陳 寧，張佳鈺，鄭明強(qiáng)，路福平，劉夫鋒*

（1.天津科技大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的提高與健康意識(shí)的發(fā)展，人們?cè)絹碓疥P(guān)注高質(zhì)量的健康生活，低熱量及零蔗糖食品飲料逐漸成為重要的消費(fèi)產(chǎn)品。此外，肥胖、高血糖、齲齒等健康問題也增加了消費(fèi)者對(duì)低糖食品的消費(fèi)傾向，異麥芽酮糖作為替代蔗糖的功能性甜味劑而受到廣泛關(guān)注[1-3]。異麥芽酮糖（isomaltulose），即6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖，又稱帕拉金糖，是蔗糖的一種異構(gòu)體，與蔗糖有著相似的物理性質(zhì)和口感[4]。異麥芽酮糖是通過果糖和葡萄糖以α-1，6糖苷鍵相連后得到的右旋雙糖。自然狀態(tài)下，異麥芽酮糖是以白色結(jié)晶狀態(tài)存在的。異麥芽酮糖的甜度大約是蔗糖的50%，且無任何異味，甜味穩(wěn)定，將異麥芽酮糖放在高溫環(huán)境（120 ℃）中熬煮一段時(shí)間，甜味幾乎沒有變化[2]。異麥芽酮糖易溶于水，且隨著溫度的升高其溶解度逐漸變大[3]。與蔗糖相比，異麥芽酮糖的耐酸性較強(qiáng)，將20 g/dL 的蔗糖和異麥芽酮糖在酸性條件下的沸水浴中處理一定時(shí)間后，蔗糖全部水解，而異麥芽酮糖幾乎沒有變化[5]。由于異麥芽酮糖的吸濕性較差，不易降解，尤其是在檸檬酸的存在下，其可在室溫條件下長時(shí)間的保存。

異麥芽酮糖還有一定的保健功能。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)攝入的食物中添加了異麥芽酮糖時(shí)，可有效減少口腔疾病的發(fā)生[5]，且唾液中可變鏈球菌的數(shù)量也明顯減少[6]，且異麥芽酮糖可在小腸內(nèi)完全消化、吸收，由于異麥芽酮糖的分解速度很慢，體內(nèi)胰島素和血糖可長時(shí)間保持在一定范圍內(nèi)，不會(huì)造成血液中葡萄糖水平極速上升，可有效預(yù)防糖尿病，適合糖尿病患者攝入[7-8]。另外，異麥芽酮糖還可通過加氫反應(yīng)生產(chǎn)糖醇[9]，其可作為無糖替代品應(yīng)用于食品中。異麥芽酮糖以其良好的酸穩(wěn)定性、極低的吸濕性和較高的安全性[10-11]，在食品中具有廣闊的市場應(yīng)用前景。異麥芽酮糖廣泛的優(yōu)勢和適用人群，使其具有重要的開發(fā)價(jià)值。甜菜和蜂蜜中存在天然的異麥芽酮糖，但其含量較少且提取困難，難以滿足市場需求。因此，為了滿足市場供給需要，亟須提高異麥芽酮糖的生產(chǎn)效率。

目前，異麥芽酮糖的制備方法主要有化學(xué)轉(zhuǎn)化法和生物轉(zhuǎn)化法。由于化學(xué)轉(zhuǎn)化法存在耗能高、污染性強(qiáng)等問題[12]，而且技術(shù)不夠成熟，使得制備異麥芽酮糖變得非常困難。因此，包括酶轉(zhuǎn)化法和微生物轉(zhuǎn)化法在內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化法在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用。生物轉(zhuǎn)化法是基于蔗糖異構(gòu)化法轉(zhuǎn)化生成異麥芽酮糖，即利用微生物合成的蔗糖異構(gòu)酶（sucrose isomerase，SIase，EC 5.4.99.11）將蔗糖分子中葡萄糖和果糖之間的α-1，2 糖苷鍵異構(gòu)化為α-1，6 糖苷鍵形成異麥芽酮糖和α-1，1 糖苷鍵形成海藻酮糖[13]。因此，蔗糖異構(gòu)酶是生物催化生成異麥芽酮糖和海藻酮糖最有效的生物酶制劑，通過蔗糖異構(gòu)酶生物轉(zhuǎn)化法實(shí)現(xiàn)異麥芽酮糖產(chǎn)業(yè)化受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。作者綜述了蔗糖異構(gòu)酶的研究進(jìn)展，詳細(xì)介紹了SIase 的來源、三維結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制、理性改造和異源表達(dá)等，以及在異麥芽酮糖制備中細(xì)胞固定化和酶固定化的固定化技術(shù)，最后展望了蔗糖異構(gòu)酶在異麥芽酮糖工業(yè)化生產(chǎn)中的廣闊市場前景。

