韓 雪，王鈺璐，于海燕，辛鳳姣

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

木質(zhì)纖維素是一種重要的可再生生物質(zhì)資源，因其清潔性及儲(chǔ)量豐富的特點(diǎn)已成為潛在的規(guī)?；a(chǎn)生物燃料及高附加值生物基產(chǎn)品的原料[1]。但是，天然木質(zhì)纖維素的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)都十分復(fù)雜，需利用多種糖類水解酶共同作用，才能對其進(jìn)行有效的生物降解[2]。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)由3 種主要成分組成，即纖維素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%～60%）、半纖維素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%～40%）和木質(zhì)素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～25%）等[3]。半纖維素是一組非纖維素異質(zhì)多糖的總稱，由戊糖（木糖和阿拉伯糖）、己糖（甘露糖、葡萄糖和半乳糖）和糖酸（甲基葡糖醛酸）等組成[4]。根據(jù)其主鏈中存在的主要單糖進(jìn)行分類，包括木聚糖、木葡聚糖、甘露聚糖、葡甘聚糖以及β-葡聚糖等[5]。

木聚糖是半纖維素中含量最豐富的成分，相對而言利用率較低，因此其作為可持續(xù)產(chǎn)品開發(fā)的重要生物資源而備受關(guān)注[6]。木聚糖廣泛存在于秸稈、麥麩、玉米芯、甘蔗渣、果蔬等農(nóng)副產(chǎn)品加工殘余物中。木聚糖酶解產(chǎn)生木糖、木寡糖、阿拉伯糖、阿魏酸等多種生理活性成分，廣泛應(yīng)用于功能性食品、飲料、烘焙等食品行業(yè)中。并且，以木糖等酶解產(chǎn)物為前體可進(jìn)一步合成木糖醇、阿拉伯糖醇、香蘭素等食品添加劑[7]。木聚糖大多為異質(zhì)結(jié)構(gòu)，由β-D-吡喃木糖基組成主鏈，側(cè)鏈含有不同類型的取代基。因此，木聚糖高效降解往往需要多種水解酶的協(xié)同作用。其中，內(nèi)切木聚糖酶通過隨機(jī)切割木聚糖內(nèi)部的木糖糖苷鍵來攻擊主鏈結(jié)構(gòu)，其產(chǎn)物木寡糖被β-木糖苷酶進(jìn)一步水解生成木糖單體。此外，木聚糖復(fù)雜的側(cè)鏈組成需要額外的側(cè)鏈水解酶，如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶等。然而，木聚糖水解過程中酶的種類和用量的高需求及降解方式的低效率導(dǎo)致多種酶投放成本較高，這也是木聚糖高效生物轉(zhuǎn)化的主要瓶頸[8]。多功能酶在一條多肽鏈中同時(shí)具備多種活性，具有“一酶多能”的特點(diǎn)。木聚糖酶解體系中多功能酶的應(yīng)用是降低成本的有效策略，此外，多功能水解酶在降解木聚糖復(fù)雜底物方面具有潛在的協(xié)同作用，因此具有廣闊的應(yīng)用前景[9]。作者將首先介紹木聚糖的結(jié)構(gòu)組成及水解酶系，進(jìn)而主要從酶的結(jié)構(gòu)與功能方面系統(tǒng)綜述多功能木聚糖水解酶的研究進(jìn)展及其在食品領(lǐng)域中潛在的應(yīng)用，最后展望該領(lǐng)域的發(fā)展前景。

1 木聚糖的結(jié)構(gòu)組成及水解酶系

1.1 木聚糖的結(jié)構(gòu)組成

木聚糖是一種復(fù)雜的異質(zhì)性多糖，根據(jù)木聚糖側(cè)鏈糖殘基的類型不同分為：同型木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯葡糖醛酸木聚糖和葡糖醛酸阿拉伯木聚糖（見圖1）[10]。同型木聚糖是一種由木糖殘基組成的非支化木聚糖，根據(jù)糖苷鍵的不同分為β-1，4-木聚糖、β-1，3-木聚糖、混合型β-1，3/1，4-木聚糖，廣泛存在于綠藻等植物中[11]；葡糖醛酸木聚糖是含有α-1，2 連接的葡糖醛酸基和4-O-甲基葡糖醛酸基取代的木聚糖，主要存在于雙子葉植物中[12]；阿拉伯木聚糖是指D-木糖殘基的C2/C3 位連有L-阿拉伯呋喃糖取代基的β-1，4-木聚糖，主要存在于谷物中[13]；其他兩種類型的木聚糖，即阿拉伯葡糖醛酸木聚糖和葡糖醛酸阿拉伯木聚糖，含有甲基葡糖醛酸殘基和L-阿拉伯呋喃糖殘基，分別連接在主鏈β-1，4-木糖殘基的C2 和C3位置，這兩個(gè)術(shù)語有時(shí)可以互換，但L-阿拉伯呋喃糖與糖醛酸的比例較低的聚合物常被稱為葡糖醛酸阿拉伯木聚糖[14]。此外，木聚糖中的L-阿拉伯呋喃糖基單元可以進(jìn)一步在C5 位被羥基肉桂酸酯（即阿魏酸和對香豆酸）取代[13]。

圖1 木聚糖的結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Structural composition of xylan

1.2 木聚糖水解酶系

木聚糖完全水解需要多種酶協(xié)同發(fā)揮作用，包括主鏈水解酶β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、還原端外切木聚糖酶，以及側(cè)鏈水解酶α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶等。由于木聚糖水解酶成員的分類、催化位點(diǎn)、作用機(jī)制等特征已有相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)[6，15-17]，在此不逐一贅述。木聚糖水解酶系存在于兩個(gè)家族：糖苷水解酶（GH）家族和碳水化合物酯酶（CE）家族（見表1）[16，18-24]。

