仲 惟，李 濤

（1.三門峽職業(yè)技術(shù)學院 食品園林學院，河南 三門峽 472000；2.河南科技大學 應用工程學院，河南 三門峽 472000）

果酒一般是指以水果為原料經(jīng)發(fā)酵及一系列工藝處理得到的低酒精度飲料酒，由于原料或生產(chǎn)環(huán)節(jié)的影響，果酒釀制過程中不可避免有甲醇、雜醇的產(chǎn)生[1-2]。甲醇的攝入過量會對人體健康構(gòu)成威脅，GB 15037—2006《葡萄酒》中規(guī)定白葡萄酒中甲醇含量不得高于250 mg/L，白紅葡萄酒中甲醇含量不得高于400 mg/L，但目前我國對其他水果釀造的發(fā)酵酒中甲醇含量尚無明確規(guī)定，主要參考葡萄酒標準[3-5]。雜醇是具有三個及以上碳原子的一元醇類脂肪醇混合物的俗稱，果酒中的雜醇主要是丙醇、丁醇、異丁醇、戊醇、異戊醇等[6-8]。適量的雜醇可以襯托酯香，增強果酒的風味，但過量則不僅導致果酒產(chǎn)生異雜味，而且對人體神經(jīng)系統(tǒng)有毒害作用，是導致“上頭”的主要因素之一[9-10]，因此果酒中甲醇及雜醇的含量是評價果酒品質(zhì)的重要考量因素。

目前測定果酒中甲醇及雜醇的方法有分光光度法[11-13]、氣相色譜法[14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）法[15-16]等。分光光度法雖然可以測定果酒中各類醇的含量，但是操作步驟繁瑣、耗時較長、目標組分選擇性不強；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法由于質(zhì)譜儀設備昂貴，測樣成本高，限制了方法的普及性。本實驗擬采用氣相色譜儀，并通過頂空固相微萃取的條件優(yōu)化，嘗試建立一種快速、準確、重復性好的頂空固相微萃取與氣相色譜聯(lián)用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography，HS-SPME-GC）的方法，來檢測果酒中的甲醇、雜醇，并為其方法的可推廣性進行驗證。旨在為釀造果酒過程中對甲醇及雜醇含量及時監(jiān)測和調(diào)控，對提升果酒的品質(zhì)和安全性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（99.9%）、正丙醇（99.9%）、異丙醇（99.9%）、異丁醇（99.9%）、正丁醇（99.9%）、異戊醇（99.9%）、活性戊醇（99.8%）、正戊醇（99.9%）標準品：美國Sigma公司；實驗用水均為一級純化水；釀酒原料：市售。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

6820型氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測器）：美國Agilent公司；XS204電子分析天平：瑞士梅特勒-托利多集團；TG-35MS（60 m×250 μm×0.25 μm）、HP-5MS（60 m×250 μm×0.25 μm）、CP-WAXMS（60 m×250 μm×0.25 μm）色譜柱：美國安捷倫公司；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）固相微萃取頭、聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）固相微萃取頭、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）固相微萃取頭；二乙烯基苯/聚乙二醇/聚二甲基硅氧烷（DVB/Carbowax/PDMS）固相微萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 果酒釀造方法

以傳統(tǒng)果酒發(fā)酵工藝為基礎，參照相關(guān)文獻研究[17-19]，分別進行山楂酒、獼猴桃酒以及葡萄酒的釀造以及陳釀，并在釀造后0、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d、210 d、240 d取樣進行甲醇及雜醇的測定。

1.3.2 頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

將萃取頭插入GC進樣口中，于250 ℃老化2 h。稱取2 mL樣品超聲5 min趕去不同果酒樣品中的氣泡后，置于10 mL頂空進樣瓶中，插入萃取頭，于不同的萃取溫度下頂空萃取一段時間，于250 ℃解吸5.0 min。

根據(jù)以上條件為基礎，分別比較不同的萃取頭（PDMS固相微萃取頭、PA固相微萃取頭、DVB/Carbowax/PDMS固相微萃取頭、PDMS/DVB固相微萃取頭）；萃取溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）、萃取時間（20 min、30 min、40 min、50 min）條件下的相對峰面積，考察不同條件對樣品中甲醇及雜醇組分萃取效果的影響。

1.3.3 氣相色譜條件優(yōu)化

CP-WAXMS毛細管色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進樣口溫度220 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持10 min，以5℃/min升至150℃，保持10 min，再以10 ℃/min升至270℃，保持10 min；分流比20∶1；載氣為高純氮氣（N2）（99.99%）；空氣流速為300 mL/min；氫氣流速為20 mL/min；采用氫火焰離子化檢測器，溫度230 ℃進樣方式為取頂空進樣瓶上部氣體，進樣體積1.0 mL。