1 蔗糖異構(gòu)酶的概述

1.1 蔗糖異構(gòu)酶的來源

20 世紀(jì)50 年代，南德公司首次在甜菜廠的廢水中分離得到能夠分泌蔗糖異構(gòu)酶的紅色精朊桿菌（Protaminobacter rubrum），進(jìn)而發(fā)明了采用微生物酶轉(zhuǎn)化法制備異麥芽酮糖。經(jīng)過幾十年的研究發(fā)展，科研人員已經(jīng)分離獲得多種能夠合成蔗糖異構(gòu)酶的微生物，且絕大部分蔗糖異構(gòu)酶都來源于細(xì)菌。能產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶的代表細(xì)菌有：普城沙雷氏菌[14]、放射性土壤桿菌[15]、大黃歐文菌[16]、分散泛菌[17]、克雷伯氏肺炎菌[18]以及嗜中酸假單胞菌[19]。根據(jù)酶催化生成的主要產(chǎn)物，蔗糖異構(gòu)酶分為：主要生產(chǎn)異麥芽酮糖型（轉(zhuǎn)化率為60%～90%）和主要生產(chǎn)海藻酮糖型（轉(zhuǎn)化率為85%～89%）。此外，一種來源于昆蟲Silverleaf whitefly 的蔗糖異構(gòu)酶[20]催化蔗糖只生成海藻酮糖。

1.2 蔗糖異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)

蔗糖異構(gòu)酶的pI 小于7，屬于酸性蛋白質(zhì)，最適pH 在5.5～7.0。當(dāng)pH 超過此范圍時(shí)，其活性顯著降低。同時(shí)，催化口袋的電荷對(duì)催化反應(yīng)的最終產(chǎn)物影響顯著。當(dāng)反應(yīng)的pH 高于酶的最適pH 時(shí)，最終產(chǎn)物中海藻酮糖的比例上升；而當(dāng)反應(yīng)的pH 低于酶的最適pH 時(shí)，催化產(chǎn)物中葡萄糖和果糖的產(chǎn)量增加[21]。大多數(shù)蔗糖異構(gòu)酶的最適溫度在20～40 ℃，且蔗糖異構(gòu)化產(chǎn)物的比例受溫度影響很大。高溫條件有利于異麥芽酮糖的形成，而較低的反應(yīng)溫度則有利于海藻酮糖的生成。一般來說，反應(yīng)溫度的升高加快了反應(yīng)速度。然而，高溫條件（＞50 ℃）會(huì)加劇蔗糖的水解，并生成葡萄糖和果糖。不同來源的蔗糖異構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)不同，其底物親和力和識(shí)別能力也是不同，如嗜中酸假單胞菌（Pseudomonas mesoacidophila）中蔗糖異構(gòu)酶Km值為19.2 mmol/L[22]，大黃歐文菌（Erwinia rhapontici）中蔗糖異構(gòu)酶的Km值是其10 倍左右，達(dá)到222 mmol/L[23]。同樣的，紅色精朊桿菌P.rubrum CBS574.77 的Kcat/Km值為1 301 L/（s·mmol）[24]，而P.mesoacidophila MX-45 的Kcat/Km值僅為36 L/（s·mmol）[25]。此外，不同的金屬離子對(duì)蔗糖異構(gòu)酶的影響也存在差異，Mn2+和Mg2+的存在可促進(jìn)酶活力的提升，Ca2+、Cu2+、Zn2+的存在會(huì)使酶活力受到微弱抑制，而當(dāng)Ag+、Hg+存在時(shí)酶完全失活。同時(shí)，蔗糖異構(gòu)酶對(duì)蔗糖具有高度的底物特異性，當(dāng)反應(yīng)體系中存在葡萄糖和果糖時(shí)，葡萄糖和果糖則變?yōu)樵撁傅母偁幮砸种苿姑傅牡孜镉H和力降低[26]。