表1 木聚糖水解酶成員及其底物特異性Table 1 Xylanolytic enzyme members and their substrate specificity

2 多功能木聚糖水解酶

2.1 多功能木聚糖水解酶概述

多功能酶在酶蛋白的一條多肽鏈中同時(shí)具有兩種或兩種以上催化活性，可催化復(fù)雜的連續(xù)反應(yīng)或多底物反應(yīng)體系。在催化過程中，可能會(huì)有多個(gè)中間狀態(tài)存在，這使得多功能酶表現(xiàn)出更高催化效率的特性。首先，第一個(gè)活性位點(diǎn)的產(chǎn)物可以主動(dòng)或被動(dòng)地直接通過底物通道轉(zhuǎn)移到另一個(gè)活性中心，通道的“門控”作用有助于維持多個(gè)活性部位反應(yīng)的精確同步，以最大限度地減少中間體的積累；其次，第一個(gè)反應(yīng)的活性位點(diǎn)的狀態(tài)可能影響第二個(gè)反應(yīng)的活性位點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)特性，反之亦然[25-26]。同時(shí)，多功能酶往往具有良好的調(diào)控性，能夠在不同催化條件下表現(xiàn)出不同的活性。多功能酶在進(jìn)化上是由編碼功能相關(guān)的基因融合而形成。推測復(fù)雜的多功能酶是由簡單的單功能酶進(jìn)化而來，催化活性相關(guān)的基因可以由共同的調(diào)控元件控制[27-28]。

木聚糖是一種復(fù)雜的異質(zhì)性多糖，其多種側(cè)鏈取代基的存在會(huì)形成空間位阻，使木聚糖難以被完全降解且酶解效率較低。因此，需要多酶協(xié)同催化來消除側(cè)鏈的阻礙作用，使木聚糖主鏈更容易接近木聚糖酶的活性中心，進(jìn)而提高木聚糖的降解效率[8，29]。然而，不同單酶的催化特性之間存在差異，且多酶催化體系在實(shí)際應(yīng)用中往往面臨著成本高、工藝復(fù)雜、重復(fù)利用率低等諸多挑戰(zhàn)，因此，多功能酶對于低成本、高效木聚糖酶解體系的構(gòu)建具有重要意義。根據(jù)結(jié)構(gòu)域與催化功能的特點(diǎn)，木聚糖水解酶系主要分為兩類：1）單催化結(jié)構(gòu)域的多功能木聚糖水解酶，一條多肽鏈上僅有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，可通過一個(gè)或多個(gè)活性中心/位點(diǎn)催化不同的反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮多種作用，部分包含其他的輔助結(jié)構(gòu)域（如碳水化合物結(jié)合模塊[CBM]、纖維連接蛋白III[Fn3]等）對催化結(jié)構(gòu)域的功能起調(diào)控作用；2）多催化結(jié)構(gòu)域的多功能木聚糖水解酶，一條多肽鏈上存在多個(gè)催化結(jié)構(gòu)域模塊，各自具有不同的活性中心，不同結(jié)構(gòu)域之間由柔性連接區(qū)（linker）或其他非催化結(jié)構(gòu)域相連（見圖2）。

圖2 多功能木聚糖水解酶分類Fig.2 Classification of multifunctional xylanolytic enzyme

2.2 單催化結(jié)構(gòu)域的多功能木聚糖水解酶

這一類多功能木聚糖水解酶僅含有一個(gè)獨(dú)立的催化結(jié)構(gòu)域催化不同的底物反應(yīng)。根據(jù)其活性位點(diǎn)的位置，進(jìn)一步可細(xì)分為單活性位點(diǎn)型、多活性位點(diǎn)型多功能木聚糖水解酶。

