夏麗秀，肖 瑞，鄭 莉

(湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院老年病科，武漢 430000)

腦缺血患者在臨床上具有較高的致死率，腦缺血對中老年患者的健康造成嚴(yán)重威脅。再灌注治療是一種能有效緩解腦缺血的技術(shù)，但是突然對腦組織血流量進行改善容易導(dǎo)致患者出現(xiàn)再灌注損傷，即缺血再灌注損傷(I/R)[1-2]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死等病理過程均參與I/R發(fā)展[3]。開展I/R分子機制研究對于開發(fā)更多有效藥物、識別新的生物靶點具有重要意義。

金絲桃苷(Hyp)又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，屬于黃酮醇苷化合物(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)，具有抗炎、利尿、降血糖、保護心腦血管等作用[4]。研究顯示，Hyp能上調(diào)miR-138的表達，保護缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，Hyp通過一氧化氮信號通路減輕缺氧葡萄糖再灌注誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元損傷[6]。然而，Hyp對神經(jīng)細(xì)胞氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)損傷的作用機制仍有待進一步明確。

圖1 Hyp化學(xué)結(jié)構(gòu)式

有研究表明，miR-375上調(diào)可通過抑制SP1，減輕多巴胺能神經(jīng)元的損傷[7]。上調(diào)miR-375被證實參與了毛蕊異黃酮對大鼠腦I/R的保護作用[8]。C-X-C趨化因子配體1(CXCL1)是趨化因子的亞類，具有募集并激活白細(xì)胞的功能，參與多種疾病發(fā)展[9]。皮質(zhì)神經(jīng)元來源的外泌體miR-181c-3p通過下調(diào)缺血性腦損傷大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞CXCL1來抑制神經(jīng)炎癥[10]。miR-429通過抑制CXCL1對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞OGD/R誘導(dǎo)損傷發(fā)揮保護作用[11]。本研究旨在探討Hyp在I/R中的作用，并結(jié)合生物信息學(xué)分析和細(xì)胞實驗探究其在I/R治療中的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Hyp(C21H20O12，相對分子質(zhì)量464.37，純度>98%，中國藥品生物制品檢定所)，小鼠腦神經(jīng)瘤(N2a)細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)專用青鏈霉素混合液、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)超敏發(fā)光液(北京索萊寶科技有限公司)，無糖DMEM、D-葡萄糖溶液(武漢普諾賽生命科技有限公司)，CCK-8試劑盒、雙熒光素酶基因檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，全波長多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器(上海)有限公司]，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，Trizol試劑、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增儀StepOnePlus(美國Abi公司)，第一鏈cDNA合成試劑盒、2×SYBR Green PCR SuperMix(美國Apexbio公司)，引物由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成，抗-CXCL1、抗-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、抗-免疫球蛋白G(英國Abcam公司)，Lipofectamine 3000(美國Thermo Fisher公司)。過表達、敲減質(zhì)粒與miRNA模擬體與抑制劑(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析

從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中獲得I/R相關(guān)芯片表達數(shù)據(jù)(GSE78731)，且對I/R中差異表達的基因進行分析。使用DAVID 3.0在線網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)對基因進行GO富集分析。DisGENET 6.0網(wǎng)站(http://disgenet.org/search)用于檢索I/R風(fēng)險基因。STRING 11.0網(wǎng)站(http://string-db.org/)用于蛋白互作用分析。DIANA TOOLS在線網(wǎng)站(http://snf-515788.vm.okeanos.grnet.gr)用于對miRNA進行Pathway富集分析。StarBase在線網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)、TargetScan在線網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_71/)用于檢索基因的上游靶標(biāo)。

1.2.2臨床樣本

收集2019年8月至2020年6月在本院治療的35例I/R患者血漿，用于miR-375/CXCL1表達檢測。另外收集35例年齡與性別均匹配的健康志愿者血漿作為對照(Control)。所有血液樣品均在液氮中保存?zhèn)溆谩Ｋ袇⑴c者均對本研究知曉并簽署書面知情同意書。

