楊柏高,郝海生,杜衛(wèi)華,朱化彬,趙學(xué)明
(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)
牦牛廣泛分布于海拔3 000~5 000 m的高原地區(qū),是高原地區(qū)的特有牛種,也是唯一生活在高寒地區(qū)的大型反芻家畜動(dòng)物。我國擁有豐富的牦牛品種資源,2021年有20個(gè)地方牦牛品種,存欄數(shù)達(dá)1 600余萬頭,是世界上擁有牦牛數(shù)量和品種類群最多的國家。牦牛是高原地區(qū)孕育的寶貴資源,為當(dāng)?shù)鼐用裉峁┤?、奶、毛皮、燃料等生活資料,也可作為農(nóng)耕役畜和交通運(yùn)輸工具,是當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要畜種。
牦牛分為家牦牛(Bosgrunniens)和野牦牛(Bosmutus),約7 300年前,人們將相對溫和的野牦牛逐漸馴化成家牦牛[1]。經(jīng)過長期適應(yīng)性進(jìn)化,牦牛對高原低氧、高寒、強(qiáng)紫外輻射等極端環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)性,被稱為“高原之舟”。近年來,隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等組學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用,牦牛高原適應(yīng)機(jī)制研究取得新進(jìn)展。本文就近年來牦牛高原低氧、高寒環(huán)境適應(yīng)以及高原抗病機(jī)制和繁殖規(guī)律的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為揭示牦牛高原適應(yīng)機(jī)制提供思考。
高原地區(qū)海拔高、大氣壓低、空氣稀薄且含氧量低。牦牛長期生活在高原低氧環(huán)境,在軀體結(jié)構(gòu)、器官組織上表現(xiàn)出低氧適應(yīng)性形態(tài)及功能特征。
牦牛獨(dú)特的呼吸系統(tǒng)結(jié)構(gòu)使其適應(yīng)高原低氧大氣環(huán)境。牦牛體型壯碩而前胸開闊,有14或15對肋骨,肺體積大、容量高[2];其氣管短而粗,呼吸肌發(fā)達(dá),能維持頻速呼吸;肺中豐富的肺泡和毛細(xì)血管,以及較薄的氣-血屏障,使其能高效率進(jìn)行氣體交換[3]。據(jù)報(bào)道,牦牛肺泡間隔厚度和間隔內(nèi)的微血管密度隨牦牛年齡的增長而逐漸增加,而氣-血屏障隨年齡增長而變薄,反映牦牛肺對高原低氧的適應(yīng)性發(fā)育特點(diǎn)[4]。牦牛的血氧運(yùn)輸能力強(qiáng),其心發(fā)達(dá),血液循環(huán)快,血液容量大且紅細(xì)胞數(shù)量多、血紅蛋白含量高[5]。據(jù)報(bào)道,牦牛心臟中心肌纖維密度隨海拔升高而增加[6],心肌線粒體數(shù)量少而體積增大[7]。
基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等組學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用進(jìn)一步揭示了牦牛高原低氧適應(yīng)的分子機(jī)制。此外,HIF-1α、HIF-2α、VEGFA、EPO、GLN1等在牦牛低氧適應(yīng)中的遺傳機(jī)制得到進(jìn)一步闡明。
1.2.1 牦牛高原低氧適應(yīng)的基因組研究 高質(zhì)量參考基因組為牦牛高原適應(yīng)的全基因組水平研究提供了重要參考。2012年,Qiu等[8]通過Illumina高通量測序技術(shù)組裝了第一個(gè)雌性牦牛參考基因組,發(fā)現(xiàn)牦牛基因組中與能量代謝(CAMK2B、GCNT3、HSD17B12等)和缺氧應(yīng)激(ADAM17、ARG2、HIF-1α等)相關(guān)的基因受到正向選擇。2020年,Ji等[9]利用長讀測序和染色質(zhì)相互作用技術(shù)將牦牛參考基因組質(zhì)量進(jìn)一步提高至染色體水平,發(fā)現(xiàn)牦?;蚪M中存在許多與鐵離子功能相關(guān)的特異性基因,這可能有助于牦牛在低氧環(huán)境下的紅細(xì)胞生成調(diào)節(jié)。在2022年,Gao等[10]利用Nanopore測序和HI-C組裝獲得家牦牛和野牦牛的高質(zhì)量染色體級別參考基因組,為揭示牦牛高原適應(yīng)機(jī)制提供了更為精準(zhǔn)的參考。