2.2.1 單活性位點(diǎn)型多功能木聚糖水解酶 單活性位點(diǎn)型多功能木聚糖水解酶在單一結(jié)構(gòu)域中具有底物識別的泛雜性（promiscuity），通過相同的活性中心殘基催化不同的底物。根據(jù)CAZy 數(shù)據(jù)庫分析，具有多種底物特異性的木聚糖水解酶家族主要包括GH3、5、7、9、10、11、13、30、31、43、44、48 等。例如，GH30 家族的多功能木聚糖水解酶來自亞家族7，包括內(nèi)切葡糖醛酸木聚糖酶和外切木二糖水解酶。該類酶的雙功能分子機(jī)制已得到解析。Nakamichi 等報(bào)道解纖維素藍(lán)狀菌（Talaromyces cellulolyticus）來源的TcXyn30B 能夠有效地將葡糖醛酸木聚糖轉(zhuǎn)化為低聚木糖，進(jìn)一步在低聚木糖的非還原端切割釋放木糖單體[30-31]。與GH30 亞家族8來源的單功能葡糖醛酸木聚糖酶結(jié)構(gòu)相比，TcXyn30B（PDB：6IUJ）中保守的Arg46 用于識別葡糖醛酸基側(cè)鏈，對于內(nèi)切木聚糖酶的活性十分關(guān)鍵；而活性中心附近的額外插入片段β2～α2 柔性環(huán)（loop）上的Asn93 用于識別低聚木糖的非還原端，對于外切木二糖水解酶活性很重要（見圖3）。類似地，Nikolaivits 等解析 了嗜熱 毀絲霉 菌（Thermothelomyces thermophila）來源的TtXyn30A及與產(chǎn)物復(fù)合體（PDB：7O0E）的晶體結(jié)構(gòu)，該酶含有GH30 家族典型的TIM 桶型催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)由9 條β 鏈組成的較小結(jié)構(gòu)域（β9 結(jié)構(gòu)域）[32]。β9 結(jié)構(gòu)域中的第一條β 鏈位于催化結(jié)構(gòu)域的N 端，而其余8 條β 鏈位于C 端，表明該結(jié)構(gòu)域?qū)τ诖呋Y(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定折疊十分關(guān)鍵。生化分析表明該結(jié)構(gòu)域不能與所測定的多糖結(jié)合，其功能還有待闡明。與TcXyn30B 相比，TtXyn30A 中同樣存在額外的插入片段，對于木二糖水解酶活性很重要，而保守的Arg34 盡管對酶活力很重要，但并不直接介導(dǎo)與葡糖醛酸基側(cè)鏈的識別，這與其他已報(bào)道的GH30 木聚糖水解酶不同。該研究不僅拓展了GH30 雙功能木聚糖水解酶的生物技術(shù)應(yīng)用，還為研究單功能酶轉(zhuǎn)變?yōu)槎喙δ苊傅姆肿記Q定因素提供了一個(gè)良好的范例。GH43 家族主要作用于木聚糖側(cè)鏈，發(fā)揮β-木糖苷酶和（或）阿拉伯呋喃糖苷酶功能，部分成員具有多功能性。Liu 等報(bào)道了來源于短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus TCCC 11350）的嗜冷酶rXYL，同時(shí)具有木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶兩種活性。序列比對顯示rXYL 包含木糖苷酶保守的催化氨基酸Asp14、Asp127、Arg287。該酶在30 ℃活力最高，在4 ℃和0 ℃條件下分別維持其最大活力的26%和18%，且具有相對較強(qiáng)的木糖耐受性。此外，rXYL與內(nèi)切木聚糖酶在低溫下連續(xù)或同時(shí)降解山毛櫸木聚糖顯示出較高的協(xié)同效應(yīng)（分別為11.14 倍和16.21 倍）[33]。然而，該酶識別木糖苷和阿拉伯呋喃糖苷底物的分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步探索。Basit 等報(bào)道了嗜熱毀絲霉菌（Thermothelomyces thermophila）來源的TtXy43，僅含有單獨(dú)的GH43 家族催化結(jié)構(gòu)域，但同時(shí)具有內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶3 種活性，可以將木聚糖高效降解生成木糖單體[34]。具有的3 種活性共用相同的催化氨基酸Asp134 和Glu228，并且3 種活性在相似的催化條件下發(fā)揮功能。結(jié)構(gòu)模擬和分子對接顯示，TtXyn43 的活性位點(diǎn)形成狹長的底物結(jié)合口袋以容納較長的木聚糖底物進(jìn)入，Glu176、Asp85 和Asp38 對于底物識別起到關(guān)鍵作用。Rohman 等報(bào)道了喜熱噬油芽孢桿菌（Geobacillus thermoleovorans IT-08）來源的Xyl，含有GH43 家族催化結(jié)構(gòu)域和β-三明治輔助結(jié)構(gòu)域，同時(shí)具有β-木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的活性，兩種活性共用相同的催化氨基酸Asp14 和Glu177[35]。通過解析Xyl 單體（PDB：5Z5D）及其與產(chǎn)物復(fù)合體（PDB：5Z5I）結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該酶的活性中心位于催化結(jié)構(gòu)域漏斗狀中心空腔，可以容納木糖和阿拉伯糖兩個(gè)糖基單元，分別位于底物結(jié)合口袋-1 和+1 亞位點(diǎn)。Asp121、His238、Arg269 對于識別阿拉伯糖基發(fā)揮重要的作用，保守的Glu198 對于識別木糖基起著重要的作用。此外，其他GH 家族的單催化結(jié)構(gòu)域多功能木聚糖水解酶的作用機(jī)制也有一定的報(bào)道。例如，Tong 等報(bào)道了嗜熱細(xì)菌（Dictyoglomus turgidum）來源的GH3 家族木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶Dt-2286，序列比對得出其催化氨基酸為Asp276 和Glu507[36]。重組Dt-2286 在搖瓶大腸桿菌中β-木糖苷酶的表達(dá)量高達(dá)270 U/mL，該酶的最適反應(yīng)條件為pH 5.0、98 ℃，且該酶具有較高的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑的耐受性，與內(nèi)切木聚糖酶協(xié)同作用于木聚糖，可釋放高達(dá)15.08 倍的還原糖。Bouraoui 等從突尼斯溫泉細(xì)菌中分離出僅含有GH51 家族催化結(jié)構(gòu)域多功能酶THSAbf，該酶對pNPAf 具有較高活力（kcat/Km=1 050 L/（mmol·s）），且可以水解樺木和山毛櫸中的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖及甜菜來源的線性及分支阿拉伯聚糖[37]。阿拉伯呋喃糖苷酶和內(nèi)切木聚糖酶的催化氨基酸相同（Glu177 和Glu296），且兩種活性在60 ℃下和較寬的pH 范圍（pH 4.0～7.0）內(nèi)較為穩(wěn)定。結(jié)構(gòu)模擬和分子對接發(fā)現(xiàn)，THSAbf 具有較寬的活性位點(diǎn)裂縫用于發(fā)揮多種功能。此研究對簡化及構(gòu)建成本低、效率高的木聚糖水解酶復(fù)配體系具有重要的意義。

