李 麗，寧利敏，姚 忠，朱本偉*，徐 虹

（1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023）

褐藻膠是一種由β-D-甘露糖醛酸（β-Dmannuronate，M）和α-L-古洛糖醛酸（α-Lguluronate，G）通過1→4 糖苷鍵連接的線性多聚體[1]，根據(jù)其分子的長度、M/G 殘基比率和分布以及乙?；潭鹊龋蛊渚哂心z強(qiáng)度、水合能力、黏度和生物活性等特性，在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用價值。褐藻膠的這些特性主要通過褐藻膠修飾酶對褐藻膠的合成和修飾過程進(jìn)行控制，為了能夠利用不同的褐藻膠修飾酶進(jìn)行高效、安全和綠色地制備具有不同性質(zhì)的褐藻膠分子，作者旨在介紹褐藻膠修飾酶合成和修飾褐藻膠的作用機(jī)理，總結(jié)目前幾種褐藻膠修飾酶的來源、分類、結(jié)構(gòu)、作用方式和研究進(jìn)展，為將來更好地應(yīng)用褐藻膠修飾酶和開發(fā)褐藻膠的商業(yè)價值提供參考。

1 簡 介

褐藻膠根據(jù)殘基的排列組合不同分成3 種片段：聚甘露糖醛酸（poly-mannuronate，poly-M）片段、聚古洛糖醛酸（poly-guluronate，poly-G）片段和甘露糖醛酸-古洛糖醛酸（poly-MG）雜合段。poly-M 和poly-G 的鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)非常相似，單糖組分的區(qū)別僅僅是C5 上羥基位置的不同（見圖1）[1]。

圖1 不同結(jié)構(gòu)褐藻膠的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structural diagram of alginate with different structures

自然界中的褐藻膠主要是由褐藻、一些鈣質(zhì)紅藻、假單胞菌屬和固氮菌屬的一些細(xì)菌產(chǎn)生的。目前的商業(yè)褐藻膠主要是從一些褐藻植物中提取，如泡葉藻（Ascophyllum）、公牛藻（Durvillaea）、昆 布（Ecklonia）、螺紋雷松藻（Lessonia trabeculata）、巨藻（Macrocystis）和馬尾藻（Sargassum）等[2]。不同來源褐藻膠的組成和結(jié)構(gòu)不同，例如螺紋雷松藻和極北海帶（Laminaria hyperborea）中的褐藻膠古洛糖醛酸含量較高（M/G 殘基比率＜1），海洋巨藻（Durvillaea potatorum）中的褐藻膠古洛糖醛酸含量較低，而細(xì)菌中的褐藻膠還會發(fā)生乙?；磻?yīng)[3]。此外一些褐藻中的褐藻膠結(jié)構(gòu)還受到季節(jié)、生長環(huán)境、年齡及不同部位的影響[4]。

褐藻膠開始由GDP-甘露糖醛酸合成，然后被甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶、褐藻膠裂解酶、褐藻膠乙?；负秃衷迥z脫乙酰化酶在聚合物水平上進(jìn)行修飾改性（如圖2）。褐藻膠是以聚甘露糖的形式合成的（見圖2 第一行分子）；甘露糖醛酸殘基（M）可以在O2 或O3 位置通過甘露糖乙?；福ˋ）乙?；⒏事毒厶荂5 差向異構(gòu)酶（E）而異構(gòu)化為古洛糖醛酸殘基（G）或被褐藻膠裂解酶（L）降解產(chǎn)生不飽和的4-脫氧-L-赤式-6-4-烯吡喃糖醛酸酯殘基（Δ）；乙?；梢酝ㄟ^褐藻膠脫乙酰酶（D）去除。

圖2 褐藻膠修飾酶的作用示意圖Fig.2 Schematic diagram of function of alginate-modifying enzymes

銅綠假單胞菌中合成褐藻膠所需的12 種蛋白質(zhì) 由AlgD 操縱子編碼（AlgD、Alg8、Alg44、AlgK、AlgE、AlgG、AlgX、AlgL、AlgI、AlgJ、AlgF、AlgA），而另一種蛋白質(zhì)AlgC 則在其他地方進(jìn)行編碼[5]。褐藻膠合成復(fù)合體的模型如圖3 所示。首先，細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)AlgA、AlgC 和AlgD 通過一系列反應(yīng)將D-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為GDP-甘露糖醛酸，這是合成褐藻膠的活化前體[6]。其次，GDP-甘露糖醛酸通過聚合成聚甘露糖醛酸鏈，部分Alg44[7]也參與了這個過程。Alg8 具有多個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個細(xì)胞質(zhì)糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，而Alg44 具有單個跨膜結(jié)構(gòu)域，能將細(xì)胞質(zhì)c-di-GMP 結(jié)合的PilZ 結(jié)構(gòu)域與一個C 端周質(zhì)結(jié)構(gòu)域分開[8-9]。然后，在聚合時新生的聚甘露糖醛酸鏈被由AlgG、AlgL、AlgK、AlgX 和AlgE 組成的周質(zhì)支架在周圍進(jìn)行置換[9]。并且在周質(zhì)中新生褐藻膠鏈的甘露糖醛酸殘基可以通過AlgI、AlgJ 和AlgF 的作用選擇性地在O2/O3 位置進(jìn)行O-乙?；痆5]。周質(zhì)支架中的AlgG 是一個差向異構(gòu)酶，能夠?qū)ⅵ?D-甘露糖醛酸轉(zhuǎn)化為α-L-古洛糖醛酸[10]。AlgL是一種雙功能周質(zhì)蛋白質(zhì)，不僅具有裂解褐藻膠的功能[11]，同時作為修復(fù)系統(tǒng)存在于周質(zhì)中，以清除這些合成異常的褐藻膠分子[12]，保證周質(zhì)支架的功能完整性。AlgK 位于周質(zhì)中，通過脂質(zhì)部分附著在外膜上，是一個廣泛參與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域[13]。蛋白質(zhì)AlgX 也在周質(zhì)中與AlgK 和MucD 相互作用參與褐藻膠生物合成的翻譯后調(diào)節(jié)。AlgE 在外膜中形成一個β 桶孔，合成的褐藻膠最后通過AlgE從細(xì)胞中分泌出來[6]。

圖3 銅綠假單胞菌褐藻膠合成復(fù)合體模型[14]Fig.3 Alginate synthesis complex model of Pseudomonas aeruginosa[14]

此外如果產(chǎn)生褐藻膠的復(fù)合體不能正常工作的話，周質(zhì)中的聚陰離子褐藻膠會吸引陽離子，從而產(chǎn)生滲透脅迫導(dǎo)致細(xì)胞溶解。

一般來講，經(jīng)過修飾后的褐藻膠存在結(jié)構(gòu)上的差異主要涉及以下幾點(diǎn)：

1）褐藻膠分子中M 殘基和G 殘基之間的比例和分布模式發(fā)生變化 如圖2 所示，先合成的部分甘露糖醛酸殘基（M 殘基）通過甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶被異構(gòu)化為古洛糖醛酸殘基（G 殘基），從而產(chǎn)生3 種褐藻膠多糖分子片段（poly-G、poly-M、poly-MG）。而poly-G 和poly-MG 的長度和數(shù)量影響著聚合物的幾個重要的物理特性，比如溶液的黏度及凝膠的穩(wěn)定性、滲透性和水解性[14]。通常G 殘基含量比較少的聚合物不能形成陽離子凝膠，但是可以形成酸性凝膠。富含M 殘基的褐藻膠表現(xiàn)出免疫刺激性，而poly-G 則不具有免疫刺激性，即褐藻膠中M 和G 的相對含量直接關(guān)系到免疫活性強(qiáng)弱，且分子結(jié)構(gòu)中各個聚合體的連接方式和連接順序?qū)γ庖呋钚砸灿兄苯拥挠绊慬15]。