研究表明,牦?;蚪M變異與海拔高度具有相關(guān)性。E等[11]利用全基因組重測序技術(shù)對15只高海拔地區(qū)牦牛和14只低海拔地區(qū)牦牛的基因組進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析,通過選擇信號分析篩選到21個(gè)與牦牛高海拔適應(yīng)相關(guān)的候選基因,如ITPR1、KLHL29、PDE4D等與低氧調(diào)控相關(guān)。Wang等[12]從16個(gè)牦牛群體基因組中鑒定到31個(gè)CNVs,注釋到了DCC、MRPS28、GSTCD、MOGAT2、DEXI、CIITA、SMYD1等與低氧適應(yīng)相關(guān)的基因。Zhang等[13]對牦?;蚪M結(jié)構(gòu)變異(structural variants, SVs)研究發(fā)現(xiàn),牦?;蚪M中能量代謝相關(guān)基因受到正向選擇。
1.2.2 牦牛高原低氧適應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組研究 研究人員通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),如信使RNA(messenger RNA, mRNA)測序、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)測序、環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)測序和微小RNA(microRNA, miRNA)測序等對牦牛肺、心組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了廣泛研究,表明牦牛通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平以適應(yīng)高原低氧。
在高海拔低氧條件下,牦牛通過改變肺組織中的基因表達(dá)以適應(yīng)低氧環(huán)境。Xin等[14]對牦牛肺組織的mRNA測序研究顯示,與低海拔牛相比,牦牛肺中血細(xì)胞增殖調(diào)控基因CD36,以及花生四烯酸代謝和卵巢類固醇生成途徑基因表達(dá)上調(diào),這有助于牦牛低氧轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Ge等[15]利用mRNA、miRNA和circRNA測序?qū)Σ煌0胃叨汝笈5姆芜M(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別有756個(gè)mRNAs、64個(gè)circRNAs和83個(gè)miRNAs與牦牛所處海拔相關(guān),其中PRKCSH的mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),有助于減輕缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。Ge等[3]對生活在3個(gè)不同海拔高度(3 400、4 200和5 000 m)的9頭牦牛肺組織進(jìn)行mRNA、lncRNA和miRNA測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多差異表達(dá)RNA來源基因參與免疫應(yīng)答和細(xì)胞周期,篩選到3個(gè)與牦牛低氧適應(yīng)密切相關(guān)的基因(PDIA4、BAX和CAPN1)。最近,Gao等[10]利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)揭示了牦牛肺細(xì)胞圖譜,發(fā)現(xiàn)一類特異的內(nèi)皮細(xì)胞亞型,篩選到攜帶SVs的低氧調(diào)控相關(guān)基因(ARNT、GATA1、MAFG、KLF5、HOXB5)。
牦牛心組織發(fā)育、功能調(diào)節(jié)相關(guān)基因參與低氧調(diào)控。Wang等[16]對牦牛和普通牛的心組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,結(jié)果篩選到6個(gè)與牦牛心低氧適應(yīng)調(diào)控相關(guān)的基因(MAPKAPK3、PXN、NFATC2、ATP7A、DISPH1和F2R)以及與之具有靶向關(guān)系的8個(gè)miRNAs(miR-195、miR1843、miR3615等)和15個(gè)circRNAs(novel-circ-017096、novel-circ-018073、novel-circ-010096等)。Ma等[17]通過分析大額牛、牦牛和牛的心mRNA轉(zhuǎn)錄組,篩選到與牦牛心發(fā)育與調(diào)節(jié)相關(guān)的重要基因(HAND2、EDRNA、ZFPM2、CHRM2),這有助于牦牛低氧環(huán)境中心功能調(diào)節(jié)。
1.2.3 牦牛高原低氧適應(yīng)的蛋白質(zhì)組研究 研究人員通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)揭示了高海拔低氧環(huán)境下,牦牛腦、心、肌肉組織的低氧適應(yīng)性蛋白質(zhì)組變化。