圖3 TcXyn30B 的晶體結(jié)構(gòu)Fig.3 Crystal structure of TcXyn30B

Hameleers 等從海貍糞便基因組中鑒定到雙功能乙酰木聚糖酯酶/阿魏酸酯酶BD-FAE，僅包含單獨(dú)的CE 結(jié)構(gòu)域，被歸類于一個(gè)新的具有廣泛底物特異性的酯酶家族[38]。該酶不僅水解樺木來源的乙酰葡糖醛酸木聚糖（AcGX）釋放乙酸，發(fā)揮乙酰木聚糖酯酶功能；還能從玉米纖維來源的乙酰基和阿魏?；叨热〈牡途勰咎牵ˋcFaXOS）中釋放阿魏酸，發(fā)揮阿魏酸酯酶功能。BD-FAE 的晶體結(jié)構(gòu)（PDB：6TKX）顯示其采取典型的α/β 水解酶折疊構(gòu)象，活性中心包含保守的催化三聯(lián)體Ser128、Asp237、His269?；钚晕稽c(diǎn)附近存在一個(gè)暴露于溶劑中的較淺凹槽，在空間上可以與高度取代的較大底物結(jié)合。此外，Dilokpimol 等研究了10 種真菌來源的新型CE1 酶，其中，CE1 亞家族2 的瘤孢棒囊孢殼（Corynascus sepedonium）Fxe1和嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）FxeA 以及CE1 亞家族5 的球毛殼菌（Chaetomium globosum）Fxe1 具有阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶雙重活性，能夠從小麥阿拉伯木聚糖中同等程度地釋放乙酸和阿魏酸[39]。結(jié)構(gòu)模擬顯示催化位點(diǎn)附近的氨基酸變化可能決定其不同的底物識別特異性：具有嚴(yán)格乙酰木聚糖酯酶活性CE1 亞家族1 中保守的Trp，在具有雙功能的CE1 亞家族2 中被較小側(cè)鏈的殘基（Ala、Pro、Ser、Thr 等）取代，允許其在催化位點(diǎn)結(jié)合較大的底物阿魏酸；而與同家族的阿魏酸酯酶相比，CE1 亞家族5 的CgFxe1 存在獨(dú)特的Thr226 可能與乙?；纬上嗷プ饔?，從而促進(jìn)其雙重活性。

此外，還有一些單活性位點(diǎn)單催化結(jié)構(gòu)域水解酶不僅降解木聚糖，還能催化其他多糖底物水解。例如，Wang 等從木聚糖降解菌株芽孢桿菌（Bacillus sp.KW1）中鑒定出GH10 家族耐熱酶XynA，該酶不僅可以水解木聚糖類底物，而且對微晶纖維素、羧甲基纖維素（CMC）、對硝基苯纖維二糖苷（pNPC）、對硝基苯基吡喃葡萄糖苷（pNPG）等纖維素類底物具有水解活性[40]。Phakeenuya 等報(bào)道了來源于解凝乳類芽孢桿菌（Paenibacillus curdlanolyticus B-6）的GH9 家族的 多功能 酶PcMulGH9，具有廣泛水解纖維素、甘露聚糖、木聚糖中β-1，4 糖苷鍵的能力[41]。Liu 等報(bào)道了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis BS-5）來源的GH13 家族α-淀粉酶/內(nèi)切葡聚糖酶/內(nèi)切木聚糖酶BSGH13[42]，以及Han 等報(bào)道了嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）來源的GH7 家族具有纖維二糖水解酶和木聚糖酶活性的耐熱酶Ctcel7 等[43]。此類多功能酶具有多種復(fù)雜底物的降解能力，對其適應(yīng)條件和作用機(jī)理的研究為工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2.2.2 多活性位點(diǎn)型多功能木聚糖水解酶 多活性位點(diǎn)型多功能木聚糖水解酶在單一催化結(jié)構(gòu)域中含有不同的催化中心，各自催化不同的反應(yīng)，具有“兼職”（moonlighting）酶的特征。與單活性位點(diǎn)型多功能木聚糖水解酶相比，這一類酶的研究較少。Cao 等報(bào)道的熱解纖維素菌（Caldicellulosiruptor lactoaceticus）來源的乙酰酯酶/木糖苷酶CLH10 是一類特殊的雙功能木聚糖水解酶[44]。在一級序列上，CLH10 的酯酶與糖苷酶保守序列片段呈混合型分布，不能被歸類于某一家族。結(jié)構(gòu)研究顯示其具有獨(dú)立的木糖苷酶和乙酰酯酶活性位點(diǎn)，分居催化結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)，互不干擾。CLH10 結(jié)構(gòu)整體（PDB：6A6O）呈現(xiàn)典型的酯酶構(gòu)象，具有保守的催化三聯(lián)體，在其背側(cè)的柔性環(huán)偶然進(jìn)化形成一個(gè)糖苷酶活性中心，從而實(shí)現(xiàn)對乙酰酯和木糖苷底物的識別與催化。該研究顯示位于蛋白質(zhì)表面的環(huán)狀區(qū)可以作為蛋白質(zhì)工程潛在位點(diǎn)，用于設(shè)計(jì)和產(chǎn)生具有新型多功能酶催化劑（見圖4）。此外，Shahid 等從嗜酸纖維素分解菌（Acidothermus cellulolyticus 11B）中挖掘到GH10 家族的內(nèi)切木聚糖酶/阿拉伯呋喃糖苷酶/乙酰木聚糖酯酶XynB，能夠水解多種木聚糖天然底物產(chǎn)生木糖、木二糖、阿拉伯糖、乙酸[45]。該酶包含一個(gè)GH10 催化結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBM2、CBM3，與不溶性木聚糖相比，兩個(gè)CBM 的存在使其對膠體微晶纖維素具有更高的結(jié)合力。該酶在70 ℃和pH 6.0 時(shí)具有最佳活性，且在高達(dá)70 ℃時(shí)保持穩(wěn)定。這些特性使其具有極大的工業(yè)化應(yīng)用潛力。然而，該酶通過單一GH10 結(jié)構(gòu)域催化糖苷鍵和酯鍵水解的分子機(jī)制尚不清楚，亟待深入探索。

