袁 夢，陳 俊，張 佳，楊作臻，甘 靖△

(1.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院兒科/出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.發(fā)育與婦兒疾病四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；3.宜賓市第二人民醫(yī)院兒科，四川宜賓 644000；4.賽福解碼(北京)基因科技有限公司,北京 100089)

Leigh綜合征(LS)是一種由線粒體氧化磷酸化缺陷造成的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病[1-2]。常見臨床表現(xiàn)包括喂養(yǎng)困難、肌張力障礙、共濟(jì)失調(diào)、眼肌麻痹、構(gòu)音障礙、癲癇發(fā)作、精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩等，伴血液、腦脊液、尿液中乳酸(Lac)增高[3]。LS預(yù)后差，患兒常于癥狀出現(xiàn)后2年內(nèi)死亡，晚發(fā)性LS較為罕見，病程相對緩和，但由于其臨床表現(xiàn)缺乏特異性，常易被誤診為其他導(dǎo)致肌無力的疾病[4]。本研究對2例被誤診為重癥肌無力的晚發(fā)性LS患兒臨床資料進(jìn)行回顧性分析并復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)，旨在為該類患兒的診療提供經(jīng)驗(yàn)。

1 臨床資料

1.1 基本病史

例1，男，13歲4個(gè)月，因“雙側(cè)眼瞼下垂1個(gè)月”入院。眼瞼下垂伴眼瞼水腫、復(fù)視、眼痛，晨輕暮重，活動(dòng)耐量稍下降，外院診斷“重癥肌無力(眼肌型)”，給予溴吡斯的明及激素治療但效果欠佳。既往史及個(gè)人史無特殊情況。家族史：患兒弟弟及表妹均于9歲左右患“呼吸道感染”后猝死；患兒表弟4歲時(shí)被開水燙傷，隨后出現(xiàn)高熱、語言和運(yùn)動(dòng)明顯倒退(此前生長發(fā)育正常)，不能行走、說話。基因檢查提示MT-ATP6基因突變(m.9176T>C)，考慮LS，給予“雞尾酒療法”治療后語言、運(yùn)動(dòng)功能逐漸好轉(zhuǎn)，目前8歲齡，運(yùn)動(dòng)正常，語言稍落后；患兒父母體健。查體：步態(tài)正常，視力、視野粗測正常，雙側(cè)眼瞼下垂，瞳孔等大等圓，對光反射靈敏，眼球活動(dòng)正常，四肢肌力、肌張力正常。輔助檢查：抗乙酰膽堿受體免疫球蛋白G(IgG)抗體陽性(0.95 mmol/L)；新斯的明試驗(yàn)、疲勞試驗(yàn)、重復(fù)電刺激、腦電圖結(jié)果均正常；血Lac、腦脊液Lac檢測值均在正常范圍內(nèi)。頭顱磁共振成像(MRI)示：導(dǎo)水管周圍腦白質(zhì)區(qū)縱行條片狀異常信號，雙側(cè)背側(cè)丘腦和基底節(jié)區(qū)片狀異常信號。磁共振波譜成像(MRS)示：導(dǎo)水管周圍腦白質(zhì)呈N-乙酰天門冬氨酸(NAA)/肌酸(Cr)減低，可見明顯的Lac峰。見圖1。

A、B、C、D：頭顱MRI圖像，白色箭頭示導(dǎo)水管周圍腦白質(zhì)區(qū)縱行條片狀異常信號，白色圓框示雙側(cè)背側(cè)丘腦和基底節(jié)區(qū)片狀異常信號；E：MRS圖像。

例2，女，9歲11個(gè)月，因“雙側(cè)眼瞼下垂、復(fù)視6 d”入院。眼瞼下垂，晨輕暮重，伴復(fù)視、眼球活動(dòng)受限。門診完善相關(guān)檢查考慮“重癥肌無力(眼肌型)”，予溴吡斯的明治療但效果欠佳。既往史、個(gè)人史、家族史無特殊情況。查體：步態(tài)正常，雙側(cè)眼瞼下垂，雙側(cè)眼球向上運(yùn)動(dòng)活動(dòng)稍受限，復(fù)視、瞳孔等大等圓，對光反射靈敏，四肢肌力、肌張力正常。輔助檢查：新斯的明試驗(yàn)呈可疑陽性；抗乙酰膽堿受體IgG抗體陽性(0.92 mmol/L)；疲勞試驗(yàn)、重復(fù)電刺激、腦電圖結(jié)果均正常。入院后查血Lac升高(2.92 mmol/L)、腦脊液Lac升高(3.64 mmol/L)。頭顱MRI示：中腦導(dǎo)水管周圍組織、橋腦背側(cè)和延髓有斑片樣信號異常，以中腦導(dǎo)水管周圍組織信號異常顯著。MRS示：倒置的Lac峰稍明顯，提示遺傳代謝性疾病可能性大。見圖2。