2）不同生物體產(chǎn)生的褐藻膠多糖分子有不同程度的乙酰化修飾 細(xì)菌中產(chǎn)生的褐藻膠通常會在β-D-甘露糖醛酸的O2/O3 位置上選擇性地發(fā)生乙酰化修飾[16]，而在海藻中產(chǎn)生的褐藻膠沒有這種變化。乙?；芤种凭酆衔锱c陽離子相互作用，因此褐藻膠的乙?；赡軙岣吆衷迥z的黏度，降低其水溶性，從而增強(qiáng)褐藻膠形成凝膠的能力。去除O-乙酰殘基則會導(dǎo)致多糖與二價陽離子結(jié)合能力增強(qiáng)，多糖溶解度提高。另外，乙?；暮衷迥z還可能與透明質(zhì)酸類似，具有保留水和營養(yǎng)物質(zhì)的能力[17]。

3）即使來源相同的褐藻膠其聚合度也有不同[12]在生物體合成褐藻膠的過程中，可能由于物理或者褐藻膠裂解酶的作用使褐藻膠多糖降解為褐藻膠寡糖，從而改變聚合物的聚合度。聚合度也會影響褐藻膠的黏度和凝膠強(qiáng)度，可以通過SEC－Malls 等方法測定[18]。

褐藻膠結(jié)構(gòu)的多樣性影響了褐藻膠多糖的物理化學(xué)性質(zhì)并使其在不同行業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景。

在食品行業(yè)中，褐藻膠可以作為食品添加劑起到穩(wěn)定、增稠和乳化等作用[19]。同時褐藻膠作為一種可食用纖維對預(yù)防結(jié)腸癌、心血管疾病、肥胖癥、體內(nèi)重金屬的積累具有輔助治療的功效[20]。

在生物醫(yī)學(xué)材料的應(yīng)用方面，褐藻膠作為支架材料其柔韌性可以完全彌補(bǔ)組織缺陷，并且光滑的表面可以避免對損傷部位的二次傷害[21]。Li 等使用褐藻膠和阿拉伯樹膠與鈣離子介導(dǎo)，通過交聯(lián)設(shè)計(jì)獲得了最佳黏性水凝膠支架，用于介導(dǎo)和加速一種細(xì)胞膜修復(fù)中的重要蛋白質(zhì)MG53 的釋放，以改善傷口的再上皮化過程和持續(xù)釋放用于治療慢性傷口[22]。褐藻膠還是制藥工業(yè)中常見的賦形劑。有研究者在西咪替丁固定組合片劑中添加褐藻膠用于改善食管反流[23]。

在醫(yī)藥領(lǐng)域中，褐藻膠具有抗過敏、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化和抗炎等生物活性，能夠激活人單核細(xì)胞產(chǎn)生在抗腫瘤、抗菌、抗病毒中發(fā)揮重要作用的免疫因子[24]，故可用于治療外傷、修復(fù)皮膚損傷，具有良好的止血作用、可靠的治療效果和較低感染率等特性。Jiang 等證明褐藻膠寡糖顯示出有效地抗氧化活性和抗凋亡活性[25]。

2 褐藻膠裂解酶

褐藻膠裂解酶能夠?qū)⒑衷迥z多糖降解為具有更高生物活性的褐藻膠寡糖[26]。此外褐藻膠裂解酶還可以用于褐藻資源的生物煉制[27]及褐藻膠多糖精細(xì)結(jié)構(gòu)的表征[28]等方面。因此挖掘表征具有不同特性的褐藻膠裂解酶，對褐藻資源的利用具有十分重要的意義。

2.1 褐藻膠裂解酶的來源

在自然界中，褐藻膠裂解酶由許多利用褐藻膠作為碳源的細(xì)菌、動植物和病毒產(chǎn)生，目前細(xì)菌來源的褐藻膠裂解酶研究最為廣泛，已報(bào)道的產(chǎn)褐藻膠裂解酶的微生物主要包括弧菌、假單胞菌、黃桿菌、固氮菌、交替假單胞桿菌、鞘氨醇單胞菌以及克雷伯氏菌等[29]。其次，來源于病毒、真菌以及動植物的褐藻膠裂解酶也有一定的報(bào)道，Suda 等于1999年在小球藻病毒中也發(fā)現(xiàn)了褐藻膠裂解酶的基因[30]。Inoue 等首次在褐藻植物中提取出了一種褐藻膠裂解酶，進(jìn)一步拓寬了褐藻膠裂解酶的來源[31]，近年來不斷有人從鹽藻、紅藻和海帶等海洋藻類中分離出褐藻膠裂解酶[32-33]。在海洋軟體動物和棘皮動物體內(nèi)也可以分離出褐藻膠裂解酶，如黑斑海兔（Aplysia kurodai）[34]、皺紋盤 鮑（Haliotis discushannai）和短濱螺（Littorina brevicula）等[35-36]。

2.2 褐藻膠裂解酶的分類

目前，褐藻膠裂解酶的分類方式主要有3 種：

1）根據(jù)氨基酸序列相似性多糖裂解酶被分成不同的家族，在CAZy 數(shù)據(jù)庫中，褐藻膠裂解酶可歸屬 到14 個多糖 裂解酶家族（PL）：PL5、PL6、PL7、PL8、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36、PL39 和PL41 家族[31]，還有一些并不屬于以上家族的新型褐藻膠裂解酶，如Paenibacillus sp.LJ-23 中的Algpt[37]。其中來自細(xì)菌的褐藻膠裂解酶大多數(shù)屬于PL5、PL6、PL7、PL15 和PL17 家族，而來自真核細(xì)胞和病毒中的褐藻膠裂解酶主要屬于PL14 家族，不同的家族其在結(jié)構(gòu)上有明顯的差異。

2）如圖1 所示，褐藻膠分子中存在4 種不同的化學(xué)鍵：M—M、G—G、M—G、G—M，大多數(shù)裂解酶對不同的化學(xué)鍵表現(xiàn)出不同的反應(yīng)速率，根據(jù)對不同糖苷鍵的底物特異性，褐藻膠裂解酶可以分為：專一裂解聚甘露糖醛酸的裂解酶（EC4.2.2.3）、專一裂解聚古洛糖醛酸的裂解酶（EC4.2.2.11）以及對poly-M 和poly-G 均表現(xiàn)出高活性，可以更有效地降解褐藻膠的雙功能裂解酶（EC4.2.2.-）[38]，并且不是所有的褐藻膠裂解酶都能裂解乙?；暮衷迥z[39]。來自軟體動物的褐藻膠裂解酶和來自幾種海洋細(xì)菌的褐藻膠裂解酶多具有poly-M 底物特異性，那些發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌培養(yǎng)液的胞外酶則大部分具有poly-G底物特異性。值得注意的是，某些poly-M 裂解酶/poly-G 裂解酶并不是只對poly-M/poly-G 有活性，也可以裂解poly-G/poly-M 和poly-MG，只是活性較低。雙功能裂解酶多集中在PL7、PL15 和PL17 家族中，許多雙功能裂解酶對不同的糖苷鍵活性不同，例如來自Persicobacter sp.CCB-QB2 的雙功能裂解酶AlyQ 對poly-G 和poly-M 的活性僅是對褐藻膠活性的60.7%和29.0%，表明AlyQ 更偏好裂解GM 或MG 之間的糖苷鍵[40]。而來自Wenyingzhuangia fucanilytica 的雙功能裂解酶Aly7B_Wf 對poly-M和poly-G 的活性分別為（27.03±1.69）U/mg 和（21.48±1.10）U/mg，表明該酶的首選底物為poly-M[41]。另外來自Sphingomonas sp.ZH0 的ZH0-I 對poly-G的活性則是對褐藻膠和poly-M 活性的120%[42]。

