPCR檢測區(qū)分A.citrulli的純培養(yǎng)死、活細胞的最適濃度。

柱上無相同字母者表示差異明顯(P<0.05)，圖3～5同。圖2 不同濃度PMA對細菌性果斑病菌活細胞DNA熒光定量PCR擴增的影響

圖3 不同濃度PMA對細菌性果斑病菌死細胞DNA熒光定量PCR擴增的影響

2.3 PMA最佳曝光時間優(yōu)化

根據(jù)PMA在強光下與死細胞DNA進行不可逆的共價結(jié)合，阻礙死細胞DNA進行PCR擴增的原理，通過設(shè)置不同的曝光時間來篩選PMA預(yù)處理最佳的曝光時間。結(jié)果表明，當曝光時間從1 min逐漸延長至15 min時，PMA對活細胞DNA的qPCR擴增均無影響(圖4)；而PMA對死細胞處理中，當曝光時間為8 min時，可完全抑制死細胞DNA的qPCR擴增，Ct值不再發(fā)生變化(圖5)。因此，本研究中PMA染料的曝光最佳時間為8 min，PMA的最適濃度為9 μg·mL-1，可完全抑制1×107mL-1細菌性果斑病菌A.citrulli菌懸液死細胞DNA的擴增，且對活細胞DNA的擴增無顯著影響。

圖4 不同PMA曝光時間對細菌性果斑病菌活細胞DNA熒光定量PCR擴增的影響

圖5 不同PMA曝光時間對細菌性果斑病菌死細胞DNA熒光定量PCR擴增的影響

2.4 混合體系中PMA-qPCR對活細胞的選擇性擴增

將細菌性果斑病菌A.citrulli死細胞(1×105mL-1)與不同濃度活細胞等體積混合均勻，加入終濃度為9 μg·mL-1的PMA處理后進行qPCR擴增。隨著活細胞比例下降，Ct值呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，檢測下限可達到1×103mL-1活細胞(圖6)。未經(jīng)PMA處理的死、活細胞混合體系直接進行qPCR擴增，無論活細胞比例如何變化，其qPCR擴增的Ct值始終維持在一個穩(wěn)定水平，無顯著變化。因此，PMA-qPCR可以有效區(qū)分細菌性果斑病菌A.citrulli菌懸液中的死、活細胞，能夠選擇性的對活細胞DNA進行擴增，而傳統(tǒng)的qPCR無法區(qū)分死、活細胞，其檢測結(jié)果會對體系中的活細胞數(shù)目造成一定程度的高估。在活菌為2.0×101～2.0×106，其菌數(shù)與Ct值呈線性相關(guān)，回歸方程為y=-2.706 4x+43.404，相關(guān)系數(shù)為R2=0.982 7(圖7)。因此，可根據(jù)熒光定量PCR的Ct值來快速定量測定樣品對應(yīng)的活菌數(shù)。

柱上無相同大寫字母表示未加PMA處理間差異極顯著(P<0.01)；柱上無相同小寫字母表示加PMA處理間差異顯著(P<0.05)。圖6 活、死細胞混合體系中PMA-qPCR的選擇性擴增

圖7 PMA-qPCR擴增A. citrulli活菌細胞數(shù)的標準曲線

2.5 PMA-qPCR檢測的假陽性驗證

為驗證PMA-qPCR檢測方法對細菌性果斑病菌A.citrulli死細胞的檢測是否會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，將死細胞菌懸液設(shè)置8組不同濃度，分別進行傳統(tǒng)熒光定量PCR、PMA-qPCR和平板培養(yǎng)計數(shù)法檢測。結(jié)果表明，當用PMA-qPCR和平板培養(yǎng)計數(shù)法檢測8組滅活死細胞時，檢測結(jié)果均為陰性；而用傳統(tǒng)的熒光定量PCR檢測時，均能夠檢測到細菌性果斑病菌的存在(表1)。因此，在細菌性果斑病菌A.citrulli的死細胞DNA的檢測中，傳統(tǒng)的熒光定量PCR不能有效區(qū)分死、活細胞，而PMA-qPCR法僅能擴增活細胞的DNA，未出現(xiàn)假陽性擴增結(jié)果；且使用平板培養(yǎng)計數(shù)法進一步驗證了PMA-qPCR的可靠性。