1.3 蔗糖異構(gòu)酶的三維結(jié)構(gòu)

在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）里，目前利用X 射線衍射法已成功解析了4 種蔗糖異構(gòu)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，分別是來源于Klebsiella sp.LX3（PDB：1M53）[18]、Protaminobacter rubrum CBS574.77（PBD：3GBD）[27]、Pseudomonas mesoacidophila MX-45（PBD：1ZJA）[22]和Erwinia rhapontici NX-5（PBD：4HOW）[28]的蔗糖異構(gòu)酶。其 中，P.mesoacidophila MX-45 和E.rhapontici NX-5 蔗糖異構(gòu)酶突變體的結(jié)構(gòu)以及其抑制劑結(jié)合體的結(jié)晶結(jié)構(gòu)也得到全面解析[19，28]。作為單亞基分子的蔗糖異構(gòu)酶，其分子結(jié)構(gòu)和糖苷酶13（GH13）家族的酶分子結(jié)構(gòu)類似，如寡-1，6-葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶[29]，而且不同來源的蔗糖異構(gòu)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)同源性也很高[25]。與GH13 家族酶相比，蔗糖異構(gòu)酶也是由3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包括C端結(jié)構(gòu)域、N 端結(jié)構(gòu)域和亞結(jié)構(gòu)域[30]。其中，N 端結(jié)構(gòu)域是一個(gè)（β/α）8桶狀結(jié)構(gòu)，是由8 個(gè)α 螺旋與8個(gè)β 折疊組成，包括氨基酸殘基16～119 和190～493，構(gòu)成了蔗糖異構(gòu)酶的催化活性中心，具有與糖苷酶13 家族相似的底物結(jié)合和催化機(jī)制，同時(shí)連接著C 端結(jié)構(gòu)域和亞結(jié)構(gòu)域[26]；C 端結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)反平行β-折疊組成，與N 端結(jié)構(gòu)域以及亞結(jié)構(gòu)域之間形成離子鍵和氫鍵，用以確保酶活性中心所在區(qū)域的穩(wěn)定性，氨基酸殘基包括494～573；亞結(jié)構(gòu)域則由多個(gè)loop 結(jié)構(gòu)組成，參與底物的結(jié)合[21]，包括氨基酸殘基120～190。

在對(duì)多種蔗糖異構(gòu)酶氨基酸序列的多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，通常在N 端結(jié)構(gòu)域中存在一段包括5 個(gè)氨基酸的特定序列。以來源于P.mesoacidophila MX-45的蔗糖異構(gòu)酶MutB 晶體結(jié)構(gòu)為例（見圖1），Asp200、Glu254、Asp327、Phe256 和Phe280 為高度保守序列，其中Asp200、Glu254 和Asp327 構(gòu)成催化活性中心，位于蔗糖異構(gòu)酶的催化口袋中，負(fù)責(zé)酶與底物的結(jié)合和催化[19，21]。Phe256 和Phe280 相距約0.6 nm，在催化域入口形成一對(duì)芳香鉗，將該位點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行特異性定點(diǎn)突變后，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中僅含有葡萄糖和果糖，且沒有生成海藻酮糖和異麥芽酮糖，說明突變后的酶失去了異構(gòu)活性，表明這兩個(gè)氨基酸在底物識(shí)別和產(chǎn)物特異性中起著重要作用[21，31]。與GH13 家族其他酶不同的是，由5 個(gè)氨基酸組成的特定序列是蔗糖異構(gòu)酶所特有的，并且該段獨(dú)特的序列參與了酶的異構(gòu)化反應(yīng)[32]。

圖1 P.mesoacidophila MX-45 MutB 催化口袋示意圖Fig.1 Schematic diagram of P.mesoacidophila MX-45 MutB catalytic pocket