3）從作用模式來看，褐藻膠裂解酶可以分為3類：（1）內(nèi)切型褐藻膠裂解酶，目前報(bào)道的大多數(shù)的裂解酶均具有內(nèi)切酶活性，這些酶在褐藻膠內(nèi)部隨機(jī)切割糖鏈上的1→4 糖苷鍵，并產(chǎn)生不同聚合度（Dps）的不飽和褐藻膠寡糖[43]；（2）外切型褐藻膠裂解酶，一些外切酶可以從多糖的末端切除單體或二聚體寡糖產(chǎn)生不飽和單糖，然后通過非酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化成DEH（4-deoxy-l-erythro-5-hexoseulose uronate），如來自Zobellia galactanivorans DsijT 的AlyA3[44]，目前報(bào)道的大多數(shù)外切酶屬于PL7、PL15 和PL17 家族；（3）內(nèi)切和外切型褐藻膠裂解酶，有一些裂解酶同時具有內(nèi)切和外切兩種活性，例如Huang 等分離純化出的Alg17B 裂解酶對褐藻膠表現(xiàn)出內(nèi)切和外切兩種活性，產(chǎn)生單糖和低相對分子質(zhì)量寡聚糖[45]。目前只有PL6、PL7 和PL17 家族有過這種類型裂解酶的報(bào)道[38，46-49]。表1 中列舉了已經(jīng)表征的各個家族的典型褐藻膠裂解酶。

表1 典型的褐藻膠裂解酶Table 1 Typical alginate lyase

續(xù)表1

2.3 褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)

作者所在課題組在褐藻膠裂解酶研究方面發(fā)表了多篇綜述，詳述了褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)并闡釋了其與底物特異性之間的關(guān)系[29，73-74]。褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)可以分成4 種類型[39]：

1）β-膠凍卷結(jié)構(gòu) 這是褐藻膠裂解酶中最常見也是研究得最透徹的一種結(jié)構(gòu)，PL7、PL14、PL18、PL36 家族的褐藻膠裂解酶多采用這種結(jié)構(gòu)（見圖4）[75]。該結(jié)構(gòu)可分為兩個相互連接的弧形反平行β 片：內(nèi)凹片（SA）和外凹片（SB）。它們在中間進(jìn)一步彎曲，形成近90°的球狀。內(nèi)凹的薄片形成一個含有催化部位的裂隙并結(jié)合底物，在催化反應(yīng)中起著不可或缺的作用。

圖4 β-膠凍卷結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 Schematic representation of β-jelly roll structure

2）β-螺旋結(jié)構(gòu) PL6 和PL31 家族的褐藻膠裂解酶多采用這種結(jié)構(gòu)（見圖5），它由3 個β-折疊和3 個轉(zhuǎn)角（T）組成[76]。轉(zhuǎn)角（T）分別位于兩個β-折疊之間，一起形成了一個完整的β-螺旋（PB1-T1-PB2-T2-PB3-T3）。利用X 射線衍射儀等結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)對幾種具有β-螺旋結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶進(jìn)行了研究。褐藻膠裂解酶BcelPL6 在溶液中是一種單體，它由兩個結(jié)構(gòu)域組成，N 末端結(jié)構(gòu)域（NTD）和C 末端結(jié)構(gòu)域（CTD）都采用右手平行的β-螺旋折疊。多肽的C 端（殘基432～468）為兩個平行于β-折疊PB3 平面的3 圈α-螺旋。β-螺旋的N 端部分在PB1 平面上有一個α-螺旋，C 端部分有一個α-螺旋和一個幾乎垂直于PB3 的β 鏈。生化分析表明，底物結(jié)合親和力主要由NTD 貢獻(xiàn)，而BcelPL6 的CTD 參與將底物固定到合適的構(gòu)象。然而，CTD 具有較弱的褐藻膠裂解酶活性，可與PL6 結(jié)構(gòu)域協(xié)同起到更有效的催化作用。此外，CTD 參與形成一個封閉的催化口袋，它的缺失使BcelPL6 對高度聚合底物的活性增加[77-78]。

圖5 β-螺旋結(jié)構(gòu)示意圖Fig.5 Schematic representation of β-helix structure

3）（α/α）n桶狀結(jié)構(gòu) PL5 家族褐藻膠裂解酶多采用這種結(jié)構(gòu)（見圖6）。這種三維結(jié)構(gòu)是由幾個反平行的α-螺旋構(gòu)成的桶狀結(jié)構(gòu)，從其頂部看螺旋環(huán)是逆時針方向的。例如，來自PL5 的A1-III 的活性中心由12 個α-螺旋形成，這些螺旋形成一個具有深隧道狀裂隙的α6/α5桶折疊。在這種模式下，底物穿透到隧道狀裂隙中，并進(jìn)一步與催化位置相互作用[52]。

圖6 （α/α）n 桶狀結(jié)構(gòu)示意圖Fig.6 Schematic representation of（α/α）n barrel structure

4）（α/α）n桶＋反平行β-折疊結(jié)構(gòu)的組合結(jié)構(gòu)PL15、PL17 以及PL39 家族褐藻膠裂解酶多采用這種結(jié)構(gòu)（見圖7）。PL15 家族中的Atu3025 被鑒定為該結(jié)構(gòu)，其次還有一個口袋狀結(jié)構(gòu)，口袋由兩個結(jié)構(gòu)決定因素構(gòu)成，即中心結(jié)構(gòu)域和C 端結(jié)構(gòu)域之間界面的構(gòu)象變化和短α-螺旋H3 的存在，合理推測口袋狀結(jié)構(gòu)是PL15 家族褐藻膠外切裂解酶的特征，對于釋放不飽和單糖作為唯一產(chǎn)物并識別底物非還原末端的外切模式至關(guān)重要[79]。PL39 中的Dp0100 褐藻膠裂解酶整體由3 個結(jié)構(gòu)域組成，N 端結(jié)構(gòu)域主要是螺旋結(jié)構(gòu)，由不完整的（α/α）6環(huán)形成。中心結(jié)構(gòu)域由16 條反平行的β 鏈排列在兩個β-折疊中，并帶有扭曲的α-螺旋。C 端結(jié)構(gòu)域由兩個反平行β-折疊組成，形成一個典型的由16 條β 鏈組成的β-三明治。中心結(jié)構(gòu)域的一面緊貼C 端結(jié)構(gòu)域，形成一個4 層β-折疊層，另一面緊貼N 端結(jié)構(gòu)域[80]。

圖7 （α/α）n 桶＋反平行β-折疊結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.7 Schematic representation of（α/α）n barrel +antiparallel β-fold structure

而PL8、PL32、PL34 以及PL41 家族褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)尚未得到解析。

2.4 褐藻膠裂解酶的作用機(jī)制

褐藻膠裂解酶通過β-消除反應(yīng)裂解褐藻膠，在C4～C5 位形成不飽和雙鍵，并在新的非還原末端存在一個4-脫氧-L-赤式-6-4-烯吡喃糖醛酸酯殘基，這個雙鍵在235 nm 處有吸光度，可以用來定量測定褐藻膠裂解酶的活性[81]。

Gacesa 提出整個β-消除反應(yīng)通過三步反應(yīng)去完成[82]：首先，帶正電的氨基酸殘基或者金屬離子中和C5 位羧基上的負(fù)電荷從而降低H-5 質(zhì)子的pKa；其次，催化堿從C5 位提取一個質(zhì)子從而形成烯醇中間體，羧基上的電子轉(zhuǎn)移裂解4-O-糖苷鍵，導(dǎo)致在C4～C5 位形成雙鍵并最終使得糖苷鍵的斷裂；最后，在糖苷鍵斷裂的同時產(chǎn)生了含有4-脫氧-L-赤式-6-4-烯吡喃糖醛酸酯殘基作為不飽和非還原末端的寡糖。該反應(yīng)過程中需要催化堿去提取質(zhì)子，并且需要催化酸去提供質(zhì)子。當(dāng)C5 位提取質(zhì)子的方向與C4 位橋接氧在糖醛酸環(huán)的方向在同側(cè)時為順式消除（從M 殘基處進(jìn)行消除），當(dāng)兩者方向相反時為反式消除（從G 殘基處進(jìn)行消除）。