腦組織易受缺氧損傷,Ma等[18]利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)法對牦牛和普通牛的腦組織蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)牦牛腦組織中與缺氧環(huán)境生物能量代謝相關(guān)的蛋白增多(ALDH4A1、ALDH2),這可能增強(qiáng)了牦牛腦組織的低氧耐受性。而牦牛心中與心血管生成發(fā)育(ASB4、STAT、HRG、RHO和TSP4)、線粒體功能(ACAD8、GPDH-M、PIPMT1和ALDH2)相關(guān)的蛋白表達(dá)上調(diào),有助于心肌功能維持和能量調(diào)節(jié)[19]。
肌肉組織是氧代謝的重要部位,Long等[20]通過分析牦牛和普通牛骨骼肌蛋白質(zhì)組圖譜,發(fā)現(xiàn)NRDP1和COQ8A蛋白在牦牛中的表達(dá)水平高于普通牛,進(jìn)一步分析鑒定到與機(jī)體能量代謝相關(guān)的樞紐蛋白,如ATP50、MTHFD1、MDH2、SDHB等。Wen等[21]采用iTRAQ法分析牦牛和牛胸部最長肌差異表達(dá)蛋白,鑒定到24種核心蛋白質(zhì),如鈣螯合素1、前列腺素還原酶、ATP合成酶O亞基等與牦牛對高海拔適應(yīng)有關(guān)。Xin等[22]通過無標(biāo)記定量法分析了牦牛與中低海拔牛的臀肌蛋白質(zhì)組,發(fā)現(xiàn)牦牛體內(nèi)與能量代謝(NDUFA11、NDUFB4、COX6A2、NDUFA4)、抗氧化(TXNRDs)和葡糖糖攝取(PIK3CA、CAV1)相關(guān)的蛋白表達(dá)上調(diào)。這些研究表明,牦??赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)與能量代謝相關(guān)的蛋白表達(dá)水平以適應(yīng)高原低氧環(huán)境。
1.2.4 牦牛低氧調(diào)控基因的表達(dá)
1.2.4.1HIF-1α:缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factors 1 alpha,HIF-1α)是一種保守的氧敏感轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控因子,是組成缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)復(fù)合物的活性亞基。HIF-1α在機(jī)體組織的缺氧生理調(diào)控中具有重要作用[23-24],常氧條件下HIF-1α蛋白在合成后經(jīng)泛素化-蛋白酶途徑快速降解,缺氧時(shí)HIF-1α蛋白的降解受到阻遏而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積聚,隨后進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-1β二聚化形成HIF-1復(fù)合體,HIF-1通過招募共激活因子、與DNA結(jié)合等方式誘導(dǎo)HIF靶基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而參與調(diào)節(jié)機(jī)體生理過程,如糖酵解[25]、血管生成[26]、細(xì)胞凋亡[27]等。
牦牛高原低氧適應(yīng)與其機(jī)體內(nèi)廣泛表達(dá)的HIF-1α密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),高山放牧牦牛肝、心、肺、腎等器官組織的HIF-1α表達(dá)水平顯著高于低海拔飼養(yǎng)牦牛(P<0.05)[28]。牦牛肺組織如肺泡、終末細(xì)支氣管的環(huán)形平滑肌具有較高的HIF-1α蛋白水平[29]。HIF-1α在牦牛腦組織中的廣泛表達(dá)對腦細(xì)胞缺氧損傷具有保護(hù)作用。后腦組織中,牦牛小腦蚓前葉具有較高的HIF-1α表達(dá)水平,主要分布于延髓、腦橋神經(jīng)元、小腦半球等神經(jīng)元[30]。間腦組織中,HIF-1α蛋白水平在垂體中較高,主要分布于垂體神經(jīng)元、多形細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞等細(xì)胞的胞質(zhì)中[31]。而在牦牛端腦組織中,HIF-1α在頂葉組織中的表達(dá)水平最高[32]。此外,HIF-1α在牦牛腦組織中的表達(dá)分布呈現(xiàn)年齡差異,成年牦牛的小腦皮質(zhì)、梨狀葉、髓質(zhì)和胼胝體具有較高的HIF-1α表達(dá)水平,而青年牦牛的小腦白質(zhì)、松果腺、胼胝體和小腦皮質(zhì)中HIF-1α表達(dá)水平相對較高[33]。