1.4 蔗糖異構(gòu)酶催化機(jī)理

蔗糖異構(gòu)酶以蔗糖為底物時(shí)，催化過程包括異構(gòu)化反應(yīng)和水解反應(yīng)。蔗糖通過異構(gòu)化反應(yīng)生成異麥芽酮糖和海藻酮糖，通過水解反應(yīng)將蔗糖水解為葡萄糖和果糖（見圖2）。

圖2 蔗糖異構(gòu)酶的水解和異構(gòu)化作用Fig.2 Hydrolysis and isomerization of sucrose isomerase

Cheetham 在20 世紀(jì)80 年代提出了蔗糖異構(gòu)酶的催化機(jī)理[33]。以來源于E.rhapontici 的蔗糖異構(gòu)酶作為研究對(duì)象，探討了蔗糖異構(gòu)酶整個(gè)的催化反應(yīng)過程。認(rèn)為在催化反應(yīng)中首先發(fā)生了水解反應(yīng)，生成葡萄糖和果糖，然后葡萄糖基與果糖基的C1 和C6 位的羥基非選擇性地結(jié)合，形成具有α-1，6 糖苷鍵的異麥芽酮糖和α-1，1 糖苷鍵的海藻酮糖。且在這個(gè)過程中，優(yōu)先生成海藻酮糖，主要是由于海藻酮糖產(chǎn)生過程中不需要果糖基進(jìn)行180°旋轉(zhuǎn)，其生成所需能量更低。

以源于S.plymuthica ATCC 15928 的蔗糖異構(gòu)酶為研究對(duì)象，有研究者提出了蔗糖異構(gòu)酶的分子內(nèi)重排[14]。在催化的過程中，蔗糖異構(gòu)酶將底物水解為葡萄糖和果糖，蔗糖異構(gòu)酶與葡萄糖基緊密相連，而與果糖基僅通過離子鍵結(jié)合，致使果糖基可自由旋轉(zhuǎn)和改變其位置，形成異麥芽酮糖和海藻酮糖。此外，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)體系中加入果糖會(huì)增加產(chǎn)物中海藻酮糖的比例，而在底物中加入一定量的葡萄糖會(huì)提高異麥芽酮糖的產(chǎn)率，從而驗(yàn)證了海藻酮糖和異麥芽酮糖的生成比例取決于底物蔗糖的互變異構(gòu)率。

在上述研究的基礎(chǔ)上，Zhang 等將來源于Klebsiella sp.LX3 的蔗糖異構(gòu)酶作為研究對(duì)象，提出了異構(gòu)化反應(yīng)和水解反應(yīng)的兩步催化機(jī)制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了蔗糖異構(gòu)酶的保守序列，325RLDRD329[18]。隨后在P.mesoacidophila MX-45[34]和P.rubrum[31]來源的蔗糖異構(gòu)酶的基因中也發(fā)現(xiàn)了此保守序列。在對(duì)P.rubrum 蔗糖異構(gòu)酶的Arg325 和Arg328 位置進(jìn)行定點(diǎn)突變后，發(fā)現(xiàn)突變體生成異麥芽酮糖的比例出現(xiàn)不同程度的下降，且突變導(dǎo)致產(chǎn)物中有異麥芽糖的形成。研究發(fā)現(xiàn)，突變的這兩個(gè)氨基酸是結(jié)合果糖基的兩個(gè)重要位點(diǎn)，而突變導(dǎo)致酶對(duì)果糖基親和力下降，容易與酶脫離；與此同時(shí)，體系中的葡萄糖會(huì)充當(dāng)?shù)孜镅杆倥c酶結(jié)合，最終生成異麥芽糖。

近年來，Ravaud 等提出了新的蔗糖異構(gòu)酶的催化機(jī)制，兩步雙位移催化機(jī)制[21]。在蔗糖異構(gòu)酶催化蔗糖生成異麥芽酮糖和海藻酮糖過程中，酶-糖基中間復(fù)合物共價(jià)鍵的形成與斷裂是通過羧基離子過渡態(tài)來完成的。活性中心的谷氨酸作為酸性催化劑提供質(zhì)子使底物糖苷鍵上的氧質(zhì)子化，后通過天冬氨酸對(duì)蔗糖上C1 位的氫原子進(jìn)行親核攻擊，使其去質(zhì)子化并生成酶-β-葡萄糖基復(fù)合物，最終果糖基通過互變異構(gòu)生成異麥芽酮糖和海藻酮糖。