根據(jù)催化位點(diǎn)以及中和底物負(fù)電荷的方式不同可將絕大多數(shù)褐藻裂解酶的消除反應(yīng)分為六大類：

1）金屬離子輔助催化 PL6 家族使用鈣離子去中和C5 位羧基上的負(fù)電荷，然后Lys 充當(dāng)催化堿從C5 位提取一個質(zhì)子，Tyr 充當(dāng)催化酸提供一個質(zhì)子[83]。

2）His/Tyr 型β-消除 PL7 和PL15 家族中的褐藻膠裂解酶采用Tyr 以及His 分別充當(dāng)催化酸和催化堿[84-85]。

3）Tyr/Tyr 型β-消除 在催化過程中，兩個Tyr分別充當(dāng)催化酸和催化堿，例如PL17 家族中的Alg17c，該酶分別采用Tyr450 殘基充當(dāng)催化堿和Tyr258 作為催化酸[86]。

4）Tyr/Tyr 型β-消除 PL5、PL14 和PL18 家族中的褐藻膠裂解酶在催化過程中，同一個Tyr 既充當(dāng)催化酸又充當(dāng)催化堿[87-89]。

5）水催化型β-消除 在催化過程中水分子用于中和羧基上的負(fù)電荷，Arg 以及Lys 分別充當(dāng)催化酸和催化堿。

6）Lys/Lys 型β-消除 在催化過程中同一個Lys 既充當(dāng)催化酸又充當(dāng)催化堿，例如PL36 家族中的Aly36B 在催化過程中Arg169、Tyr185 和Tyr187負(fù)責(zé)中和底物的負(fù)電荷，Lys143 既充當(dāng)催化酸又充當(dāng)催化堿[70]。

2.5 褐藻膠裂解酶的酶學(xué)特性

目前針對褐藻膠裂解酶酶學(xué)特性的研究報(bào)道較少，而某些酶學(xué)性質(zhì)如嗜熱、嗜冷、溫度穩(wěn)定性、pH 穩(wěn)定性和鹽活化等的研究有利于酶適應(yīng)生存環(huán)境和應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，作者對已報(bào)道的典型褐藻膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了整理。

熱穩(wěn)定性是褐藻膠裂解酶應(yīng)用中最重要的性質(zhì)之一，在褐藻膠裂解酶催化過程中，由于熱穩(wěn)定性的存在，催化反應(yīng)可以在更高的溫度下進(jìn)行，反應(yīng)混合物黏度的降低和酶活性的提高從而促進(jìn)底物的轉(zhuǎn)化[90]。當(dāng)催化海帶粉等粗基質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化時，高工藝溫度（高于45 ℃）還可以防止微生物污染。因此具有良好熱穩(wěn)定性的褐藻膠裂解酶對于褐藻膠低聚糖的酶促生產(chǎn)有重要價值。目前已知的大多數(shù)褐藻膠裂解酶不具有熱穩(wěn)定性，只在30～40 ℃表現(xiàn)出最佳催化活性[91]，而關(guān)于具有熱穩(wěn)定性的褐藻膠裂解酶報(bào)道較少，表2 中列舉了目前報(bào)道的一些熱穩(wěn)定性良好的褐藻膠裂解酶。

表2 典型的熱穩(wěn)定性褐藻膠裂解酶Table 2 Typical thermostable alginate lyase

到目前為止有關(guān)褐藻膠裂解酶耐熱機(jī)制的相關(guān)研究還較少，根據(jù)已有報(bào)道，rNitAly 的熱穩(wěn)定性與Cys80 和Cys232 之間形成的二硫鍵有關(guān)[94]。來自Cobetia sp.NAP1 的AlgC-PL7 的熱穩(wěn)定性可能與α-螺旋有關(guān)[95]。Yang 等對AlyM 進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域重建，去除F5_F8_type_C 結(jié)構(gòu)域后，在45 ℃下孵育1 h 的熱穩(wěn)定性由保留30%～40%的酶活力提升到了保留大約70%的酶活力[96]，經(jīng)截?cái)嗪蟮耐蛔凅w具有比全酶更緊湊的結(jié)構(gòu)，能更好地抵抗熱變性的影響，證明酶的熱穩(wěn)定性也可能與酶的結(jié)構(gòu)緊湊程度有關(guān)。

在低溫條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)可以減少能耗、降低微生物污染的風(fēng)險和終止催化反應(yīng)的難度，一般的耐冷性褐藻膠裂解酶在低于35 ℃時具有最高的催化活性，并通常在20 ℃時保留最高活性的50%[57]。表3 中列舉了3 種具有良好低溫穩(wěn)定性的褐藻膠裂解酶。

表3 典型的耐冷褐藻膠裂解酶Table 3 Typical cold-adapted alginate lyase

對于大多數(shù)褐藻膠裂解酶來說，催化的最適pH 接近中性，并且只在狹窄的pH 范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高活性，也有一些酶在狹窄的pH 堿性條件下表現(xiàn)出最高活性。只有少數(shù)酶在較寬的pH 范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高活性。例如來自Vibrio sp.NJ-04 的AlgNJ-04裂解酶在pH 4.0～10.0 的寬pH 范圍內(nèi)保留了超過80%的活性，表現(xiàn)出優(yōu)異的pH 穩(wěn)定性[98]。而Alyw201 在pH 5.0～10.0 孵育12h后仍保留超過70%的活性。特別是在檢測到的整個pH范圍（pH 3.0～11.0）中，孵育12 h 后仍保留超過40%的活性[57]。另外，來自Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5 的Alg823[99]、Vibrio sp.SY01 的Aly08[100]、Serratia marcescens NJ-07 的AlgNJ-07[101]、Paenibacillus sp.LJ-23 的Algpt[37]等均具有良好的pH 穩(wěn)定性。

從海洋環(huán)境中分離出的褐藻膠裂解酶通常還具有鹽活化這一特性，即在一定濃度的氯化鈉溶液中，褐藻膠裂解酶的活性增加數(shù)倍，反映了它們對海水環(huán)境的適應(yīng)能力。如在1 mol/L NaCl 條件下，AlgM4 的活性 增加了 約7 倍[102]；AlyPM 其活性 在0.5～1.2 mol/L NaCl 條件下可以增加6 倍[103]；而對于來自Vibrio sp.的A9mT 在0.4 mol/L NaCl 條件下其活性增加了24 倍[104]。盡管到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多褐藻膠裂解酶可以被鹽激活，但是其中的激活機(jī)制并沒有被徹底揭示出來。根據(jù)已有報(bào)道，AlgNJ-04 的鹽活化特性是由于褐藻膠分子中結(jié)合水的去除或褐藻膠-酶復(fù)合物形成過程中的電荷效應(yīng)[98]。AlgM4 的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊的含量被NaCl 改變從而增強(qiáng)了其對底物的親和力和抵抗熱變性的能力[102]。AlyPM 的鹽活化特性也是由于在NaCl 存在時其對底物親和力增強(qiáng)，但是結(jié)構(gòu)并不發(fā)生變化[103]。AlyC3 的鹽活化機(jī)制則是因?yàn)楸Ａ袅硕垠w四元結(jié)構(gòu)[97]。

總之，目前對褐藻膠裂解酶的基礎(chǔ)研究依然主要集中在新型褐藻膠裂解酶的表征、酶學(xué)性質(zhì)分析以及對酶的三級結(jié)構(gòu)分析，而為了更好地利用褐藻膠裂解酶進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，需要進(jìn)行更多的研究來揭示褐藻膠裂解酶催化機(jī)制。