1.2.3體外I/R模型建立

采用神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞N2a建立I/R細(xì)胞模型。OGD/R處理：細(xì)胞在缺氧(5%CO2、95%N2)的無糖培養(yǎng)基中孵育4 h；用含有4.5 g/L葡萄糖和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基替換無糖培養(yǎng)基，在常氧條件下再孵育24 h。對OGD/R處理后的N2a細(xì)胞分別添加10、30、100 μmol/L的Hyp進行處理以確定最佳使用濃度，Control細(xì)胞添加等量的二甲基亞砜(DMSO)。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染

構(gòu)建CXCL1敲減(si-CXCL1)及過表達(OE-CXCL1)質(zhì)粒，分別以si-NC與NC作為對照，將以上質(zhì)粒與miR-375抑制劑(inh-miR-375)及陰性對照(inh-NC)轉(zhuǎn)染至N2a細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過程按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行。

1.2.5CCK-8檢測細(xì)胞活力

N2a細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔5×103個細(xì)胞。分別在培養(yǎng)的0、24、48、72 h向每個培養(yǎng)孔中加入10 μL的CCK-8試劑，再孵育2 h后使用多功能酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值，檢測波長為450 nm。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

收集N2a細(xì)胞，Binding Buffer重懸，每管中加入1×105個細(xì)胞，分別使用5 μL Annexin V-FITC與5 μL 碘化丙啶(PI)進行避光染色，15 min后通過流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.7實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測CXCL1的mRNA表達

采用Trizol試劑提取血漿或N2a細(xì)胞的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。在實時PCR擴增儀StepOnePlus上使用2×SYBR Green PCR SuperMix試劑盒進行qRT-PCR分析。使用2-ΔΔCT法計算mRNA相對表達量，U6作為miR-375的內(nèi)參，GAPDH作為CXCL1的內(nèi)參。

1.2.8Western blotting檢測CXCL1的蛋白表達

采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA試劑盒測定蛋白濃度，行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下使用5%脫脂牛乳封閉1 h。4 ℃下將膜與一抗CXCL1(1∶100)、GAPDH(1∶1 000)過夜孵育。之后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗免疫球蛋白G(1∶2 000)孵育1 h。ECL顯影并借助I-mage J軟件計算蛋白相對灰度值。

1.2.9雙熒光素酶報告實驗驗證miR-375和CXCL1的靶向關(guān)系

合成CXCL1野生型(WT)與突變型(MUT)的3′UTR端片段并克隆到熒光素酶報告載體，使用Lipofectamine 3000將CXCL1-WT、CXCL1-MUT分別與miR-375 mimic或miR-375 NC共轉(zhuǎn)染至N2a細(xì)胞，在37 ℃、含5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)48 h。使用雙熒光素酶檢測試劑盒評估各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Hyp對ODG/R處理的N2a細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與Control細(xì)胞比較，OGD/R細(xì)胞增殖活力被抑制，凋亡增加，而加入Hyp后，細(xì)胞增殖活力有所改善、凋亡減少，且隨Hyp濃度的增加呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖2。因100 μmol/L濃度的Hyp對N2a細(xì)胞的影響最顯著，因此將該濃度處理的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

A：不同細(xì)胞增殖活力；B：不同細(xì)胞凋亡率；**：P<0.01，與Control比較；#：P<0.05，與ODG/R比較；##：P<0.01，與OGD/R比較。

2.2 生物學(xué)分析結(jié)果

GSE78731數(shù)據(jù)集中大腦中動脈閉塞(MCAO)模型大鼠中差異表達的基因，見圖3。對MCAO組中表達上調(diào)的基因進行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，基因被富集在一條炎性通路(GO:0006954～inflammatory response)中。將該通路中富集的基因CCL7、CD8A、SPP1、CCL2、CXCL1、SERPINA3N與I/R發(fā)病風(fēng)險基因進行蛋白互作用分析，發(fā)現(xiàn)CXCL1其他基因具有較強關(guān)聯(lián)。