圖4 CLH10 的晶體結(jié)構(gòu)Fig.4 Crystal structure of CLH10

2.3 多催化結(jié)構(gòu)域的多功能木聚糖水解酶

這一類多功能木聚糖水解酶典型特征為含有多個(gè)催化結(jié)構(gòu)域模塊，不同的催化結(jié)構(gòu)域通過各自的催化位點(diǎn)執(zhí)行不同的功能，不同催化結(jié)構(gòu)域之間與其他結(jié)構(gòu)域或柔性環(huán)構(gòu)成的連接區(qū)相連。多催化結(jié)構(gòu)域多功能木聚糖水解酶大多包含GH 和CE 催化結(jié)構(gòu)域，可以同時(shí)水解糖苷鍵與酯鍵。Yang 等從產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum P33）中挖掘到含CE1 和GH62 催化結(jié)構(gòu)域的雙功能乙酰木聚糖酯酶/阿拉伯呋喃糖苷酶PcAxe，兩種酶在相似條件下發(fā)揮功能，最適pH 均為7.0，乙酰木聚糖酯酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的最適溫度分別為40 ℃和50 ℃，且在廣泛pH 范圍下穩(wěn)定，并具有金屬離子耐受性[46]。PcAxe 與重組木聚糖酶協(xié)同水解脫木質(zhì)素玉米秸稈，協(xié)同度高達(dá)1.35，且用等量的PcAxe 代替商用纖維素酶，脫木質(zhì)素玉米秸稈中葡萄糖的釋放量提高了51%，顯示出較高的纖維素水解效率，表明該酶具有良好的應(yīng)用前景。類似地，Mroueh 等從解纖維梭菌（Ruminiclostridium cellulolyticum）中挖掘到阿拉伯呋喃糖苷酶/乙酰木聚糖酯酶（GH62-CE6-1240）[47]。該酶包含GH62 和CE6 雙催化結(jié)構(gòu)域，可催化不溶性小麥阿拉伯木聚糖的脫乙?；桶⒗腔乃猓覍Π⒗厶牵↖ 型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖的一種成分）也有活性，表明其參與了果膠的降解。因此，GH62-CE6-1240 在植物細(xì)胞壁多糖的降解中起關(guān)鍵作用。Wang 等從高效降解玉米秸稈的細(xì)菌菌群EMSD5 中挖掘到雙功能內(nèi)切木聚糖酶/阿魏酸酯酶rXyn10A/Fae1A，可以同時(shí)作用于木聚糖的主鏈和側(cè)鏈[48]。該酶包含GH10 和CE1 雙催化結(jié)構(gòu)域和CBM2 和CBM13 碳水化合物結(jié)合模塊。兩種酶的最適溫度均為50 ℃，木聚糖酶和阿魏酸酯酶的最適pH 分別為6.0 和7.0，兩種酶均在較寬的pH 范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。生化分析顯示，僅含有CE1 催化結(jié)構(gòu)域的截短體具有較低的阿魏酸酯酶活性，而同時(shí)含有CE1-GH10 催化結(jié)構(gòu)域的截短體使阿魏酸的產(chǎn)量顯著增加，但僅為全長蛋白質(zhì)產(chǎn)阿魏酸總量的78%，表明處在同一多肽鏈上的不同催化結(jié)構(gòu)域?qū)Π⑽核岬尼尫啪哂蟹肿觾?nèi)協(xié)同效應(yīng)。rXyn10A/Fae1A 能夠從農(nóng)業(yè)廢棄物中產(chǎn)生高達(dá)2.78 mg/g 的阿魏酸和160.5 mg/g 的木糖/低聚木糖，顯示出巨大的應(yīng)用潛力。Kmezik 等從多毛擬桿菌（Bacteroides eggerthii）多糖利用位點(diǎn)（PUL）27 中鑒定到含雙催化結(jié)構(gòu)域CE15 和GH8 的葡糖醛酸酯酶/外切木聚糖酶BeCE15A-Rex8A，酶學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，N 端的CE15 葡糖醛酸酯酶結(jié)構(gòu)域?qū)ζ咸侨┧狨ッ福℅E）模式底物活性較差，可能與活性位點(diǎn)附近關(guān)鍵氨基酸的替換有關(guān)；而C 端GH8 外切木聚糖酶結(jié)構(gòu)域可以從低聚木糖的還原端釋放木糖單體，但對較長的木聚糖鏈沒有活性。全長蛋白質(zhì)和單獨(dú)GH8 結(jié)構(gòu)域分別與商用GH11 木聚糖酶協(xié)同催化玉米芯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木寡糖的含量均得到了明顯的提升，但并未觀察到兩個(gè)結(jié)構(gòu)域間的協(xié)同效應(yīng)[49]。該研究報(bào)道的CE15-GH8 的結(jié)構(gòu)域組成非常罕見，同時(shí)強(qiáng)調(diào)了針對PUL 的基因挖掘?qū)τ诎l(fā)現(xiàn)新酶類型與結(jié)構(gòu)具有重要意義。Pereira 等從人體腸道結(jié)腸擬桿菌中挖掘到阿魏酸酯酶/乙酰酯酶Bi1040-FAE，能夠從阿魏酰酯化的寡糖、去淀粉麥麩、不溶性小麥阿拉伯木聚糖中釋放阿魏酸，也可以水解乙?；帑溎揪厶轻尫乓宜醄50]。由于該酶的表達(dá)量較低，通過序列比對獲得了多毛擬桿菌來源的BeGH43/FAE。該酶N 端為GH43 家族融合蛋白質(zhì)序列，具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性；C 端為Bi1040-FAE 同源蛋白質(zhì)，具有乙酰酯酶和阿魏酸酯酶的活性。結(jié)構(gòu)解析（PDB：6LMY）顯示，BeGH43/FAE 的GH43 結(jié)構(gòu)域具有典型的五葉片β-螺旋槳結(jié)構(gòu)和β-三明治型結(jié)構(gòu)，活性中心具有保守的催化氨基酸Asp149 和Asp38；酯酶結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)保守的α/β 水解酶折疊構(gòu)象，具有保守的催化三聯(lián)體Ser634、His774、Asp742（見圖5）。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示BeGH43/FAE 的酯酶結(jié)構(gòu)域具有較大的底物結(jié)合口袋和更高的底物可及性，可以容納較大的阿魏酸酯類底物。這類融合阿拉伯呋喃糖苷酶和酯酶活性的多結(jié)構(gòu)域多功能酶可以提高復(fù)雜阿拉伯木聚糖的降解效率，有助于腸道菌降解膳食纖維釋放阿魏酸。