表1 不同方法對細菌性果斑病菌死細胞檢測效果比較

2.6 田間甜瓜種子的PMA-qPCR檢測

使用PMA-qPCR檢測采集的10份甜瓜種子樣品，結(jié)果表明，待測樣品中有5份可檢測到細菌性果斑病菌A.citrulli，其Ct在19.46～33.64；將5份樣品活菌濃度換算為所對應(yīng)的基因組DNA濃度，為0.023～91.2 ng·μL-1，活菌個數(shù)在1.1～3.6 mL-1。采用平板分離培養(yǎng)法檢測這5份帶有果斑病菌活菌的樣品，均能分離到A.citrulli，驗證了PMA-qPCR檢測的準確性。同時，用傳統(tǒng)qPCR法可檢測到6份甜瓜種子帶有果斑病菌A.citrulli。這10份樣品進行熱致死處理，用PMA-qPCR檢測后發(fā)現(xiàn)所有檢測結(jié)果均為陰性(表2)。因此，PMA-qPCR可快速準確地檢測甜瓜種子樣品中果斑病菌的活體狀態(tài)，從而代替平板分離培養(yǎng)法。

表2 田間甜瓜種子樣品的PMA-qPCR檢測

3 討論

瓜類細菌性果斑病是世界性檢疫性細菌病害，在全世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，目前已成為影響我國瓜類生產(chǎn)的主要病害之一，具有發(fā)病迅速、傳播速度快、防病難等特點，可造成我國瓜類生產(chǎn)上巨大的經(jīng)濟損失，一旦發(fā)病將難以控制，該病原菌可通過傷口和氣孔侵染瓜類子葉和果實[15]，可通過種子攜帶傳播，是一種種傳病害，因此，需在種子源頭上進行檢測，以減少因種傳造成的損失。

近年來，PMA-qPCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種細菌的活死菌的鑒別檢測，肖妍等[16]建立的PMA-qPCR技術(shù)能有效地用于陜西獼猴桃潰瘍菌的活死菌檢測，王帥等[17]建立了一種適于青枯菌不同小種菌株活細胞快速檢測的PMA-qPCR方法。Tian等[14]在細菌性果斑病菌A.citrulli建立的PMA-qPCR活菌檢測技術(shù)，確立了PMA終濃度為3 μg mL-1曝光時間為5 min的PMA體系，能有效抑制1.0×106mL-1滅活死菌的擴增，對活菌的擴增沒有影響，檢測活菌的閾值為1.0×103mL-1。本試驗以細菌性果斑病菌A.citrulli為研究對象，通過優(yōu)化PMA處理條件，實現(xiàn)檢測浙江地區(qū)細菌性果斑病菌A.citrulli活菌的目的。結(jié)果表明，PMA終濃度為9 μg·mL-1，最佳曝光時間為8 min的PMA預(yù)處理體系，能有效抑制1.0×107mL-1滅活死菌的擴增，對活菌的擴增沒有影響，相較于Tian等[14]的研究，增加了10倍死菌的檢測范圍。當活菌數(shù)在2.0×101～2.0×106mL-1內(nèi)，qPCR反應(yīng)體系中活菌數(shù)與Ct值呈線性相關(guān)(R2=0.982 7)，相較于Tian等[14]的研究，檢測活菌的閾值從1.0×103mL-1下降到2.0×101mL-1，可以更加有效地檢測細菌性果斑病菌的活死菌。

本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范圍內(nèi)有效去除細菌性果斑病死菌的干擾，定量檢測出活菌數(shù)量，研究結(jié)果可為植物細菌性果斑病的流行規(guī)律研究提供新的技術(shù)支撐，為細菌性果斑病活菌檢測提供了科學的參考依據(jù)，并能有效避免PCR檢測實際樣品可能造成的假陽性結(jié)果，為瓜類繁殖材料的帶菌檢測與細菌性果斑病防控效果評價提供可靠的技術(shù)支撐。