1.2.4.2HIF-2α:低氧誘導(dǎo)因子2α(hpoxia inducible factors 2 alpha,HIF-2α),也稱為內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白1(endothelial PAS domain-containing protein 1,EPAS1),與HIF-1α同屬低氧誘導(dǎo)因子α亞基的不同亞型,兩者具有48%的氨基酸序列同源性和相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),功能相似,HIF-2α也受機(jī)體氧濃度調(diào)節(jié)。HIF-2α主要參與調(diào)控機(jī)體慢性缺氧,輕度或生理性缺氧時(shí)HIF-2α的表達(dá)可持續(xù)48 ~ 72 h[34]。
HIF-2α基因在高原哺乳動(dòng)物中受到正向選擇,包括牦牛[35]。Guan等[36]對來自18個(gè)不同海拔地區(qū)的303個(gè)牦牛個(gè)體的HIF-2α基因進(jìn)行分型,鑒定到單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs382449952的TT基因型頻率與海拔高度顯著相關(guān)(P<0.05)。此外,HIF-2α在牦牛腦垂體、輸卵管組織中的表達(dá)水平比黃牛高[37],其在肺中的表達(dá)水平與年齡呈正相關(guān)[38]。
1.2.4.3VEGFA:血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)是血管內(nèi)皮生長因子家族的成員之一,VEGFA參與調(diào)控血管發(fā)生和再生過程,如血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和血管通透性等[39]。
VEGFA在牦牛肺中的表達(dá)水平隨年齡增長而變化,有助于不同年齡牦牛的低氧適應(yīng)。Wan等[4]對青海省鹽縣牦牛1、30、180日齡和成年牦牛肺膈葉VEGFA蛋白水平進(jìn)行分析,結(jié)果顯示30日齡牦牛肺膈葉VEGFA蛋白水平最高,180日齡次之,成年牦牛最低。而周娟等[40]對大通牦牛的研究顯示,1日齡牦牛VEGFA蛋白水平高于30日齡,隨后在180日齡和成年牦牛中升高且高于1日齡。因此,不同品種牦牛在長期自然適應(yīng)過程中,因其遺傳背景、生存環(huán)境等的不同而在高原低氧的適應(yīng)性發(fā)育規(guī)律上存在區(qū)別。
1.2.4.4EPO:促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)是一種循環(huán)糖蛋白激素,通過激活促紅細(xì)胞生成素受體來促進(jìn)紅細(xì)胞的增殖和抗凋亡[41]。缺氧誘導(dǎo)EPO的表達(dá),EPO通過氧敏感反饋回路參與機(jī)體缺氧生理調(diào)控[42]。研究表明,當(dāng)平原居民進(jìn)入高原時(shí),EPO的表達(dá)在48 h內(nèi)迅速達(dá)到峰值,刺激紅細(xì)胞的代償性生成以緩解機(jī)體缺氧[43]。
牦牛EPO基因具有遺傳多態(tài)性,且具有顯著的海拔高度相關(guān)性。趙麗玲等[44]對分布在不同海拔高度的中甸牦牛、麥洼牦牛、斯布牦牛、類烏齊牦牛、帕里牦牛和申扎牦牛的EPO基因序列進(jìn)行分析,鑒定到3個(gè)SNPs位點(diǎn):rs527G→A、rs1031A→T、rs1192T→C,通過單倍型分析,EPO基因ATC單倍型在牦牛中的分布頻率隨海拔升高而升高,表明EPO基因與牦牛高原低氧適應(yīng)密切相關(guān)。此前的一項(xiàng)研究顯示,九龍牦牛EPO基因外顯子3、4、5區(qū)段存在5個(gè)突變位點(diǎn),包含一個(gè)錯(cuò)義突,導(dǎo)致編碼氨基酸由亮氨酸變?yōu)楣劝滨0穂45],EPO的多態(tài)性可能促進(jìn)牦牛低氧適應(yīng)。
1.2.4.5EGLN1:GL-9家族缺氧誘導(dǎo)因子1(egl-9 family hypoxia inducible factor 1,EGLN1)編碼一種脯氨酸羥基化酶,該酶在細(xì)胞正氧環(huán)境中發(fā)生自氧化活化,促進(jìn)HIF-1α蛋白的脯氨酸羥基化途徑降解;而在缺氧環(huán)境中失去活性[46]。
EGLN1是牦牛高原低氧調(diào)控途徑的重要候選基因[47-48]。牦牛EGLN1基因具有遺傳多態(tài)性,Zeng等[49]從牦牛EGLN1基因上鑒定到突變位點(diǎn)c.482A→G,該突變位點(diǎn)GG基因型僅在牦牛中出現(xiàn),基因型頻率高達(dá)0.893。Liu等[50]的研究顯示,EGLN1突變位點(diǎn)rs1769793的T等位基因與EGLN1在牦牛骨骼肌和海馬組織中的轉(zhuǎn)錄水平下降顯著相關(guān),這可能有助于牦牛長期適應(yīng)高海拔低氧環(huán)境。
牦牛長期面臨低溫、飼草短缺的生境挑戰(zhàn),如青藏高原夏季平均溫度不足10 ℃,冬季時(shí)間長,約為每年的11月至次年的5月[51]。經(jīng)過長期適應(yīng)和自然選擇,牦牛在生理表型和機(jī)體生理調(diào)控上表現(xiàn)出高原高寒環(huán)境適應(yīng)性特征。