2.6 褐藻膠裂解酶的應(yīng)用

褐藻膠裂解酶的應(yīng)用包括褐藻膠寡糖的制備、原生質(zhì)體分離、肺囊性纖維化病的治療以及褐藻膠測序等方面。

1）褐藻膠寡糖的制備 褐藻膠寡糖相對分子質(zhì)量小，具有多種生物活性。褐藻膠寡糖的制備方式包括酸解、熱解和酶解等。Iwamoto 等比較了酸解和酶解制得的褐藻膠寡糖對腫瘤壞死因子TNF-α的誘導(dǎo)活性，結(jié)果證明酶解得到的褐藻膠寡糖具有更加廣泛的生物活性[105]。根據(jù)Belik 等報(bào)道通過褐藻膠裂解酶降解天然的聚甘露糖醛酸，產(chǎn)生的甘露糖醛酸寡糖可用于協(xié)同治療腫瘤[106]。

2）原生質(zhì)體分離 褐藻膠是褐藻細(xì)胞壁中含量最豐富的成分，除此還有巖藻糖膠、纖維素、多酚和蛋白質(zhì)等物質(zhì)。研究表明多酚與褐藻膠網(wǎng)絡(luò)相連從而進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)胞壁的強(qiáng)度[107]。采用纖維素酶和褐藻膠酶混合的方法可以降解褐藻細(xì)胞壁，釋放原生質(zhì)體[108]。

3）肺囊性纖維化病的治療 褐藻膠裂解酶能夠配合一些抗生素降解肺囊性纖維化病人肺中病原菌產(chǎn)生的褐藻膠，使病原菌的細(xì)胞壁通透性增強(qiáng)，利于抗生素發(fā)揮抗生作用[109]。Patel 等開發(fā)了環(huán)丙沙星-褐藻膠裂解酶功能化殼聚糖納米顆粒（AgLase-CIPR-CH-NPs）用于有效治療肺囊性纖維化患者銅綠假單胞菌感染[110]。

4）褐藻膠測序 核磁共振是表征褐藻膠分子最常見的一種方法，然而其只能得出G 殘基和M殘基的統(tǒng)計(jì)分布，利用具有特殊底物特異性以及作用模式的酶來降解褐藻膠，再結(jié)合一些現(xiàn)代分析方法如質(zhì)譜等對褐藻膠片段進(jìn)行表征能夠進(jìn)一步測量片段長度分布[28]。

5）生物燃料的制備 褐藻因其高生長速率和高糖分含量而被認(rèn)為是生物燃料乙醇生產(chǎn)中的可再生生物質(zhì)。由于缺乏木質(zhì)素，褐藻生物質(zhì)的糖化相對容易。但是傳統(tǒng)的工業(yè)微生物無法代謝褐藻膠，經(jīng)代謝工程改造的微生物生產(chǎn)的外切型褐藻膠裂解酶可以有效利用褐藻膠，以此克服了該問題[111]。Wang 等優(yōu)化了兩種重組褐藻膠裂解酶（內(nèi)切型Alg7D 和外切型Alg17C）的酶促糖化過程，以便從褐藻膠中高效生產(chǎn)DEH，而DEH 是利用褐藻生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的關(guān)鍵底物[112]。

2.7 提高褐藻膠裂解酶的應(yīng)用能力

目前針對褐藻膠裂解酶的應(yīng)用能力，主要是通過酶的固定化和酶的分子改造提高酶活性或者改善某種特性，大大提高了酶的工業(yè)化應(yīng)用效率。

為了發(fā)揮酶的最大應(yīng)用價值，近年來研究人員證明了固定化酶在穩(wěn)定性、可重復(fù)利用性和易于分離方面顯示出比游離酶更好的優(yōu)勢，酶可以通過吸附、包埋和交聯(lián)進(jìn)行固定化。目前對固體載體上固定褐藻膠裂解酶已經(jīng)進(jìn)行了一些研究，例如生物聚合物微球、超濾膜、殼聚糖納米顆粒、介孔氧化鈦顆粒等，為褐藻膠寡糖的生產(chǎn)、工業(yè)廢水的處理以及抗生物膜治療等方面提供了褐藻膠裂解酶應(yīng)用的途徑[25，83]。作者所在課題組將褐藻膠裂解酶AlyPL6固定在介孔氧化鈦顆粒（MTOPs）上后，在重復(fù)使用10 次后，在45 ℃下保留＞55.4%的活性[113]。Li 等將褐藻膠裂解酶Aly08 固定在低相對分子質(zhì)量殼聚糖納米顆粒上，與游離的Aly08 相比，固定化的ALLMW-CS-NPs 在抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成和阻斷成熟的生物膜方面表現(xiàn)出更高的效率，使得銅綠假單胞菌的生物量大大減少。該研究促進(jìn)了褐藻膠裂解酶作為抗生物膜劑的進(jìn)一步發(fā)展[114]。而Meshram 等將AlgL 固定在醋酸纖維素超濾膜上，成功地解決了多糖結(jié)垢問題對水凈化的影響[115]。

酶的分子改造主要包括合理設(shè)計(jì)、半理性設(shè)計(jì)、定向進(jìn)化、保守結(jié)構(gòu)域重組和非催化結(jié)構(gòu)域截?cái)郲116]，經(jīng)過分子改造后的突變體具有與初始酶不同的酶學(xué)特性。作者所在課題組系統(tǒng)總結(jié)了褐藻膠裂解酶分子改造的研究進(jìn)展[117]，目前常以引入二硫鍵、重建保守結(jié)構(gòu)域以及定向進(jìn)化來提高酶的活性和穩(wěn)定性。例如，Yang 等在對cAlyM 的催化位點(diǎn)、二級結(jié)構(gòu)以及空間構(gòu)型進(jìn)行綜合分析后，在分子中引入了二硫鍵，設(shè)計(jì)出了突變體D102C-A300C 和G103C-T113C，t1/2（45 ℃）分別增加了2.25、1.16 h[118]。作者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)褐藻膠裂解酶Aly7B 在35 ℃下表現(xiàn)出較差的熱穩(wěn)定性。然而，當(dāng)截?cái)郃ly7B-CDI（非催化結(jié)構(gòu)域：R2～Y181）時，Aly7BCDII（催化結(jié)構(gòu)域：W190～H477）在35 ℃下活性可以保持不變[119]，熱穩(wěn)定性大大提高。Xu 等通過在AlgL-CD 的活性中心引入堿性氨基酸來合理設(shè)計(jì)酶分子以增加酶活性，其中突變體E226K 的整體構(gòu)象變得更加靈活，與底物的親和力增加，表現(xiàn)出比野生型AlgL-CD 更高的酶活力，但同樣由于鈣結(jié)合環(huán)的靈活性變高，與Ca2+的結(jié)合能力變?nèi)酰珽226K 的熱穩(wěn)定性變差[120]。而Su 等基于E226K 的作用模式，選擇loop 環(huán)1 上的I211 位點(diǎn)和底物入口處的E276、Y292 和R294 位點(diǎn)作為工程靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)出的突變體E226K/I211T/R294V 催化裂隙周圍的環(huán)更靈活、底物入口更大，酶的催化效率提高了4.78 倍，半衰期t1/2（45 ℃）從89 min 增加到557 min[121]。此外，分子改造還可以用于改造酶的最終產(chǎn)物，Zhang等報(bào)道了借助AlyF 中間產(chǎn)物的裂解模式變化，對與糖結(jié)合的殘基Arg266 進(jìn)行位點(diǎn)突變，改變亞位點(diǎn)對糖的親和力，結(jié)果證明F128T/W172R/R226H突變體的主要產(chǎn)物由三糖（三糖占比為87.0%）變?yōu)槎呛腿牵ǘ钦急忍岣叩?0.5%）[122]。