A、B、C、D：頭顱MRI圖像，白色箭頭示中腦導(dǎo)水管周圍組織、橋腦背側(cè)和延髓有斑片樣信號異常；E：MRS圖像。

1.2 基因檢測方法

1.2.1高通量靶向測序

抽取先證者及父母外周血2 mL，使用試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取外周血DNA，采用Qubit定量后，使用超聲破碎儀將DNA打碎至150～350 bp，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和文庫構(gòu)建。采用覆蓋全外顯子和線粒體基因的panel(iWES，北京賽福解碼基因科技有限公司)進(jìn)行捕獲建庫，采用雙末端(Paired-End)測序策略。Raw data>10 G，Q30≥80%，確保線粒體基因區(qū)域測序深度達(dá)到8 000×以上。

1.2.2生物信息學(xué)分析和Sanger測序驗(yàn)證

測序儀下機(jī)原始數(shù)據(jù)使用BWA軟件比對人類參考基因組GRCh38/hg38，采用GATK進(jìn)行變異檢出。使用Annovar工具對.vcf變異文件進(jìn)行注釋。致病變異位點(diǎn)篩選：(1)篩選出外顯子區(qū)和線粒體區(qū)域變異、非同義變異位點(diǎn)；(2)HGMD、gnomAD等數(shù)據(jù)庫中未見或攜帶率小于5%；(3)參考dbSNP、OMIM、HGMD、ClinVar等多種數(shù)據(jù)庫對致病變異位點(diǎn)進(jìn)行評估；(4)使用SIFT、Polyphen2、LRT、MutationTaster等多種預(yù)測軟件進(jìn)行基因突變打分預(yù)測。

1.2.3變異的致病性分析

根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南，對變異的致病性進(jìn)行判定。

1.3 基因檢測結(jié)果

2例患兒均檢出MT-ATP6基因存在m.9176T>C突變(圖3)，均為均質(zhì)突變(即突變后絕大部分線粒體基因的序列一致)，突變比例分別為99.4%和100.0%。由于例1患兒家系中的表弟有明確的位點(diǎn)突變，作者對其家系進(jìn)行線粒體基因突變驗(yàn)證(圖4)，發(fā)現(xiàn)該患兒突變來源于外婆，突變比例為21.19%；母親突變比例為97.95%，父親為野生型；小姨突變比例為95.50%，表弟(小姨的兒子)突變比例為99.89%，舅舅突變比例為57.44%。例2患兒變異來源于母親，其母親表型正常。

A:例1患兒MT-ATP6基因突變(m.9176T>C)圖，變異來源于其母親；B：例2患兒MT-ATP6基因突變(m.9176T>C)圖，變異來源于其母親。

圖4 例1患兒家系圖

1.4 診療經(jīng)過及預(yù)后

根據(jù)臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查、基因檢查結(jié)果，明確LS診斷后，參考國內(nèi)外報(bào)道的MT-ATP6基因突變(m.9176T>C)所致晚發(fā)性LS的診療情況(表1)，對2例患兒采用“雞尾酒療法”(維生素B1，10 mg·kg-1·d-1；維生素B2，10 mg·kg-1·d-1；維生素C，10 mg·kg-1·d-1；維生素E，10 mg·kg-1·d-1；左卡尼汀，50 mg·kg-1·d-1；輔酶Q10,10 mg·kg-1·d-1)改善代謝。例1患兒治療10 d后雙側(cè)眼瞼下垂恢復(fù)，其他臨床表現(xiàn)正常；例2患兒治療3個(gè)月后，眼瞼下垂及復(fù)視明顯改善，但在長時(shí)間活動(dòng)后仍有肢體乏力表現(xiàn)，復(fù)查血Lac為1.29 mol/L，較此前明顯下降。