根據(jù)以上條件為基礎，分別比較了3款毛細管色譜柱[TG-35MS（60 m×250 μm×0.25 μm）、HP-5MS（60 m×250 μm×0.25 μm）、CP-WAXMS（60 m×250 μm×0.25 μm）]、不同的柱初始溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）、載氣流速（10 mL/min、15 mL/min、20 mL/min、25 mL/min、30 mL/min）以及分流比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1）對待測8種組分分離效果的影響。

1.3.4 定性定量方法

如圖3所示，對于5G前傳，WDM-PON技術(shù)基于FTTX ODN的點對多點樹型網(wǎng)絡拓撲，實現(xiàn)了單纖10～20通道的密集波分，能大量節(jié)省光纖布線資源，且每個通道提供25～50 Gbit/s的帶寬，滿足5G前傳通用公共無線電接口（eCPRI）的帶寬需求。對于采用集中化無線接入（C-RAN）架構(gòu)，需要在城區(qū)實現(xiàn)5G基站密集連續(xù)覆蓋，同時骨干光纖資源非常緊張的場景，WDM-PON是一個非常合適的技術(shù)。

依據(jù)標樣中各組分的保留時間對樣品中各組分定性，采用外標法定量。

1.3.5 方法學考察

稱取適量標準品，分別配制甲醇質(zhì)量濃度為0.1～50 mg/mL，正丙醇、異丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、活性戊醇、正戊醇質(zhì)量濃度為0.01～5.0 mg/mL的混合標準溶液系列，并對方法的加標回收率、精密度進行測定。

1.3.6 樣品分析

將不同果酒樣品按氣相色譜條件進行測定。并利用該方法對陳釀于常用容器中的葡萄酒（陳釀于橡木桶中）、山楂酒（陳釀于白銹鋼容器中）、獼猴桃酒（陳釀于白銹鋼容器中）3種果酒中的甲醇、雜醇進行測定，并跟蹤測定3種果酒陳釀過程中8種組分的含量變化。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均重復3次，采用IBM SPSS Statistics 24軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，采用Origin 8.5和TBtools軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 固相微萃取頭的選擇

圖1 不同萃取頭對各組分萃取效果的影響Fig.1 Effect of different extraction heads on extraction efficiency of each component

由圖1可知，PDMS固相微萃取頭的頂空萃取效果最好，8種組分測定的相對峰面積都＞90%，其次是PA固相微萃取頭，而DVB/Carbowax/PDMS固相微萃取頭和PDMS/DVB固相微萃取頭對8種組分的頂空萃取效果不佳，相對峰面積＜80%。這主要因為固相微萃取過程中萃取效果主要受萃取頭涂層極性以及表面積的影響，非極性涂層萃取非極性化合物效果較好，果酒樣品的甲醇及雜醇屬偏非極性，而PDMS屬于偏非極性的固相微萃取頭，而Carbowax和DVB固相微萃取頭更適用于偏極性化合物的萃取，因此本試驗頂空萃取選擇PDMS固相微萃取頭。

2.1.2 萃取溫度的選擇

頂空萃取過程中萃取溫度對萃取效果有雙重作用[21-22]。萃取溫度越高時，果酒中的甲醇及雜醇分子擴散速度加快，萃取時間變短；但是萃取溫度越高，甲醇及雜醇在固相微萃取頭的涂層中分配系數(shù)也會降低，吸附量會減小，影響萃取頭的靈敏度。本研究在上述實驗條件下，分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃的溫度下萃取60 min，比較不同萃取溫度對各組分頂空吸附的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 萃取溫度對各組分萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of each component

由圖2可知，50 ℃條件下的PDMS萃取頭對果酒樣品中的甲醇及雜醇的吸附量最大，說明在此溫度下的頂空萃取效果最佳。而萃取溫度為40 ℃時，甲醇及雜醇的擴散速度較慢或揮發(fā)不完全，萃取效果不佳；而萃取溫度達到60 ℃以上時，樣品中甲醇及雜醇組分在PDMS固相萃取頭的涂層中分配系數(shù)降低，各組分的吸附量均有不同程度的減小。綜合考慮，選擇50 ℃作為萃取溫度。

2.1.3 萃取時間的選擇

不同萃取時間對果酒樣品中甲醇及雜醇頂空萃取效果的影響見圖3。

圖3 萃取時間對各組分萃取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency of each component