2 蔗糖異構(gòu)酶的異源表達(dá)

利用基因工程等方法已將多種來源的蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌等工程菌株中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。大腸桿菌（Escherichia coli）是生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品的理想工業(yè)菌株之一，來源于Klebsiella planticola 的SIase 基因成功克隆并在E.coli 中表達(dá)，所得蔗糖異構(gòu)酶的水解活性隨pH 的升高而降低，異麥芽酮糖成為主要產(chǎn)物。Zhang 等克隆了菌株Erwinia sp.Ejp617 的SIase 基因在E.coli BL21（DE3）中異源表達(dá)，經(jīng)生物催化后，重組SIase可將300.0 g/L 的蔗糖轉(zhuǎn)化為240.9 g/L 異麥芽酮糖[35]。然而，大腸桿菌由于細(xì)胞壁熱原和內(nèi)毒素的合成，不適用于異麥芽酮糖的合成。因此，在安全的食品級(jí)宿主中異源表達(dá)SIase 受到越來越多的關(guān)注。乳酸乳桿菌（Lactococcus lactis）由于其非致病性、無侵染性的特性被認(rèn)為是重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)和分泌的高效表達(dá)菌株[36]。Park 等將來源于Enterobacter sp.FMB-1 的SIase 基因在L.lactis MG1363 中異源表達(dá)，并將所得SIase 用于異麥芽酮糖生產(chǎn)，其轉(zhuǎn)化率為72%[37]。同樣，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）也是常用菌株之一。將來源于E.rhapontici NX-5 的SIase 基因在工程菌B.subtilis WB800 中過表達(dá)，有效解決了異麥芽酮糖生產(chǎn)中的食品安全問題[38]。另外，解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）具有GRAS認(rèn)證，是一種公認(rèn)安全的微生物，來源于P.dispersa UQ68J 的SIase 基因可在此酵母中進(jìn)行高效表達(dá)[39]。蔗糖異構(gòu)酶的異源表達(dá)見表1。

表1 蔗糖異構(gòu)酶的異源表達(dá)Table 1 Heterologous expression of sucrose isomerase

3 蔗糖異構(gòu)酶的理性改造

雖然天然蔗糖異構(gòu)酶可用于異麥芽酮糖的生物合成，但在工業(yè)應(yīng)用過程中仍存在熱穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)化率低等問題?；诮Y(jié)構(gòu)信息的蛋白質(zhì)工程可以提高天然酶的應(yīng)用性，因此出現(xiàn)了多種蛋白質(zhì)工程方法（見表2）。目前蔗糖異構(gòu)酶的分子改造主要集中在提高熱穩(wěn)定性、提高異麥芽酮糖的產(chǎn)率以及減少副產(chǎn)物這3 個(gè)方面。

表2 蔗糖異構(gòu)酶的分子改造Table 2 Molecular modification of sucrose isomerase

來源于Klebsiella sp.LX3 菌株的SIase（PalⅠ）在50 ℃條件下的半衰期只有1.8 min，這嚴(yán)重限制了該酶的工業(yè)化應(yīng)用。為了提高其熱穩(wěn)定性，通過定點(diǎn)誘變對(duì)其進(jìn)行分子改造，利用脯氨酸取代Glu498 和Arg310 后所得的突變酶，在50 ℃條件下的半衰期是天然酶的11 倍，顯著提高了熱穩(wěn)定性，與此同時(shí)異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率提高了27%[43]。在此基礎(chǔ)上，Zhang 等又對(duì)Klebsiella sp.LX3 來源的蔗糖異構(gòu)酶的保守序列進(jìn)行了大量的突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將保守序列中的精氨酸或天冬氨酸（Arg325、Arg328、Asp325 和Asp329）突變?yōu)橹行园被峄蛳喾措姾傻陌被釙r(shí)，生成產(chǎn)物中異麥芽酮糖占比下降26%～67%，而海藻酮糖的比例增加17%～61%。上述結(jié)果表明，突變點(diǎn)并不影響酶活性，而僅影響其產(chǎn)物特異性，由高產(chǎn)量的異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化為高產(chǎn)量的海藻酮糖[18]。