3 甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶

甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶（mannuronan C5-epimerase，MC5E）是一種褐藻膠修飾酶，催化褐藻膠中的β-D-甘露糖醛酸（M）轉(zhuǎn)化為C5 同分異構(gòu)體α-L-古洛糖醛酸（G）。研究表明純化后的一些MC5Es 能在體外引入G 片段，并進(jìn)一步增加褐藻膠中的G 殘基含量，經(jīng)驗(yàn)證AlgE2 在特定的褐藻膠中將G 殘基相對含量從初始值（0～45%）提高到約70%[123]。而AlgE6 和AcAlgE1 甚至可以將G 殘基相對含量分別提高到78%和87%[124]?？紤]到褐藻膠的理化性質(zhì)和生物活性與G/M 的含量有關(guān)，MC5E 作為一種褐藻膠修飾酶是生產(chǎn)具有特殊性質(zhì)的褐藻膠的重要工具酶。

3.1 甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶的來源及分類

MC5Es 有兩個主要的來源：真核生物來源，包括褐藻、海帶和昆布等；細(xì)菌來源，主要包括假單胞菌屬（如熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌和門多薩假單胞菌）和固氮菌屬（如圓褐固氮菌和棕色固氮菌）[124]。不同物種中的MC5Es 具有不同的數(shù)量、類型和特征。

MC5Es 可分為Ca2+依賴亞型和Ca2+非依賴性亞型。例如丁香假單胞菌中的PsmE、圓褐固氮菌中的AcAlgE1 以及棕色固氮菌中AlgE1～7 的酶活性取決于Ca2+的存在，而丁香假單胞菌、棕色固氮菌、銅綠假單胞菌中的周質(zhì)AlgG 可以在無Ca2+條件下高效地將甘露糖醛酸轉(zhuǎn)化為古洛糖醛酸[125]。對于依賴Ca2+的MC5Es 來說，Ca2+參與中和異構(gòu)化反應(yīng)中甘露糖醛酸的電荷，而在丁香假單胞菌中的Ca2+非依賴型周質(zhì)AlgG 中一些特殊的氨基酸，如Arg345，也可以執(zhí)行同樣的功能[126]。

MC5Es 也可以分為單功能和雙功能MC5Es。例如棕色固氮菌中的AlgE2 和AlgE7 都具有差向異構(gòu)酶活性和裂解酶活性，在存在Ca2+（3.3 mmol/L）的情況下，AlgE2 可以修飾褐藻膠并使其鏈中的糖苷鍵發(fā)生斷裂，具體表現(xiàn)為催化后的褐藻膠平均相對分子質(zhì)量下降和整個褐藻膠溶液的黏度下降[123]。同樣，AlgE7 也具有與AlgE2 相同的雙功能且其裂解酶活性高于AlgE2[127]。Gawin 等也在2020 年從棕色固氮菌中鑒定出3 種褐藻膠修飾酶，其中AcAlgE2和AcAlgE3 具有裂解酶和異構(gòu)酶活性，且在體外條件下只顯示出裂解酶活性[128]。來自銅綠假單胞菌的AlgG 不僅具有異構(gòu)酶活性，而且還能保護(hù)褐藻膠不被降解[129]。來自丁香假單胞菌中Ca2+依賴的PsmE會催化褐藻膠中的M 殘基的異構(gòu)化和O-乙酰水解[125]。

3.2 甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制

棕色固氮菌產(chǎn)生的7 種分泌性差向異構(gòu)酶（AlgE1～7，AlgEs）結(jié)構(gòu)特征已經(jīng)研究清楚，AlgEs 由兩個不同的蛋白質(zhì)模塊組成，包括一個或兩個A 模塊（約385 個氨基酸）和1～7 個R 模塊（約150 個氨基酸）[123]。每個AlgE 都有一個獨(dú)特的A 和R 模塊的序列、數(shù)量和分布（見圖8），每個胞外AlgE 的最后一個R 模塊通常都有一個參與酶分泌的非結(jié)構(gòu)化多肽[130]。含有與褐藻膠和Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的A 模塊可以進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)和確定最終的異構(gòu)化反應(yīng)模式[131]。而R 模塊不具有異構(gòu)化活性，主要通過降低催化反應(yīng)對Ca2+濃度的要求，使A 模塊的催化活性提高了約10 倍[132]。除此之外，具有9 個氨基酸序列的4～7 個重復(fù)的R 模塊參與了酶的分泌和Ca2+的結(jié)合[130]。丁香假單胞菌的PsmE 具有與AlgEs 相似的A 和R 模塊，同時還具有額外的M 區(qū)、N 區(qū)和RTX 區(qū)。M 區(qū)和RTX 區(qū)都是參與Ca2+的結(jié)合，而N區(qū)是一種乙?；竅125]。此外，圓褐固氮菌中的AcAlgE1、AcAlgE2 和AcAlgE3 具有與AlgEs 相 同的模塊結(jié)構(gòu)[35]。

圖8 MC5Es 的模塊結(jié)構(gòu)Fig.8 Module structure of MC5Es

研究人員通過核磁共振方法確定了AlgE4 的結(jié)構(gòu)，AlgE4 的A 模塊折疊成一個右手平行β-螺旋，由4 個平行的β-折疊組成，包括12 個完整的匝數(shù)[133]。突變體實(shí)驗(yàn)證明，Tyr149、Asp152、His154 和Asp178 是AlgE4 活性的關(guān)鍵殘基，甘露糖醛酸的質(zhì)子化羧基可以與Asp152（或Asp178）形成氫鍵，Tyr149 作為催化堿提取與C5 結(jié)合的質(zhì)子，質(zhì)子化的His154 作為催化酸貢獻(xiàn)一個質(zhì)子對C5 進(jìn)行親核攻擊，最后形成古洛糖醛酸[133]。R 模塊形成了一個右手平行的β-膠凍卷。根據(jù)計(jì)算，A 模塊可以結(jié)合11 個糖醛酸殘基，R 模塊可以結(jié)合5 個殘基[134]。AlgE4 的結(jié)構(gòu)模型可以用于更好地理解其他AlgE1～7 結(jié)構(gòu)。

Wolfram 等解釋了來自丁香假單胞菌的AlgG的分子結(jié)構(gòu)，它折疊成右手平行β-螺旋，有11 個完整的線圈和一個不完整的線圈，其中線圈4～10 形成一個碳水化合物結(jié)合域或糖類水解結(jié)構(gòu)域[126]。

研究表明，褐藻膠裂解酶和甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶的催化機(jī)制是相似的[133]，裂解反應(yīng)和異構(gòu)化反應(yīng)都涉及3 個步驟，兩者均需要中和羧基上的負(fù)電荷，并催化提取C5 位上的質(zhì)子，兩者的反應(yīng)機(jī)理差異發(fā)生在最后一步，對于裂解酶來說，最后一步是糖苷鍵的斷裂，同時在C4 和C5 之間形成雙鍵，離開的基團(tuán)發(fā)生質(zhì)子化形成一個新的還原端。而甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶需要一個氨基酸殘基，該殘基能夠從吡喃糖環(huán)的另一側(cè)向C5 提供一個質(zhì)子，形成C5 差向異構(gòu)體。

AlgG 和AlgE4 的A 模塊的整體結(jié)構(gòu)與一些β-螺旋結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶（PL6、PL31 家族）在結(jié)構(gòu)上有相似之處，然而使用Dail 進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較結(jié)果表明，它們之間沒有任何可能表明共同進(jìn)化起源的序列同源性，并且這些褐藻膠裂解酶的催化殘基在AlgE4 中的A 模塊中并不保守[133]。異構(gòu)酶AlgE4 中的A 模塊的催化位點(diǎn)更類似于褐藻膠裂解酶A1-III（PL5 家族）和ALY-1（PL7 家族），ALY-1和A1-III 的底物結(jié)合裂縫中心的4 個催化殘基（Gln/Asn、His、Arg 和Tyr）在反應(yīng)機(jī)理中起著關(guān)鍵作用。AlgE4 中的A 模塊的活性位點(diǎn)Asp152、His154、Lys117 和Tyr149 也顯示出相同的空間排列，并且甘露糖醛酸三糖以與A1-III 中結(jié)合的三糖非常相似的方向和位置結(jié)合。盡管4 個活性位點(diǎn)氨基酸殘基的位置相似，但是其他重要?dú)埢ㄓ绕涫茿sp178）和亞位點(diǎn)-2 和-3 的環(huán)境非常不同。