由圖3可知，隨著頂空萃取時間的延長，固相萃取頭對樣品中甲醇及雜醇的吸附量逐漸增加；當萃取時間超過40 min后，固相萃取頭吸附量趨于飽和，吸附能力減弱，但同時分子擴散還同時在進行，表現(xiàn)為甲醇及雜醇的吸附量開始有不同程度下降。因此，選擇40 min作為固相微萃取時間。

2.2 氣相色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

由于不同果酒經(jīng)發(fā)酵陳釀后成分復雜，酒體中揮發(fā)性組分較多，易對待測組分造成干擾，故要選擇一款能將待測8種目標組分分離的毛細管色譜柱，以便在后續(xù)樣品分析中對目標物進行準確定量，3款毛細管色譜柱對8種待測物分離效果的影響見圖4。由圖4可知，TG-35MS、HP-5MS兩款毛細管色譜柱分離8種待測組分時，部分目標組分分離度不佳、峰形不理想；而CP-WAXMS毛細管色譜柱由于口徑小，涂層較厚，能將甲醇與雜醇分離，且異戊醇與活性戊醇這兩種性質(zhì)相近的雜醇也能有效被分離，能滿足分離低沸點、成分復雜的果酒樣品檢測需求。

圖4 不同色譜柱的分離效果Fig.4 Separation effect of different chromatographic columns

2.2.2 色譜條件的優(yōu)化

毛細管氣相色譜分析待測物組分時，在選用上述CPWAXMS毛細管色譜柱的條件下，對影響8種組分分離的其他氣相色譜條件進行優(yōu)化，分別比較不同的柱初始溫度、載氣流速以及分流比對待測8種組分分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，待測組分的分離度、保留時間和靈敏度均受到柱初始溫度直接影響。當柱初始溫度為40 ℃時，甲醇與異丙醇分離度差，之后逐步升溫，發(fā)現(xiàn)最佳溫度為50 ℃，分離效果好；而載氣流速較小時，分析時間長，載氣流速太大，分離效果差，最佳載氣流量為15 mL/min。選擇分流比時分流歧視會受到一般分流比大小的影響，通常分流歧視會因比值越大則可能性越大，比值越小，甲醇峰出現(xiàn)扁平現(xiàn)象，所以選擇20∶1的分流比。故最佳色譜條件為初始溫度50 ℃，載氣流速15 mL/min，分流比20∶1，此時8種組分的分離效果較好，具有較高的準確度，混合標準品的氣相色譜圖見圖5。由圖5可知，此條件下各物質(zhì)分離情況良好。

圖5 甲醇及雜醇混合標準品的氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of methanol and fusel mixed standards

2.3 方法學考察

2.3.1 果酒中甲醇、雜醇的保留時間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

分別配制甲醇質(zhì)量濃度為0.1～50 mg/mL，正丙醇、異丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、活性戊醇、正戊醇質(zhì)量濃度為0.01～5.0 mg/mL的混合標準溶液系列上機進行檢測，繪制標準曲線，其中檢出限（limit of detection，LOD）以信噪比（S/N）=3計算，定量限（limit of quantitation，LOQ）以信噪比（S/N）=10計算，結(jié)果如表1所示。

表1 8種組分的保留時間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Table 1 Retention time,standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of 8 kinds of components

續(xù)表

由表1可知，8種組分在標準溶液質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（R＞0.999），并得到8種目標組分的檢出限為0.001 0～0.005 0 mg/mL，定量限為0.003 0～0.015 0 mg/mL。

2.3.2 加標回收及精密度試驗

分別添加0.010 mg/mL、0.10 mg/mL、1.0 mg/mL 3個梯度濃度的甲醇及雜醇混合溶液到已知本底濃度果酒樣品中，每個水平測定5次，計算加標回收率以及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），試驗結(jié)果見表2。

表2 方法的回收率及精密度試驗結(jié)果（n=5）Table 2 Recovery and precision test results of the method (n=5)

由表2可知，8種組分的3個水平的加標回收率為88.3%～96.7%，重復測定5次的精密度試驗結(jié)果RSD范圍為2.7%～5.1%，表明本實驗所建立的方法能夠滿足檢測實際樣品需要的準確度和精密度，可以用于果酒樣品中雜醇的分析檢測。

2.4 樣品中目標物的測定

按照確定的測定方法，對3種果酒6批樣品進行氣相色譜分析，采用外標法定量，測定結(jié)果見表3。

表3 果酒樣品中醇類物質(zhì)含量的測定結(jié)果Table 3 Determination results of alcohols in fruit wine samples