來源于Serratia plymuthica AS9 的蔗糖異構(gòu)酶是另一種研究較多的蔗糖異構(gòu)酶。但前期研究結(jié)果表明來源于S.plymuthica AS9 的蔗糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性較差。為了獲得熱穩(wěn)定較高的突變體，利用B因子位點(diǎn)選擇結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了3 種突變體，E175N、K576D 和E175N/K576D。在45 ℃培養(yǎng)條件下，突變體的半衰期分別是天然酶半衰期的1.38、1.04、1.19 倍，熱穩(wěn)定性提高，同時(shí)異麥芽酮糖的得率也分別提高了2.0%、1.0%、2.8%[44]。此外，為了減少由S.plymuthica AS9 蔗糖異構(gòu)酶在生物合成過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，Pilak 等采用了類似于“戰(zhàn)艦策略” 的半模擬蛋白質(zhì)工程策略，對(duì)來源于S.plymuthica 的SIase 進(jìn)行了7 次循環(huán)突變，共涉及55 個(gè)位點(diǎn)，最終獲得了一株三重突變體Y219L/D398G/V465E。該突變體的最適反應(yīng)溫度從30 ℃提高到35 ℃，熱穩(wěn)定性和催化效率都明顯提高[45]。

而來源于P.dispersa UQ68J 的SIase 卻表現(xiàn)出對(duì)異麥芽酮糖的產(chǎn)物特異性較低。為了克服上述缺點(diǎn)，研究者以靠近底物結(jié)合位點(diǎn)的299 位氨基酸為目標(biāo)，利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得突變體Q299E，其底物轉(zhuǎn)化率從（90.3±0.8）%提高到(94.2±0.4)%[46]。此外，Lipski 等將來源于Rhizobium sp.的SIase 進(jìn)行隨機(jī)突變，獲得的F164L 突變體將底物轉(zhuǎn)化率提高了55.1%[47]。

4 生物催化生產(chǎn)異麥芽酮糖中蔗糖異構(gòu)酶的固定化應(yīng)用

異麥芽酮糖在自然界中的含量微乎其微，且提取困難，與其市場需求相去甚遠(yuǎn)?；瘜W(xué)合成制備異麥芽酮糖難度較大，并且容易污染環(huán)境。因此，對(duì)于異麥芽酮糖的生產(chǎn)，國內(nèi)外大都采用生物轉(zhuǎn)化法，主要包括微生物轉(zhuǎn)化法和酶轉(zhuǎn)化法。作為生物轉(zhuǎn)化異麥芽酮糖中重要酶制劑，蔗糖異構(gòu)酶的固定化有助于提高其催化性能及穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)生物酶的回收或重復(fù)使用。

4.1 固定化細(xì)胞

微生物轉(zhuǎn)化法是利用整個(gè)微生物細(xì)胞來生產(chǎn)異麥芽酮糖，也包括游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化法和固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。有研究者將Enterobacter sp.FMB1 菌體與蔗糖混合發(fā)酵，48 h 后的產(chǎn)物得率高達(dá)90%，然而由于其發(fā)酵環(huán)境復(fù)雜、成本較高，給后期分離造成困難，不適用于工業(yè)放大[48]。隨著固定化技術(shù)的提高，通過化學(xué)或物理手段將微生物細(xì)胞固定于某一區(qū)域內(nèi)，在保持菌體催化活性的同時(shí)還可進(jìn)行回收再利用。因此，與游離細(xì)胞生產(chǎn)異麥芽酮糖相比，固定化細(xì)胞具有簡化下游工藝、連續(xù)操作生產(chǎn)、提高催化劑穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性、可重復(fù)使用性等優(yōu)點(diǎn)。