1.戰(zhàn)略決定組織機(jī)構(gòu)。戰(zhàn)略對于組織機(jī)構(gòu)的決定性影響是由戰(zhàn)略的前導(dǎo)性與結(jié)構(gòu)的滯后性所決定的。當(dāng)企業(yè)意識到外部環(huán)境和內(nèi)部條件的改變?yōu)槠涮峁┝诵碌臋C(jī)會(huì)和市場需求時(shí),為謀求經(jīng)濟(jì)效益增長,企業(yè)首先會(huì)對戰(zhàn)略目標(biāo)進(jìn)行變革,以便企業(yè)適應(yīng)新的市場環(huán)境和形勢。而企業(yè)組織機(jī)構(gòu)的改變往往在戰(zhàn)略的變革之后發(fā)生。因此,新的企業(yè)戰(zhàn)略制定出來之后,企業(yè)才能根據(jù)新戰(zhàn)略的要求制定改變企業(yè)舊的組織結(jié)構(gòu),來保證戰(zhàn)略的執(zhí)行效率。如果舊的組織機(jī)構(gòu)管理人員不執(zhí)行改革的決定,組織機(jī)構(gòu)就不能適應(yīng)新的戰(zhàn)略要求,從而影響企業(yè)的長期發(fā)展。由此可見,戰(zhàn)略總是先于組織機(jī)構(gòu)進(jìn)行變革,組織機(jī)構(gòu)隨后做出反應(yīng),這決定了企業(yè)戰(zhàn)略對于組織機(jī)構(gòu)的決定性作用。
牦牛被毛生長具有高寒適應(yīng)性特點(diǎn)。牦牛被毛色雜多為黑色,毛型在暖季以粗毛為主,冷季期間絨毛生長增加,以增加保暖性。濃密的被毛有助于牦牛在高原低溫、大風(fēng)、大雪等高寒環(huán)境中維持軀體溫度[52]。此外,牦牛皮脂腺發(fā)達(dá),皮脂分泌旺盛而排汗較少,皮膚分泌的皮脂有助于減少體表熱量的散失,增強(qiáng)牦牛在低溫環(huán)境的生存力。脂肪沉積和代謝是牦牛適應(yīng)高寒環(huán)境的重要能量保障。牦牛體重隨季節(jié)變化明顯,有“夏肥-秋壯-冬瘦-春乏”之說,體重增減幅度可達(dá)30%[53]。暖季期間植被茂盛,營養(yǎng)水平高,牦牛攝食后快速將多余能量轉(zhuǎn)化為脂肪;至冬季飼草短缺時(shí),牦牛依賴于體內(nèi)脂肪以維持機(jī)體能量平衡。
牦牛瘤胃微生物組成的季節(jié)性變化也有利于維持牦牛機(jī)體能量平衡。據(jù)報(bào)道,牦牛在低能量水平攝入時(shí),其瘤胃微生物組成有利于提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率,以獲取更多的能量,進(jìn)而增強(qiáng)牦牛在冷季牧草短缺的生存力[54]。此外,牦牛瘤胃微生物組成有利于牦牛適應(yīng)不同生長期牧草的營養(yǎng)水平變化,Ma等[55]利用基因組測序方法對牦牛瘤胃微生物組成在不同牧草生長期的變化進(jìn)行研究,結(jié)果顯示牧草再綠期微生物組成以類桿菌(51.82%)為主,這有利于牦牛對飼草粗蛋白的消化吸收和身體恢復(fù);而枯草期牧草纖維含量高時(shí),疣狀芽胞桿菌、豆?fàn)钛堪麠U菌、藍(lán)藻和纖維桿菌等數(shù)量增多,以幫助牦牛提高能量吸收率。Zou等[56]的研究顯示,牦牛處于饑餓狀態(tài)時(shí),瘤胃蛋白質(zhì)降解細(xì)菌數(shù)量減少,反硝化細(xì)菌增多,這些變化在一定程度上提高了牦牛對饑餓的耐受力。
2.2.1 牦牛被毛周期性發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究 牦牛毛發(fā)的周期循環(huán)生長有助于牦牛適應(yīng)高原不同季節(jié)的氣候溫度變化[57]。Bao等[58]采用mRNA轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對牦牛毛發(fā)生長周期不同時(shí)間點(diǎn)的毛囊細(xì)胞基因表達(dá)模式進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,牦牛毛囊細(xì)胞的基因表達(dá)模式分為生長期、退行期和休止期3個(gè)階段。在生長期,WNT、FGF通路中等參與激活毛囊生長的基因高度表達(dá);在退行期BMP4、Wise等抑制分化和促進(jìn)毛囊細(xì)胞凋亡的基因高度表達(dá);在休止期DKK1、BMP1等抑制毛囊活動(dòng)的基因高度表達(dá)。Zhang等[59]利用mRNA和lncRNA測序?qū)﹃笈IL毛發(fā)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究,發(fā)現(xiàn)FER、ELMO1、PCOLCE、HOXC13、CPEB1等基因參與牦牛毛發(fā)周期調(diào)控。通過研究牦牛毛發(fā)周期生長的基因表達(dá)調(diào)控模式,不僅有助于揭示牦牛高原高寒適應(yīng)的毛發(fā)生長機(jī)制,還可為調(diào)控牦牛毛絨生長提供理論依據(jù),以促進(jìn)牦牛毛絨產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