圖5 BeGH43/FAE 的晶體結(jié)構(gòu)Fig.5 Crystal structure of BeGH43/FAE

具有多個(gè)CE 催化結(jié)構(gòu)域的木聚糖水解酶也有報(bào)道。Kmezik 等報(bào)道了營發(fā)酵單胞菌（Dysgonomonas mossii）來源的雙功能乙酰酯酶/阿魏酸酯酶DmCE1B，含有兩個(gè)CE1 催化結(jié)構(gòu)域和中間的CBM48 結(jié)構(gòu)域[51]。生化研究顯示，包含N 端CE1和CBM48 的截短體（DmCE1B_nt）同時(shí)具有乙酰酯酶和阿魏酸酯酶的活性，與全長蛋白質(zhì)活性相似；而C 端CE1 和CBM48 截短體（DmCE1B_ct）僅具有較低的阿魏酸酯酶活性。DmCE1B_ct（PDB：7B5V）的結(jié)構(gòu)解析顯示，其具有10 鏈組成的β-三明治型CBM48 結(jié)構(gòu)域和酯酶典型的α/β 水解酶折疊結(jié)構(gòu)，中間由一個(gè)較短的10 個(gè)氨基酸組成的連接區(qū)相連。酯酶保 守的催 化三聯(lián) 體（Ser542、His638、Glu606）位于CE1 和CBM48 結(jié)構(gòu)域之間的凹槽中，底物阿魏酸甲酯位于活性中心凹槽的邊緣，與催化絲氨酸距離較遠(yuǎn)。然而，由于全長及具有雙重活性的DmCE1B_nt 的結(jié)構(gòu)尚未報(bào)道，該酶實(shí)現(xiàn)雙功能的分子基礎(chǔ)以及不同結(jié)構(gòu)域?qū)θL蛋白質(zhì)的調(diào)控機(jī)制并不清楚，有待進(jìn)一步探索。

此外，Kmezik 等也從卵形擬桿菌（Bacteroides ovatus）和約氏黃桿菌（Flavobacterium johnsoniae）中鑒定到兩種具有相似結(jié)構(gòu)域組成的酯酶，包含N 端的CE6 結(jié)構(gòu)域和C 端的CE1 結(jié)構(gòu)域[52]。其中CE6表現(xiàn)出乙酰酯酶活性，而CE1 表現(xiàn)出阿魏酸酯酶活性。這兩種酶可以顯著提高商用木聚糖酶水解玉米芯（接近2 倍）和日本山毛櫸（超過20 倍）的能力。并且，與添加兩個(gè)分離的單催化結(jié)構(gòu)域相比，全長蛋白質(zhì)協(xié)同商用木聚糖酶水解天然木聚糖底物的能力顯著提升，表明兩個(gè)酯酶結(jié)構(gòu)域之間存在分子內(nèi)協(xié)同作用，這種協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)的分子機(jī)制尚待闡明。此類多功能酶是改善生物質(zhì)有效降解的重要工具，在食品、飼料、造紙等工業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

此外，還有一些研究著重分析催化結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)或其他結(jié)構(gòu)域?qū)γ复呋δ艿挠绊?。例如，Krska 等從極端嗜熱厭氧菌（Caldicellulosiruptor kristjanssonii）中挖掘到多模塊嗜熱雙功能酶CkXyn10C-GE15A，該酶包含N 端的兩個(gè)CBM22、內(nèi)切木聚糖酶和葡糖醛酸酯酶催化結(jié)構(gòu)域和中間的3 個(gè)CBM9，以及C 端的鈣黏素結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)SLH 結(jié)構(gòu)域[53-54]。兩種酶活性的最適反應(yīng)條件存在差異，且兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域混合催化天然木聚糖底物時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)明顯的協(xié)同效應(yīng)。5 個(gè)碳水化合物結(jié)合模塊對不溶性多糖、可溶性多糖、低聚糖具有不同的底物偏好性，并對催化結(jié)構(gòu)域的活性和熱穩(wěn)定性起促進(jìn)作用。Holck 等從廢水處理的污泥基因組中鑒定出一種含有3 個(gè)催化結(jié)構(gòu)域的阿魏酸酯酶/阿拉伯呋喃糖苷酶/內(nèi)切木聚糖酶CE1-GH62-GH10，該酶發(fā)揮3 種功能時(shí)的催化條件存在差異：以不溶性小麥阿拉伯木聚糖為底物測定的GH62、GH10 的最適溫度為45 ℃，CE1 的最適溫度為35 ℃；GH10的最適pH 范圍較寬泛（pH 3.0～8.0），GH62 最適pH 7.0～9.0，CE1 最適pH 10.0～11.0[55]。值得注意的是，全長蛋白質(zhì)與單催化結(jié)構(gòu)域的等摩爾混合體系相比活性相當(dāng)，但熱穩(wěn)定性有一定提高；GH62-GH10對底物的催化效率比單獨(dú)的GH10 高2.5 倍，而CE1 需要在GH10 存在的情況下從底物中釋放阿魏酸。幾種多功能木聚糖水解酸特性見表2。