圖3 GSE78731數(shù)據(jù)集MCAO差異表達基因

2.3 Hyp對OGD/R模型中CXCL1表達水平的影響

與Control比較，I/R患者血漿中CXCL1的表達顯著增強(P<0.05)，見圖4A。與Control比較，OGD/R CXCL1的mRNA和蛋白表達增強，但其表達增強能被Hyp抑制(P<0.05)，見圖4B～D。

A：不同患者血漿中CXCL1相對表達量；B：不同細(xì)胞CXCL1的mRNA相對表達量；C：不同細(xì)胞CXCL1的蛋白表達情況；D：Western blotting實驗統(tǒng)計結(jié)果。**：P<0.01，與Control比較；#：P<0.05，與OGD/R比較；##：P<0.01，與OGD/R比較。

2.4 Hyp對N2a細(xì)胞存活的促進作用

與Control比較，OGD/R細(xì)胞增殖活力明顯降低、凋亡增加，而OGD/R+Hyp細(xì)胞活力較OGD/R明顯升高、凋亡減少(P<0.05)。與OGD/R+Hyp+NC比較，OGD/R+Hyp+OE-CXCL1細(xì)胞增殖活力降低、凋亡增加(P<0.05)，見圖5。

A：不同細(xì)胞增殖活力；B：不同細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；C：不同細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計。**：P<0.01，與Control比較；##：P<0.01，與OGD/R比較；^：P<0.05，與OGD/R+Hyp+NC比較；^^：P<0.01，與OGD/R+Hyp+NC比較。

2.5 miR-375下游靶標(biāo)情況

使用StarBase、TargetScan在線預(yù)測網(wǎng)站搜索CXCL1的上游靶miRNA并取交集(圖6A)。miR-375與CXCL1的特異性結(jié)合位點見圖6B。DIANA TOOLS對交集miRNA進行pathway注釋分析，發(fā)現(xiàn)miR-375富集在Hippo信號通路(hsa04390)、p53信號通路(hsa04115)兩個通路中，Hippo與p53信號通路以往均被證實與I/R密切相關(guān)[12-13](圖6C)。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，miR-375 mimic能顯著降低CXCL1-WT的熒光素酶活性(P<0.05)，見圖6D。qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-375在I/R患者血漿與OGD/R模型中均表達降低(P<0.05)見圖6E、F。與miR-NC比較，miR-375 mimic CXCL1的mRNA和蛋白表達被抑制(P<0.05)，見圖6G。

A：StarBase、TargetScan網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果；B：miR-375與CXCL1的特異性結(jié)合位點；C：miRNA的通路分析結(jié)果；D：雙熒光素酶報告檢測結(jié)果；E：qRT-PCR檢測miR-375在I/R患者血漿中的表達；F：qRT-PCR檢測miR-375在OGD/R模型中的表達；G：CXCL1的mRNA相對表達量；H：CXCL1的蛋白表達情況；I:Western blotting實驗統(tǒng)計結(jié)果。**：P<0.01，與miR-NC和CXCL1-WT共轉(zhuǎn)染比較；##：P<0.01，與Control比較；^^：P<0.01，與miR-NC比較。

2.6 Hyp在miR-375/CXCL1軸的作用

與Control比較，OGD/R細(xì)胞增殖活力被抑制，凋亡增加，加入Hyp后細(xì)胞增殖活力提高，凋亡減少(P<0.05)。與OGD/R+Hyp+inh-NC比較，OGD/R+Hyp+inh-miR-375細(xì)胞增殖活力減少，凋亡增加(P<0.05)。與OGD/R+Hyp+inh-miR-375+si-NC比較，OGD/R+Hyp+inh-miR-375+si-CXCL1細(xì)胞增殖活力提高，凋亡減少(P<0.05)。見圖7。