AlgG 與AlgE4 的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)非常相似，活性位點(diǎn)的主要區(qū)別在于AlgE4 不包含與AlgG 中發(fā)現(xiàn)的Arg345 相當(dāng)?shù)臍埢?，而是包含參與形成AlgE4中Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的幾個酸性殘基。正如在大多數(shù)β-螺旋褐藻膠裂解酶中所發(fā)現(xiàn)的那樣，這種Ca2+在反應(yīng)過程中能夠中和糖醛酸的羧酸基團(tuán)，從而發(fā)揮與Arg345 相當(dāng)?shù)淖饔肹126]。依賴Ca2+的褐藻膠裂解酶和AlgE4 通過Ca2+中和糖醛酸上的負(fù)電荷，而不依賴Ca2+的褐藻膠裂解酶和AlgG 則使用一個精氨酸殘基來完成這個反應(yīng)[135]。在第二步催化中，精氨酸或賴氨酸通常作為裂解酶的催化堿基，而去質(zhì)子化的His319 能夠從甘露糖醛酸的C5 中提取質(zhì)子，His319 很可能在AlgG 的催化反應(yīng)中起催化堿基的作用。那么，水分子在AlgG 的催化過程中充當(dāng)催化酸，這也與前文中提到的一些具有β-螺旋結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶也有水分子作為催化酸的結(jié)論一致[126]。

對于雙功能酶AlgE7，Gaardlos 等解釋了兩種活性如何相互調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，首先異構(gòu)酶和裂解酶活性具有相同的催化位點(diǎn)，這兩種活性通過不斷改變褐藻膠鏈而相互影響，并且產(chǎn)物的形成高度依賴于酶作用于哪種底物。當(dāng)使用明確的底物poly-M和poly-MG 時，裂解酶優(yōu)先的裂解位點(diǎn)為M↓XM和G↓XM（X 為G 或M）。其中H154 在反應(yīng)中充當(dāng)催化堿，Y149 充當(dāng)催化酸，而突變體R148G 幾乎失去了所有裂解酶活性，但保留了異構(gòu)酶活性，因此推測R148 會影響Y149 將質(zhì)子提供給糖苷鍵或糖環(huán)的另一側(cè)[136]。

3.3 甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶的作用方式

關(guān)于MC5E 作用方式的報(bào)道較少，相關(guān)報(bào)道主要集中在棕色固氮菌中的AlgE 家族，目前已經(jīng)提出兩種反應(yīng)模式，即優(yōu)先攻擊模式和漸進(jìn)作用模式[137]。在優(yōu)先攻擊模式中，酶優(yōu)先攻擊鄰近G 殘基中的M 殘基，并在每次差向異構(gòu)化反應(yīng)后脫離底物[138]。而在漸進(jìn)作用模式中，由于甘露糖醛酸之間通過β-1，4 糖苷鍵連接，每個殘基相對于其相鄰殘基旋轉(zhuǎn)近180°，因此酶和多糖鏈相對移動，使得下一次異構(gòu)化反應(yīng)可以在酶與底物不解離的情況下完成[138]。有研究報(bào)道了AlgE4 的漸進(jìn)作用模式，酶沿著底物鏈進(jìn)行滑動，每隔一個殘基進(jìn)行一次異構(gòu)化，不需要發(fā)生旋轉(zhuǎn)。即底物封閉在一個相對較大的凹槽中，并且在活性位點(diǎn)的每一側(cè)都有一個夾子，該夾子封閉了聚合物并幫助其滑動[137]。而丁香假單胞菌中的AlgG 也遵循漸進(jìn)作用模式，這也是為什么假單胞菌中的褐藻膠出現(xiàn)M 和G 交替的原因[126]。此外，AlgE2 和AcAlgE1 遵循優(yōu)先攻擊模式進(jìn)行反應(yīng)，并且與底物的組成和鈣離子的濃度有關(guān)[126，128]。而其余的AlgEs 都是根據(jù)優(yōu)先攻擊模式或者兩種機(jī)制的組合進(jìn)行反應(yīng)[132]。

由于反應(yīng)模式的不同，不同的AlgEs 異構(gòu)酶所產(chǎn)生的產(chǎn)物也不同。根據(jù)報(bào)道，AlgE1 具有兩種不同的催化結(jié)構(gòu)域，一種產(chǎn)生poly-G，一種產(chǎn)生poly-MG[139]，AlgE2 和AlgE5 主要產(chǎn)生短的poly-G[140]，PsmE、AlgE6 和AcAlgE1 主要產(chǎn)生長的poly-G[140]，AlgE4 主要產(chǎn)生poly-MG[141]。人們可以利用該產(chǎn)物特點(diǎn)獲得不同類型的褐藻膠低聚糖。

3.4 甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶的酶學(xué)特性

目前已經(jīng)表征的大多數(shù)異構(gòu)酶的最適pH 在6.5～8.0，最適溫度范圍為30～40 ℃[124]。據(jù)報(bào)道，來自Pseudomonas mendocina sp.DICP-70 的PmC5A 作為裂解酶和異構(gòu)酶時的最適pH 分別為8.0 和9.0，是目前最適pH 最高的酶[142]。金屬離子影響酶活力，當(dāng)Na+濃度為100～200 mmol/L 時，AlgE1 活性最高[124]。對于AlgE2，Ca2+濃度為0.58 mmol/L 時，初始反應(yīng)速率隨Na+濃度的增加而增加，當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到3.3 mmol/L 時，Na+對異構(gòu)化反應(yīng)沒有促進(jìn)作用，而當(dāng)Na+濃度達(dá)到約20 mmol/L 時，對異構(gòu)化反應(yīng)有抑制作用[143]。對于雙功能酶AlgE7，較高的Na+濃度可降低裂解酶活性并增加poly-G 的形成，而高Ca2+濃度則提高裂解酶活性并減少poly-G 的形成[136]，因此，可以通過調(diào)節(jié)Na+與Ca2+濃度來調(diào)節(jié)AlgE7 的裂解酶活性與異構(gòu)酶活性，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。研究人員還證明在某些情況下Sr2+可以代替Ca2+，但酶的活性明顯降低[144]。

3.5 甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶的應(yīng)用

MC5E 作為一種褐藻膠修飾酶，能夠增加底物的G 殘基含量，將褐藻膠或褐藻膠寡糖升級為具有長poly-G 或poly-MG 的產(chǎn)品，該類型的產(chǎn)品表現(xiàn)出優(yōu)良的機(jī)械性能和獨(dú)特的生物活性，可以應(yīng)用于制備藥物釋放材料、用作抗菌劑、促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞增殖等方面。

1）制備具有優(yōu)異機(jī)械性能的材料 富含G 的褐藻膠分子可以通過與一些二價離子結(jié)合而形成熱穩(wěn)定的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)，形成的凝膠[145]具備一定的剛性和機(jī)械強(qiáng)度，具有低收縮、高孔隙率[146]、高穩(wěn)定性和高交聯(lián)密度等特點(diǎn)。用MC5E 調(diào)節(jié)褐藻膠分子中的G 殘基含量從而制備具有優(yōu)異機(jī)械性能的材料是一種較為簡單、可控和節(jié)能的方法。

2）制備應(yīng)用于藥物釋放的褐藻膠 褐藻膠是輸送藥物的理想材料。藥物擴(kuò)散過程的速度主要與褐藻膠分子的孔隙大小有關(guān)，研究表明，poly-G 含量較高的褐藻膠分子具有更開放的孔隙結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出較高的擴(kuò)散能力。而富含M 的褐藻膠分子是軟的，多孔性較差，并且隨著時間的推移容易脫膠[147]。因此，富含G 的褐藻膠能夠更好地保護(hù)藥物不被破壞，使其達(dá)到特定的位置并最大限度地發(fā)揮藥效。