近年來，已報(bào)道的固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化法主要有海藻酸鹽包埋法和殼聚糖-戊二醛交聯(lián)法，所得的固定化細(xì)胞不僅可以提高異麥芽酮糖的產(chǎn)率還可改善其應(yīng)用性能。Cheetham 等最早將E.rhapontici NCPPB 1578 細(xì)胞包埋進(jìn)海藻酸鹽凝膠顆粒，所得固定化細(xì)胞的異麥芽酮糖產(chǎn)率是0.2 g/（h·g），且與游離細(xì)胞相比，其操作穩(wěn)定性提高[33]。隨后Mundra等將相同來源的細(xì)胞利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了該固定化過程，在海藻酸鹽質(zhì)量濃度為5 g/dL、細(xì)胞載量為5 g/L 時(shí)，達(dá)到異麥芽酮糖最大產(chǎn)率，且將異麥芽酮糖的產(chǎn)量提高了40%[49]。有研究者利用海藻酸鈣對(duì)Erwinia sp.D12 細(xì)胞進(jìn)行固定化，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了固定化工藝，同時(shí)評(píng)估了明膠和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的添加對(duì)海藻酸鈣固定的Erwinia sp.D12 細(xì)胞顆粒網(wǎng)狀化的影響[50]。結(jié)果表明，用3 g/dL 海藻酸鈉固定細(xì)胞，細(xì)胞固定化質(zhì)量濃度為47 g/dL，添加0.3 mol/L 氯化鈣、1.7 g/dL 的明膠和0.15 g/dL 的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶所得的固定化細(xì)胞，在連續(xù)生產(chǎn)7 次后其蔗糖轉(zhuǎn)化率還能保持50%～60%。隨后又利用海藻酸鈣超聲固定Erwinia sp.D12 細(xì)胞顆粒填充床柱，其蔗糖最大轉(zhuǎn)化率為53%～59%，且能夠在480 h內(nèi)保持較高活性。降低溫度對(duì)所得異麥芽酮糖結(jié)晶后，結(jié)晶純度高達(dá)96.5%[51]。Li 等將表達(dá)SIase 基因的重組E.coli 細(xì)胞用戊二醛處理后，重懸于海藻酸鈉溶液中，并加入氯化鈣溶液制備固定化細(xì)胞微球。所得固定化細(xì)胞在1.5 h 內(nèi)的蔗糖轉(zhuǎn)化率為87%，且能夠在酶反應(yīng)器中連續(xù)30 d 保持穩(wěn)定[16]。

為了提高重組E.coli 細(xì)胞的重復(fù)使用性，Li 等又優(yōu)化了其固定化條件，得出2 g/dL 的海藻酸鈉和3 g/dL 的氯化鈣為最優(yōu)固定化條件，且在重復(fù)使用30 次后其穩(wěn)定性良好，采用柱式反應(yīng)器連續(xù)生產(chǎn)40 d 后，異麥芽酮糖產(chǎn)率（轉(zhuǎn)化率）還可高達(dá)83%[52]。除此之外，還有其他一些微生物用于海藻酸鹽固定化細(xì)胞生產(chǎn)異麥芽酮糖，比如Klebsiella sp.[53-54]、P.rubrum[55]、S.plymuthica ATCC15928[56-58]等。用海藻酸鈣、戊二醛和聚乙烯亞胺對(duì)P.rubrum 細(xì)胞進(jìn)行固定化，得到穩(wěn)定的固定化細(xì)胞微球，可重復(fù)使用24 個(gè)批次，異麥芽酮糖產(chǎn)率（轉(zhuǎn)化率）高達(dá)89%～94%[55]。Krastanov 等利用中空纖維膜反應(yīng)器固定化S.plymuthica ATCC15928 細(xì)胞，固定化細(xì)胞的催化活性隨操作時(shí)間的延長緩慢下降，在連續(xù)操作90 d后活性僅喪失了11%，且在生物反應(yīng)器的循環(huán)模式下，質(zhì)量濃度40～60 g/dL 的底物在36～48 h 內(nèi)的轉(zhuǎn)化率均能達(dá)到90%以上[56]。隨后又利用殼聚糖-戊二醛交聯(lián)法將S.plymuthica ATCC15928 細(xì)胞進(jìn)行固定，所得固定化細(xì)胞的底物轉(zhuǎn)化率高達(dá)94%[57]。