2.2.2 牦牛脂肪沉積及代謝機(jī)制研究 牦牛體內(nèi)脂肪沉積受營養(yǎng)水平、性別、年齡影響。暖季牧草營養(yǎng)價(jià)值高,牦牛體內(nèi)升高的不飽和脂肪酸水平激活氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPAR)信號,促進(jìn)脂肪組織的沉積,牦牛肌肉脂肪和內(nèi)臟脂肪逐漸增加[60]。與雌性牦牛相比,雄性牦牛肌肉多不飽和脂肪酸相對含量較低,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)兩者的脂肪合成相關(guān)基因(ME1、SCD、ACSL5、LPL、FABP1、PLIN4和PLIN2等)表達(dá)水平存在差異[61]。成年牦牛較幼年牦牛具有較高的肌內(nèi)脂肪含量,使其具有更強(qiáng)的耐寒性。Wang等[62]的研究顯示,隨年齡增長,牦牛肌內(nèi)脂肪增多,這與不同年齡牦牛脂肪細(xì)胞中脂肪代謝相關(guān)基因(SREBF1、ACADL)差異表達(dá)有關(guān)。Zhang等[63]的研究顯示,circRNA(novel_circ_0009127、novel_circ_0000628、novel_circ_0011513、novel_circ_0010775、novel_circ_0006981 和 novel_circ_0001494)參與牦牛脂肪細(xì)胞分化過程。此外,有研究顯示,牦牛脂肪細(xì)胞與前脂肪細(xì)胞的N6-腺苷酸甲基化(m6A)水平存在差異,m6A可能通過調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)基因(KLF9、FOXO1、ZNF395、UHRF1)的表達(dá)參與調(diào)節(jié)牦牛脂肪細(xì)胞分化[64]。
在冷季牧草短缺時(shí)期,牦牛通過脂代謝、糖異生等途徑獲得穩(wěn)定的能量來源。Xiong等[65]對不同季節(jié)放牧牦牛的脂代謝進(jìn)行研究,結(jié)果顯示枯草期放牧的牦牛皮下脂肪中飽和脂肪酸的比例低于牧草旺盛期放牧牦牛,但多不飽和脂肪酸比例更高。同時(shí)檢測到牦牛皮下脂肪中與甘油轉(zhuǎn)運(yùn)和多不飽和脂肪酸合成相關(guān)基因(AQP7、ACSL、ELOVL、FADS1)表達(dá)上調(diào),與脂肪分解代謝、脂肪合成代謝和脂肪酸氧化相關(guān)基因(GPAT4、HSL、PNPLA2、ACAD、ACOT8、GLUT4、OXSM、HSD17B8、ACSF3)表達(dá)下調(diào)。Zheng等[66]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)研究冷季牦牛肝的能量代謝機(jī)制,結(jié)果顯示,冷季期牦牛體內(nèi)代謝物變化明顯,213種代謝產(chǎn)物上調(diào),93種代謝產(chǎn)物下調(diào);血液中的葡萄糖、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、脂蛋白脂肪酶、胰島素和胰島素樣生長因子1均顯著降低(P<0.05)。與此同時(shí),PPAR和PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因(LDLR、HMGCR、IGF1R等)和脂質(zhì)合成(SCD、FASN、FADS2和SLC27A2)、脂肪酸氧化(ACC-β)和脂質(zhì)分解代謝(FABP4)相關(guān)基因表達(dá)下調(diào),糖異生代謝增強(qiáng)。
牦牛通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)的方式調(diào)控機(jī)體脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài),避免機(jī)體能量的過度消耗。β-羥基丁酸酯(β-hydroxybutyrate, BHBA)是脂質(zhì)分解產(chǎn)生的主要酮體,與GPR109A蛋白受體結(jié)合參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)。Zou等[67]通過BHBA注射對斷食牦牛脂質(zhì)代謝的影響機(jī)制進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,對饑餓牦牛注射BHBA后,牦牛皮下脂肪組織中GPR109A基因的mRNA表達(dá)上調(diào),AC和PKA的mRNA表達(dá)下調(diào),CREB1的磷酸化蛋白豐度降低,脂肪細(xì)胞的直徑和面積均顯著增加(P<0.05),表明BHBA對牦牛饑餓時(shí)期的脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)具有調(diào)節(jié)作用,通過調(diào)節(jié)GPR109A表達(dá)及AMP/PKA/CREB信號途徑來實(shí)現(xiàn)。