表2 多功能木聚糖水解酶的特性Table 2 Properties of multifunctional xylanolytic enzyme

續(xù)表2

3 多功能木聚糖水解酶在食品領(lǐng)域的潛在應(yīng)用

隨著人們對安全和健康食品需求的不斷增加，研發(fā)功能性食品成為了關(guān)注的焦點(diǎn)。木聚糖是半纖維素的主要成分，存在于水果和蔬菜的初級細(xì)胞壁和膳食纖維中[56-57]，對果汁澄清和面包加工產(chǎn)生影響，可以加入木聚糖水解酶進(jìn)行改善，從而獲得澄清度和營養(yǎng)成分更高的果汁和蓬松度、口感更好的面包。此外，酶解木聚糖可獲得益生元低聚木糖，作為功能性食品添加劑，具有可降低血液膽固醇、增加鈣吸收、抗氧化、維持胃腸道健康、降低結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)等功能。以下詳細(xì)綜述了木聚糖水解酶在食品領(lǐng)域的研究進(jìn)展和發(fā)展前景。

3.1 果汁澄清

自從確定了果汁的營養(yǎng)價(jià)值以來，果汁已成為各年齡段人群中流行的健康飲品，制備優(yōu)質(zhì)、有益健康的果汁已成為商業(yè)食品行業(yè)的焦點(diǎn)。任何果汁的制備都涉及3 個(gè)步驟，包括提取、果汁澄清和穩(wěn)定化。然而，商業(yè)果汁生產(chǎn)的主要障礙是半纖維素的存在導(dǎo)致果汁澄清度和產(chǎn)量低、果汁濃縮和巴氏殺菌困難以及商業(yè)市場可接受度低。因此，食品公司一直在大力研究果汁澄清的方法從而改善其外觀以及延長儲(chǔ)存時(shí)間[58]。早期果汁澄清僅依靠物理和化學(xué)方法或超濾技術(shù)去除半纖維素，但這些方法無法達(dá)到令人滿意的澄清水平，進(jìn)而有研究發(fā)現(xiàn)酶法是提高果汁澄清度的最有效方法。其中，在果汁中加入內(nèi)切木聚糖酶可有效降解果汁中的多糖，從而提高果汁的澄清度和香氣，延長包裝產(chǎn)品的貯藏壽命。有研究者從日本曲霉（Aspergillus japonicus）中提純了內(nèi)切木聚糖酶（UFMS 48.136），并成功利用該酶對芒果汁、香蕉汁、橙汁、菠蘿汁和蜜橘汁進(jìn)行了澄清處理，其澄清度分別達(dá)到51.11%、9.99%、2.66%、6.11%和8.54%[59]。此外，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也可用于果汁的澄清，彭程等將黑曲霉（Aspergillus niger）來源的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶加入柚子汁中，其澄清度提高了15.18%[60]。有研究者研究了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和商用內(nèi)切木聚糖酶的協(xié)同加入對蘋果汁、葡萄汁、橙汁和桃汁的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與兩酶單獨(dú)處理相比，兩酶協(xié)同加入可提高果汁的產(chǎn)量和澄清度[61]。因此，木聚糖水解酶在果汁澄清中發(fā)揮著重要的作用，且兩個(gè)單功能木聚糖水解酶在果汁澄清中具有協(xié)同作用，但加入兩種酶成本較高，且不同酶的作用條件可能存在差異，操作困難。因此，在果汁加工中，多功能木聚糖水解酶的應(yīng)用將是未來的發(fā)展趨勢，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 烘焙

目前，食品公司投入了大量精力以開發(fā)高質(zhì)量感官的健康產(chǎn)品。例如，在烘焙產(chǎn)品方面，使用酶代替化學(xué)品是改善面包黏度、質(zhì)地和風(fēng)味的有效途徑。在烘焙加工中，全麥面粉中麩皮的存在會(huì)導(dǎo)致面筋蛋白稀釋，從而降低面團(tuán)和面包的一些關(guān)鍵質(zhì)量屬性，例如面包體積、顏色、質(zhì)地和味道等。阿拉伯木聚糖是位于小麥胚乳中的非淀粉多糖，占面粉的0.4%～0.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。雖然質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低，但其具有高吸水性，是影響面團(tuán)發(fā)酵和面包口感等的重要因素。內(nèi)切木聚糖酶可隨機(jī)催化阿拉伯木聚糖主鏈的木糖殘基間的共價(jià)鍵，降低平均聚合度，從而改變面團(tuán)的流變特性、面包的比容和面包屑的硬度等[62-63]。然而，阿拉伯木聚糖含有35%～40%的阿拉伯糖取代基，部分阿拉伯糖取代基含有酯鍵相連的阿魏酸，這些側(cè)鏈取代基的存在會(huì)阻礙內(nèi)切木聚糖酶對阿拉伯木聚糖主鏈的水解。因此，需要加入阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶從而提高阿拉伯木聚糖的水解效率，且釋放出低熱量的阿拉伯糖和對人體有益的阿魏酸。已報(bào)道嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）產(chǎn)生包含木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的酶混合物，這些酶混合物在長時(shí)間溫育后的固態(tài)發(fā)酵過程中釋放木糖和阿拉伯糖，從而使面包體積增加了22%，而松脆度和支鏈淀粉回生分別減少了25%和17%[64]。此外，Xue 等發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)加入木聚糖酶/阿拉伯呋喃糖苷酶相比，組合加入木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶具有更強(qiáng)的阿拉伯木聚糖水解能力，且對面團(tuán)流變性質(zhì)和品質(zhì)有協(xié)同作用[65]。