從表3可知，3種果酒成品中主要的雜醇為正丙醇、異丁醇、異戊醇，雜醇總量均＜0.4 mg/mL，甲醇含量＜0.2mg/mL，各組分含量適中，賦予了果酒芳香的口味和酒體的醇厚感。

2.5 陳釀時間對甲醇和雜醇含量的影響

新釀制的果酒一般需貯存一段時間，以減少新酒中的辛辣性[23-24]，使酒體更綿軟和適口。本研究選擇3種果酒（葡萄酒、山楂酒、獼猴桃酒）為研究對象，分別研究在常用陳釀容器中陳釀240 d酒體中甲醇、雜醇含量的變化，結(jié)果分別見圖6和圖7。

圖6 陳釀時間對甲醇含量的影響Fig.6 Effect of aging time on methanol content

圖7 陳釀時間對雜醇含量的影響Fig.7 Effect of aging time on fusel content

由圖6可知，隨著陳釀時間的延長，葡萄酒中的甲醇含量下降趨勢明顯，陳釀240 d后甲醇含量由最初的0.181 mg/mL下降到0.139 mg/mL；而山楂酒和獼猴桃酒中的甲醇含量呈緩慢下降趨勢，變化不顯著。這可能是與不同果酒的酒體特性以及選用的陳釀容器有關(guān)，甲醇為低沸點易揮發(fā)物質(zhì)，選用的陳釀容器氣孔率越高、致密度越小，越有利于其揮發(fā)至外界中，葡萄酒陳釀時使用的橡木桶的孔隙較大，與外界氣體交換率高，故葡萄酒的酒體中甲醇含量下降最多。

由圖7可知，隨著陳釀時間的延長，葡萄酒中的雜醇總量呈現(xiàn)增長趨勢，陳釀240 d后雜醇總量由0.235 mg/mL上升到0.449 mg/mL；而山楂酒、獼猴桃酒中的雜醇總量隨著陳釀時間的延長呈現(xiàn)出下降趨勢。在陳釀過程中，由于雜醇的揮發(fā)性較小，隨著乙醇和水的揮發(fā)，導致了雜醇總量相對濃縮；但同時雜醇也會在陳釀的過程中被酒中的溶氧緩慢氧化分解成醛，醛再被氧化成酸，這會導致雜醇含量的下降。葡萄酒在陳釀過程中，一般使用的橡木桶孔隙較大，與外界氣體交換率高，這會導致含量升高的濃縮作用大于降低含量的化學反應，致使葡萄酒在陳釀過程中雜醇總量變現(xiàn)為上升趨勢；而山楂酒與獼猴桃酒陳釀使用的不銹鋼容器與氣體交換率低，含量升高的濃縮作用小于降低含量的化學反應，故雜醇含量呈下降趨勢。何瓊等[25]研究了無花果酒陳釀期甲醇及雜醇含量的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)無花果酒陳釀9個月后，酒體中正丙醇、正丁醇、異戊醇的含量都隨著陳釀時間的增加而呈現(xiàn)下降趨勢，同時甲醇含量也下降了27.58%，與本研究中山楂酒與獼猴桃酒陳釀過程中的趨勢相同，進一步驗證了本研究的結(jié)論。這些果酒中雜醇在陳釀過程下降的原因可能是轉(zhuǎn)化為相應醛類及酸類物質(zhì)，如異丁醇、異戊醇可以轉(zhuǎn)化形成乙酸酯，而甲醇的下降是陳釀過程中轉(zhuǎn)化為了甲酸。

3 結(jié)論

該研究建立了一種利用HS-SPME-GC法同時測定果酒中甲醇和雜醇的研究方法，并優(yōu)化了其試驗條件，并利用建立的方法對葡萄酒、山楂酒、獼猴桃酒3種果酒陳釀過程中的甲醇、雜醇含量進行了測定。結(jié)果表明，各化合物在0.01～50 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R＞0.999），該方法的檢出限為0.001～0.005 mg/mL，定量限為0.003～0.015 mg/mL，加標回收率達到88.3%～96.7%，精密度試驗結(jié)果RSD為2.7%～5.1%。隨著陳釀時間的延長，3種果酒中的甲醇均有不同程度的下降，其中下降最快的是葡萄酒中的甲醇；而隨著陳釀時間的延長，葡萄酒酒樣中的雜醇總量呈現(xiàn)增長趨勢，山楂酒、獼猴桃酒酒體中的雜醇總量均呈現(xiàn)出下降趨勢。該方法準確、快速、操作簡單，利用該方法可對不同果酒中甲醇、雜醇進行分析和測定，有助于提高檢測和分析此類樣品的效率，為果酒行業(yè)的質(zhì)量改進提供試驗依據(jù)。