近期的組學(xué)研究顯示,牦牛體內(nèi)免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平較高。Xin等[14]通過mRNA測序比較牦牛、臧牛、三江牛和荷斯坦牛的臀肌轉(zhuǎn)錄組,發(fā)現(xiàn)牦牛體內(nèi)IL3、IL6等免疫相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。Ma等[17]通過mRNA測序比較牦牛和普通牛脾轉(zhuǎn)錄組差異,牦牛體內(nèi)免疫相關(guān)基因CXCR4、CD40LG、CXCL14等表達(dá)上調(diào)。Zheng等[73]利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記(TMT)定量方法對3個(gè)發(fā)育階段(1日齡、15月齡和5歲齡)的牦牛脾進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,結(jié)果顯示年齡較大的牦牛脾中具有較高的免疫功能相關(guān)蛋白水平,如TRAF1、TCR、FcR、GGT等。
雄性牦牛性成熟較晚,2歲齡時(shí)產(chǎn)生成熟精子,牦牛精子頭部較短,尾部較長,精子活力高,6~7歲是牦牛生殖力旺盛階段[74]。牦牛在高原低氧、高寒、飼料短缺等極端環(huán)境下仍可保持較好的繁殖力。目前,較多研究集中在牦牛睪丸、附睪的組學(xué)研究以及生殖基因表達(dá)等方面。
牦牛睪丸蛋白質(zhì)組隨年齡增長而變化。Ruan等[75]利用雙向電泳法對1、2、4和8歲齡牦牛睪丸的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行測定,結(jié)果檢測到29個(gè)差異表達(dá)蛋白,這些蛋白參與分子結(jié)合、催化、抗氧化等功能,其中血清蛋白前體和肝癌衍生生長因子1在睪丸中的水平隨牦牛年齡增長而增加,而谷胱甘肽過氧化酶Ⅰ、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29、過氧化物酶氧還蛋白6、過氧化物酶氧還蛋白2和黃素還原酶1的水平則隨年齡增長降低。Zhao等[76]利用RNA測序技術(shù)對牦牛附睪不同區(qū)域的miRNA表達(dá)模式進(jìn)行研究,結(jié)果鑒定到683個(gè)差異表達(dá)的已知miRNAs,這些差異表達(dá)miRNAs參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、吞噬體、剪接體中的蛋白質(zhì)加工,氨基酸生物合成等。其中miR-34c在牦牛附睪頭具有較高的表達(dá)水平,這可能與附睪頭、附睪體和附睪尾功能差異有關(guān)。
青年期后牦牛隨年齡增大而生殖力降低,可能與其生殖基因表達(dá)水平的降低有關(guān)。過渡蛋白2(transition protein 2,TNP2)參與調(diào)節(jié)精子發(fā)生[77],其在牦牛睪丸中的蛋白水平從初生期到老年期先增加后降低,性成熟初期時(shí)表達(dá)量最高,主要表達(dá)于圓形精子細(xì)胞和長形精子細(xì)胞[78]。組蛋白脫乙酰酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)參與調(diào)節(jié)精子減數(shù)分裂[79],其在睪丸中的蛋白水平從幼年期到老年期不斷降低[80]。水通道蛋白1(aquaporin 1,AQP1)參與調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng),AQP1在青年牦牛睪丸中的轉(zhuǎn)錄本和蛋白表達(dá)水平顯著高于初生、中年和老年時(shí)期牦牛[81]。
雌性牦牛性成熟時(shí)間很大程度上受其體重影響,一般在2~2.5歲產(chǎn)生成熟卵子。雌性牦牛呈季節(jié)性發(fā)情,發(fā)情時(shí)間主要為6~10月,發(fā)情周期約為20 d,妊娠期約為255 d,一般兩年一胎或三年兩胎[82]。雌性牦牛的繁殖水平受天氣、營養(yǎng)、年齡、體況等多種因素的影響[83]。營養(yǎng)充足的雌性牦牛體況更好,卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量更優(yōu)[84],通過補(bǔ)飼可有效提高雌性牦牛身體狀況評分、發(fā)情率、受胎率、產(chǎn)犢重及產(chǎn)后體況恢復(fù)速度[85]。