4.2 固定化酶

細(xì)胞固定化具有細(xì)胞自溶、細(xì)胞代謝導(dǎo)致產(chǎn)物濃度低等缺點(diǎn)。同時(shí)，固定化細(xì)胞生產(chǎn)異麥芽酮糖，存在菌體濃度低、生產(chǎn)強(qiáng)度弱的缺陷[54]，因此，酶轉(zhuǎn)化法受到越來越多的關(guān)注。酶轉(zhuǎn)化法是指將蔗糖異構(gòu)酶從微生物中分離出來，通過游離酶或固定化酶轉(zhuǎn)化制備異麥芽酮糖。常用的SIase 的固定化方法包括交聯(lián)、包埋和吸附。Contesini 等將來源于Erwinia sp.D12 的SIase 分別利用低甲氧基果膠和脂肪微膠囊包埋和鐵鋁酸四鈣吸附兩種方法制備固定化SIase，所得固定化SIase 的異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化率分別為30%和60%[59]。隨后又將鐵鋁酸四鈣吸附的固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化，所得的固定化SIase 的異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化率提高到63%[60]。Zhang 等將重組SIase 純化后利用聚乙烯醇-海藻酸鈉進(jìn)行固定，該酶的穩(wěn)定性顯著提高，在循環(huán)使用13 個(gè)批次后還能保持96%的高轉(zhuǎn)化率[61]。與包埋和吸附方法相比，交聯(lián)法固定化酶更加穩(wěn)定，酶不易脫落，重復(fù)使用性好。Wu 等將SIase 交聯(lián)固定到聚賴氨酸修飾的介孔二氧化鈦上，其酶活力回收率高達(dá)93%，且具有良好的操作穩(wěn)定性，在連續(xù)反應(yīng)條件下其半衰期可達(dá)114 h，使用16 個(gè)批次后仍能保持95%的蔗糖轉(zhuǎn)化率[13]。此外，作者也以來源于Pantoea dispersa 的蔗糖異構(gòu)酶為模型酶，分別采用了硅球-戊二醛吸附交聯(lián)法和戊二醛-葡聚糖醛交聯(lián)法制備了交聯(lián)酶聚集體，大幅提高了固定化酶的催化性能[62-63]。目前關(guān)于固定化細(xì)胞或酶生產(chǎn)異麥芽酮糖的研究見表3。

表3 固定化細(xì)胞或酶生產(chǎn)異麥芽酮糖Table 3 Isomaltulose production by immobilized cells or enzymes

5 展 望

異麥芽酮糖具有優(yōu)良的理化性質(zhì)和保健功效，是蔗糖的理想替代物，在減糖等健康食品中擁有廣闊的市場前景。蔗糖異構(gòu)酶是生物轉(zhuǎn)化異麥芽酮糖最有效的生物酶制劑，近年來圍繞菌株的篩選、酶的異源表達(dá)、酶分子改造以及固定化細(xì)胞/酶等領(lǐng)域，進(jìn)行了大量且系統(tǒng)的研究，使人們對(duì)SIase 有了更深入的認(rèn)識(shí)，然而作為一種具有重要應(yīng)用價(jià)值的工業(yè)酶，仍存在一些問題亟待解決。

現(xiàn)有的食品安全級(jí)菌株存在分泌量低、熱穩(wěn)定性差、應(yīng)用性能差等缺陷，要解決這些問題，可以從菌株和酶兩方面進(jìn)行改造。選育SIase 高產(chǎn)菌株，優(yōu)化工程菌株的發(fā)酵工藝，構(gòu)建高效的基因工程產(chǎn)酶菌株；或在SIase 結(jié)構(gòu)的研究基礎(chǔ)上，首先確定了影響酶活性的關(guān)鍵區(qū)域，通過理性設(shè)計(jì)改造酶分子，改善酶的催化特性，如提高熱穩(wěn)定性和pH 耐受性、增加產(chǎn)物特異性等。另外，部分SIase 的熱穩(wěn)定較差，在進(jìn)行了相關(guān)蛋白質(zhì)工程修飾后，效果并不是很明顯，可進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行固定化，而現(xiàn)如今的固定化細(xì)胞或固定化酶的技術(shù)相對(duì)不成熟，為了提高SIase 在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用性能，還需要對(duì)SIase 的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的探索和修飾。