A：不同細(xì)胞增殖活力；B～H：不同細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；I：不同細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計。**：P<0.01，與Control比較；##：P<0.01，與OGD/R比較；^^：P<0.01，與OGD/R+Hyp+inh-NC比較；&：P<0.05，與OGD/R+Hyp+inh-miR-375+si-NC比較；&&：P<0.01，與OGD/R+Hyp+inh-miR-375+si-NC比較。

3 討 論

Hyp廣泛存在于各種植物中，如金絲桃科、桔?？?、杜鵑花科、藤黃科等[14]。已有研究證明，Hyp可顯著減輕I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷、腎小管細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[15]。此外也有研究證實，Hyp通過激活多巴胺能神經(jīng)元Nrf2/HO-1信號，抑制6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[16]。本研究通過構(gòu)建腦I/R體外細(xì)胞模型，證實了Hyp能夠減少OGD/R處理的N2a細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞增殖活力。這與之前Hyp改善腦缺血損傷的研究結(jié)果一致[17]。

進一步對Hyp在腦I/R中發(fā)揮作用的潛在機制進行探究。本研究借助GEO數(shù)據(jù)庫中I/R相關(guān)芯片，篩選了在I/R中差異表達的基因并將CXCL1納入研究。VICTORIA等[18]在研究中發(fā)現(xiàn)，CXCL1在I/R模型小鼠中表達增強。本研究進一步通過臨床檢測和細(xì)胞實驗證實了CXCL1在腦I/R患者與OGD/R細(xì)胞模型中的表達升高。此外，實驗發(fā)現(xiàn)OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)高表達CXCL1被Hyp抑制。繼續(xù)干預(yù)CXCL1的表達并設(shè)計功能實驗，結(jié)果顯示，與Control比較，OGD/R細(xì)胞活力被抑制，凋亡增加，而Hyp在改善細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞活力方面效果明顯。但轉(zhuǎn)染CXCL1后Hyp對OGD/R細(xì)胞的保護作用被抑制，提示Hyp對腦I/R的改善作用可能是通過抑制CXCL1的表達來實現(xiàn)。本研究證實了miR-375與CXCL1存在靶向結(jié)合關(guān)系，qRT-PCR實驗證實了miR-375在腦I/R患者與OGD/R模型中表達下調(diào)，miR-375可能在腦I/R發(fā)展中發(fā)揮重要作用。以往研究顯示，敲除MALAT1可通過調(diào)節(jié)miR-375/PDE4D軸減輕大鼠腦I/R損傷[19]。另外，miR-375能夠通過靶向Ctgf減輕腦I/R損傷[20]。WANG等[21]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-375表達能夠促進毛蕊異黃酮對腦缺血再灌注大鼠的保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與OGD/R組比較，加入Hyp能夠抑制N2a細(xì)胞凋亡，但是Hyp的作用被inh-miR-375部分抵消。敲減CXCL1也能部分逆轉(zhuǎn)inh-miR-375對Hyp的作用，提示Hyp對I/R細(xì)胞模型的影響可能是通過調(diào)控miR-375/CXCL1實現(xiàn)的。

本研究也存在一定不足之處。例如，僅從臨床檢測及體外I/R細(xì)胞實驗的角度對I/R中miR-375/CXCL1的差異表達進行了驗證，未進一步從體內(nèi)動物實驗的角度對miR-375/CXCL1作用網(wǎng)絡(luò)的影響及Hyp在I/R中的作用進行探究。此外，未進一步探究Hyp可能調(diào)控的信號通路，這也是作者之后要重點關(guān)注的方向。

綜上所述，本研究證實Hyp通過調(diào)控miR-375/CXCL1軸影響OGD/R處理的N2a細(xì)胞增殖和凋亡，進一步明確了Hyp在I/R中發(fā)揮保護作用的分子機制，為I/R的治療提供了潛在的新靶點。