3.3 低聚木糖的制備

低聚木糖是由多個(gè)木糖單元通過β-1，4-木糖苷鍵連接而成的寡聚糖，在結(jié)構(gòu)上，低聚木糖根據(jù)構(gòu)成其化學(xué)結(jié)構(gòu)的單體數(shù)量以不同的形式存在，包括木二糖、木三糖、木四糖、木戊糖、木己糖等。根據(jù)物理化學(xué)特性，低聚木糖被歸類為不易消化的低聚糖，在寬泛的溫度范圍（最高達(dá)100 ℃）和pH 條件（pH 2.5～8.0）下具有較好的穩(wěn)定性，是糖尿病患者的功能性食品和膳食甜味劑的理想添加劑[66-68]。此外，低聚木糖可通過免疫刺激增加健康雙歧桿菌（Bifidobacterium）的數(shù)量從而改善腸道功能[69]，可能降低患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，具有益生元作用[70-71]。作為食品成分，低聚木糖具有可接受的氣味和低熱量，并且不會(huì)導(dǎo)致齲齒的生成，可用于抗肥胖飲食[72]。目前，低聚木糖的生產(chǎn)主要采用化學(xué)法及酶法等。其中，化學(xué)法是在高溫高壓下使用酸水解或堿提取獲得低聚木糖，該方法會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，如糠醛和羥甲基糠醛等，其會(huì)降低低聚木糖的益生元特性[73]。然而酶法生產(chǎn)低聚木糖不會(huì)產(chǎn)生無用的副產(chǎn)物，且對環(huán)境無污染，是食品工業(yè)生產(chǎn)低聚木糖的首選方法[74]。Wang 等以200 mg 去淀粉麥麩為底物，通過加入雙功能阿魏酸酯酶/木聚糖酶進(jìn)行酶解，其低聚木糖（木糖/低聚木糖）產(chǎn)量可達(dá)18.2 mg[48]。Li 等通過加入內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶水解楊木鋸末生產(chǎn)低聚木糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)僅加入內(nèi)切木聚糖酶或β-木糖苷酶時(shí)，低聚木糖的產(chǎn)率較低，而當(dāng)兩種酶協(xié)同加入水解時(shí)，低聚木糖的產(chǎn)率可高達(dá)93.9%[75]。這些研究表明，相比于單獨(dú)使用木聚糖酶，采用多功能酶或多酶協(xié)同作用于木聚糖分子可以明顯提高木聚糖主鏈的水解效率。隨著人們對功能性食品需求的不斷增加，酶法生產(chǎn)益生元低聚木糖具有很好的市場前景，后續(xù)采用低成本、高活性的多功能木聚糖水解酶生產(chǎn)低聚木糖是一種可持續(xù)發(fā)展的有效策略。

4 展 望

近年來，隨著酶工程技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展及與食品生物領(lǐng)域的交叉融合，針對食品體系及特殊食品分子的酶催化體系構(gòu)建成為酶工程研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。與傳統(tǒng)的單酶或多酶催化體系相比，兼具多種催化活性的多功能酶在酶解木聚糖等復(fù)雜底物時(shí)具有降低生產(chǎn)成本、提高催化效率、簡化酶解工藝等明顯優(yōu)勢。目前，針對天然多功能木聚糖水解酶的挖掘表達(dá)、酶學(xué)表征和催化機(jī)制解析已取得卓有成效的研究進(jìn)展。然而，由于不同類型的多功能木聚糖水解酶的結(jié)構(gòu)、與底物結(jié)合及催化的酶動(dòng)力學(xué)機(jī)制較為復(fù)雜，對該類酶的分子調(diào)控機(jī)制仍知之甚少，尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。未來的研究可以從以下方面展開：1）通過木質(zhì)纖維素降解優(yōu)勢菌群的多組學(xué)研究和生物信息數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，篩選和挖掘具有更好酶學(xué)特性的新型多功能木聚糖水解酶；2）通過序列比對、結(jié)構(gòu)解析等研究手段，更加全面深入地探索不同類型多功能木聚糖水解酶催化分子機(jī)制，同時(shí)使用定向進(jìn)化和祖先序列重建探索酶系統(tǒng)，進(jìn)一步了解酶進(jìn)化分子機(jī)制，特別是探究單酶同時(shí)發(fā)揮多種功能的分子基礎(chǔ)；3）通過理性設(shè)計(jì)、定向進(jìn)化等方法改變酶的分子結(jié)構(gòu)以提高催化活性及熱穩(wěn)定性，如在活性中心引入新的殘基可以改變酶與底物的靜電相互作用，通過活性位點(diǎn)周圍氨基酸的改造將天然單功能酶進(jìn)化為多功能酶等；4）基于酶學(xué)機(jī)制的高效融合多功能木聚糖水解酶的人工構(gòu)建與修飾，目前人工構(gòu)建融合酶的過程中經(jīng)常存在錯(cuò)誤折疊、功能或結(jié)構(gòu)干擾、蛋白質(zhì)間連接器斷裂等問題，后續(xù)可以嘗試將更穩(wěn)定的酶放在融合酶的前端從而克服上述問題，此外，使用翻譯后修飾位點(diǎn)如N-乙?；蛱腔稽c(diǎn)可以提高酶的穩(wěn)定性；5）結(jié)合人工智能技術(shù)精確指導(dǎo)特異性天然多功能酶篩選與精準(zhǔn)設(shè)計(jì)，通過多學(xué)科的綜合交叉研究，解決高效食品酶創(chuàng)制中的共性關(guān)鍵問題，進(jìn)而定制更符合工業(yè)需要的多功能酶催化體系，推動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。