表1 MT-ATP6基因突變(m.9176T>C)相關(guān)晚發(fā)性LS患者臨床資料

2 討 論

LS具有顯著的臨床表型和遺傳異質(zhì)性，其遺傳方式包括常染色體隱性遺傳、X連鎖遺傳、母系遺傳，其中核基因突變占70%～80%，線粒體基因(mtDNA)突變占10%～20%[12]。ATP合成酶6(ATPase6)缺陷可導(dǎo)致LS，其編碼基因?yàn)镸T-ATP6基因(OMIM 516060)，位于mtDNA 8527-9207，目前已發(fā)現(xiàn)多種MT-ATP6基因突變所導(dǎo)致的LS，包括：m.8993T>C、m.8993T>G、m.9176T>C、m.9176T>G、m.9185T>C、m.8597T>C、m.9035T>C、m.8936T>A、m.9191T>C[11,13-19]。mtDNA與核DNA在突變遺傳和致病種類上有較多區(qū)別，其遺傳特性包括母系遺傳、高突變發(fā)生率、均質(zhì)突變與異質(zhì)突變相互變化、能量閾值效應(yīng)和瓶頸效應(yīng)、隨細(xì)胞衰老突變發(fā)生率增加等。mtDNA突變的異質(zhì)性普遍存在，目前已明確閾值效應(yīng)對mtDNA異質(zhì)突變致病性的影響，當(dāng)突變發(fā)生率達(dá)到一定的閾值后，患者可出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表型。臨床普遍認(rèn)為，mtDNA突變發(fā)生率>70%可達(dá)致相應(yīng)的臨床表型[20]。在MT-ATP6異質(zhì)突變中，突變發(fā)生率>90%可導(dǎo)致LS和代謝性中風(fēng)；在較低的突變水平時(shí)，患者可出現(xiàn)神經(jīng)病變、共濟(jì)失調(diào)和視網(wǎng)膜色素變性[21]，但目前尚無其具體閾值的進(jìn)一步研究報(bào)道。在作者所報(bào)道的例1患者家系中，先證者和其表弟、母親、小姨的突變比例均>95%，其中先證者和表弟(先證者小姨的兒子)突變發(fā)生率達(dá)99%以上，均出現(xiàn)了臨床表現(xiàn)，而突變發(fā)生率稍低的先證者母親、小姨目前表型均正常，可能與m.9176T>C位點(diǎn)突變相關(guān)LS發(fā)病較晚、癥狀相對緩和有關(guān)。另外，先證者弟弟及表妹(先證者小姨的女兒)均患“呼吸道感染”后猝死，雖未行基因檢測，但根據(jù)家系患病情況推測，兩者均有極大可能也攜帶有MT-ATP6基因突變(m.9176T>C)。因此，作者猜測對于該位點(diǎn)的閾值效應(yīng)突變發(fā)生率可能>99%。

在MT-ATP6基因突變所致的LS中，以早發(fā)性更為多見，發(fā)育遲緩或倒退、共濟(jì)失調(diào)是常見的起始臨床表現(xiàn)[22]，但m.9176T>C位點(diǎn)突變導(dǎo)致的LS則以晚發(fā)多見。作者所報(bào)道的2例病例突變位點(diǎn)均為m.9176T>C，該位點(diǎn)突變已報(bào)道共15例[5-11,23-25]，其中7例為早發(fā)性LS，于2歲前起病(9個(gè)月至1歲9個(gè)月)；8例為晚發(fā)性LS，于2歲后起病(2～27歲)。本研究2例患兒分別于13歲4個(gè)月、9歲11個(gè)月起病，以眼瞼下垂為主要臨床表現(xiàn)，這與OH等[5]報(bào)道的病例表現(xiàn)一致。不同的是，作者報(bào)道的2例患兒在新斯的明試驗(yàn)、抗乙酰膽堿受體IgG抗體檢查中均提示陽性，而被誤診為重癥肌無力(眼肌型)，治療效果均不佳。由此可見，晚發(fā)性LS的臨床表現(xiàn)可能不典型，容易誤診為重癥肌無力或其他以肌無力為首發(fā)癥狀的疾病，臨床可根據(jù)頭顱MRI和基因檢測進(jìn)行區(qū)分。

目前，LS大多采用對癥治療，重點(diǎn)是改善能量狀態(tài)和降低Lac水平，包括補(bǔ)充輔酶Q10、多種維生素(雞尾酒療法)、丙酮酸、二氯乙酸，以及生酮飲食等[12]。對于m.9176T>C位點(diǎn)突變導(dǎo)致的晚發(fā)性LS患者，也有使用血漿置換及免疫球蛋白治療有效的病例，但其機(jī)制尚未明確[9]。雷帕霉素、低氧療法、腺病毒相關(guān)病毒介導(dǎo)的基因治療也有望在將來成為LS的有效治療方法?！半u尾酒療法”是LS在臨床中最常采用的治療方法，對表1中8例(包括本研究2例患者及例1患者表弟)采用“雞尾酒療法”治療的患者進(jìn)行分析，所有患者均為晚發(fā)性LS，其中1例患者死亡，可能與其啟動(dòng)“雞尾酒療法”時(shí)間較晚(起病2個(gè)月后)有關(guān)，另外7例患者存活至今，表明“雞尾酒療法”治療m.9176T>C位點(diǎn)突變的晚發(fā)性LS患者有效。WEI等[11]報(bào)道了16例線粒體基因突變所致的晚發(fā)性LS患者，其中11例患者接受了“雞尾酒療法”并隨訪超過1年，結(jié)果顯示5例患者病情穩(wěn)定，病變減少。因此，早期明確診斷并采用“雞尾酒療法”，能夠有效改善晚發(fā)性LS患者臨床癥狀及預(yù)后。

綜上所述，MT-ATP6基因突變(m.9176T>C)導(dǎo)致的晚發(fā)性LS更為多見。晚發(fā)性LS臨床表現(xiàn)不典型，常以眼肌無力起病，早期易誤診為重癥肌無力，頭顱MRI和基因檢測是診斷該類患者最有效的手段?！半u尾酒療法”能夠改善晚發(fā)性LS患者的臨床癥狀和預(yù)后，阻止或減緩疾病進(jìn)一步進(jìn)展。