3）增強(qiáng)褐藻膠寡糖的抗菌活性 富含G 的褐藻膠寡糖可以通過與細(xì)胞表面的結(jié)合來分解生物膜，影響表面電荷，導(dǎo)致微生物的聚集，并通過阻止微生物移動來影響致病微生物的活性并增強(qiáng)抗生素的效果，因此M/G 殘基比率低的褐藻膠寡糖表現(xiàn)出突出的抗菌活性并可以用來制備抗菌劑[148]。

4）制備促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞增殖的褐藻膠寡糖 褐藻膠和褐藻膠寡糖也可以應(yīng)用于治療脫發(fā)癥，因?yàn)樗鼈儾粌H可以作為凝膠基質(zhì)嵌入和裝載活性成分，還可以促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞增殖。其中，具有由末端還原的poly-MG 組成的褐藻膠寡糖組分是角質(zhì)形成細(xì)胞生長最有效的激活劑[149]。

4 褐藻膠乙酰化

細(xì)菌中的褐藻膠在O2/O3 位上發(fā)生乙?；?，增加了自身的水合能力和黏度，有助于聚合物作為保護(hù)膜靠近細(xì)菌并阻礙免疫細(xì)胞的運(yùn)動，同時乙?；€使褐藻膠裂解酶無法作用于M 殘基，從而保護(hù)褐藻膠不被裂解成褐藻膠寡糖。然而到目前為止還沒有發(fā)表過詳細(xì)的褐藻膠乙?；瘷C(jī)制。

4.1 褐藻膠乙?；瘷C(jī)制初步分析

目前對銅綠假單胞菌中乙酰化褐藻膠的生物合成途徑及相關(guān)基因已經(jīng)基本了解，研究表明AlgI、AlgJ 和AlgF 形成一個多蛋白質(zhì)復(fù)合體，并借助Alg8 和AlgX 形成的分泌多蛋白質(zhì)復(fù)合體與包膜上的褐藻膠發(fā)生聚合作用，進(jìn)行褐藻膠的O-乙酰化反應(yīng)過程。雖然AlgI、AlgJ 和AlgF 不是褐藻膠合成蛋白質(zhì)復(fù)合體的一部分，但它們是褐藻膠乙?；匦璧模珻hanasit 等也通過實(shí)驗(yàn)證明了這一點(diǎn)[150]。AlgI 是一種膜結(jié)合型O-乙?；D(zhuǎn)移酶，其從未知的細(xì)胞質(zhì)乙?；w通過細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移乙?；?，而AlgJ 附著在內(nèi)膜上，將乙酰基轉(zhuǎn)移到AlgX，AlgX 是甘露聚糖O-乙?；?，包含一個碳水化合物結(jié)合模塊，能夠?qū) 殘基乙?；痆151]。

研究表明乙?；潭雀叩暮衷迥z的異構(gòu)化程度較低[152]，原因可能是乙酰化酶AlgX 和周質(zhì)異構(gòu)酶AlgG 均是修飾酶復(fù)合體的一部分，可以看做是多糖底物的固定化酶，兩者均能夠結(jié)合M 殘基并進(jìn)行修飾反應(yīng)，但目前尚不清楚兩種酶在與褐藻膠的結(jié)合上是否存在競爭關(guān)系[126]。

4.2 研究乙酰化機(jī)制的意義

高乙?；衷迥z具有的黏度高、水合能力強(qiáng)、G殘基含量低等特點(diǎn)使其在組織工程開發(fā)和再生醫(yī)學(xué)中的水凝膠和支架以及含有生物活性膠囊化合物的傷口敷料等眾多材料方面具有巨大潛力[153]。

銅綠假單胞菌形成以乙酰化褐藻膠為主要成分的生物被膜，可以提高生物被膜的穩(wěn)定性，從而有助于細(xì)菌抵抗惡劣的生存環(huán)境。同時相比于浮游細(xì)菌，生物被膜內(nèi)的銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥性提高了10～1 000 倍，乙?；衷迥z是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性和細(xì)菌免疫逃逸的主要原因[154]。因此研究褐藻膠的乙?；瘷C(jī)制對于治療銅綠假單胞菌感染也具有重要意義。

5 褐藻膠脫乙?；?/h2>

乙?；暮衷迥z可以自發(fā)產(chǎn)生脫乙?；谡l件下反應(yīng)緩慢，前文中提到，胞外甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶可以催化產(chǎn)生G，而這些酶不能催化已經(jīng)乙?；臍埢?，根據(jù)對AlgE4 的晶體結(jié)構(gòu)的分析表明這是由于空間位阻的限制，因此，為了獲得高G 含量的褐藻膠，需要對已經(jīng)乙?；臍埢M(jìn)行去乙?；?。

目前還沒有發(fā)現(xiàn)假單胞菌能夠產(chǎn)生連續(xù)G 殘基的褐藻膠，但是人們在丁香假單胞菌中發(fā)現(xiàn)了一種分泌性甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶PsmE，該酶能夠在體外催化生成連續(xù)的G 殘基聚合物，PsmE 能夠催化乙?；孜镞M(jìn)行差向異構(gòu)化反應(yīng)，是一種具有脫乙酰基和C5 差向異構(gòu)功能的雙功能酶，使得菌株產(chǎn)生的褐藻膠具有較低乙?；鶖?shù)量和較高G 殘基含量的特性[125]。

6 展 望

盡管目前已經(jīng)表征了大量的褐藻膠裂解酶，特別是對于來自海洋細(xì)菌中的酶，但對極端環(huán)境中的裂解酶知之甚少，一些新發(fā)現(xiàn)的褐藻膠裂解酶表現(xiàn)出的新穎的酶學(xué)性質(zhì)和作用機(jī)制也沒有得到清晰地解釋?？v觀近年來發(fā)表的關(guān)于褐藻膠裂解酶分子改造的相關(guān)文章，對酶的改造仍舊需要建立在對酶結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制分析的基礎(chǔ)上。因此現(xiàn)下仍舊迫切需要篩選、克隆和表征新型褐藻膠裂解酶并解析其酶學(xué)性質(zhì)，了解褐藻膠裂解酶的調(diào)控機(jī)制。同時隨著褐藻膠裂解酶在生物工業(yè)上應(yīng)用的深入，迫切需要利用固定化和分子改造等手段以改善酶的催化效率、特殊性能和產(chǎn)量，以滿足其日益增加的商業(yè)需求。

MC5E 作為一種生物工具酶在生產(chǎn)褐藻膠及具有特殊M/G 殘基比率和序列分布的褐藻膠寡糖方面具有重要意義，至今人們已經(jīng)分離和表征了幾種具有不同性質(zhì)的MC5Es 并根據(jù)其晶體結(jié)構(gòu)初步闡明了其催化機(jī)制，但對于MC5Es 的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)制還需要進(jìn)一步探索與研究。由于已知天然MC5Es 的熱穩(wěn)定性和催化效率并不理想，因此，需要通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、定點(diǎn)突變以及DNA 修飾等方式提高酶的催化活性和酶學(xué)性質(zhì)，推動MC5Es 的工業(yè)化應(yīng)用。

褐藻膠修飾酶作為一種生物技術(shù)工具表現(xiàn)出了重要的生物活性和應(yīng)用價值。目前人們在褐藻膠裂解酶和甘露聚糖C5 差向異構(gòu)酶上的研究較深，而對于褐藻膠乙?；兔撘阴；牧私馍形瓷钊?。隨著結(jié)構(gòu)分析技術(shù)不斷發(fā)展，對褐藻膠修飾酶作用機(jī)制和條件的不斷深入了解，可以利用各種酶的產(chǎn)物特性進(jìn)行配合生產(chǎn)目標(biāo)褐藻膠分子，滿足不同的商業(yè)功能需求。