牦牛發(fā)情受激素調(diào)節(jié),發(fā)情牦牛的黃體生成素(luteotropic hormone,LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,F(xiàn)SH)水平顯著高于未發(fā)情牦牛,卵泡數(shù)量更多[86]。此外,氣候影響牦牛激素水平,夏季牦牛血液中褪黑素含量明顯高于冬季,卵巢質(zhì)量更大。另外,基因表達(dá)水平的變化影響牦牛發(fā)情。Chen等[87]通過mRNA轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分測序技術(shù)分析妊娠牦牛和產(chǎn)后牦牛乏情卵巢分子調(diào)控機(jī)制,結(jié)果顯示BHLHE40、SF1IX1、FBPX1、HSPCA、LHCGR、BMP15和ET-1R是調(diào)控牦牛產(chǎn)后發(fā)情的關(guān)鍵基因。而在牦牛成熟卵泡蛋白質(zhì)組研究中,卵泡發(fā)育相關(guān)蛋白(RPL3、RPL5、EIF3J、EIF4G2、DEP、DDX1等)的發(fā)現(xiàn)也有助于牦牛產(chǎn)后發(fā)情調(diào)控。
牦牛卵母細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育受基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。如GPR50、KAT8、ENPP2、TGF-β1等。G蛋白偶聯(lián)受體50(G protein-coupled receptor 50,GPR50)參與調(diào)節(jié)牦牛卵母細(xì)胞的體外成熟過程,敲除GPR50后,牦牛卵母細(xì)胞第一極體排出率和成熟率均顯著降低(P<0.05)[88]。蛋白乙酰化酶8(K (lysine) acetyltransferase 8,KAT8)是卵母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵抗氧化調(diào)節(jié)基因,KAT8在牦牛卵母細(xì)胞成熟過程中持續(xù)表達(dá)[89]。胞外焦磷酸酶/磷酸酯酶2(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2,ENPP2)參與卵母細(xì)胞成熟過程[90],其在牦牛卵巢、輸卵管和子宮組織廣泛表達(dá)[91]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)是卵母細(xì)胞成熟調(diào)節(jié)基因,王楠等[92]的研究顯示,與普通牛相比,牦牛TGF-β1基因存在錯(cuò)義突變1168.A→G,編碼丙氨酸突變?yōu)楦拾彼幔琓GF-β1在雌性牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢中差異表達(dá)。
牦牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育受空氣氧濃度、基因甲基化水平及添加因子影響。適當(dāng)?shù)目諝庋鯘舛却龠M(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟及胚胎發(fā)育,與20%、10%和1%氧濃度相比,5%氧濃度培養(yǎng)環(huán)境下的卵母細(xì)胞具有更高的成熟率、卵裂率和囊胚率以及囊胚細(xì)胞數(shù)[93]。基因組甲基化參與調(diào)節(jié)牦牛卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育,Xiong等[94]的研究顯示,miR-342-3p通過靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)調(diào)控基因組甲基化水平參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂。Li等[95]利用50 μg·mL-1抗壞血酸處理胚胎后,DNMT1、DNMT3a和TET3甲基化水平降低,mRNA轉(zhuǎn)錄豐度上調(diào),胚胎細(xì)胞數(shù)量增多。外源補(bǔ)充添加因子促進(jìn)牦牛卵母細(xì)胞體外成熟,Pan等[96]的研究顯示,在牦牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中添加5 ng·mL-1FGF10可以調(diào)節(jié)DNA甲基化及CD9、CD81、DNMT1、DNMT3B表達(dá)水平,進(jìn)而提高牦牛卵母細(xì)胞受精能力和隨后的囊胚質(zhì)量。此外,在體外成熟液中補(bǔ)充β-雌二醇(E2)也可以促進(jìn)卵丘擴(kuò)張和卵母細(xì)胞的發(fā)育,其對HAS2、PTGS2、PTX3和OSFs等與卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)具有上調(diào)作用[97]。
牦牛馴化至今已有數(shù)千年,自古以來,牦牛對于高原地區(qū)的歷史文化傳承和畜牧經(jīng)濟(jì)發(fā)展均具有重要意義。探究牦牛高原適應(yīng)機(jī)制,不僅有利于加深人們對牦牛品種特性的了解,也有助于推進(jìn)高原地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展和種質(zhì)資源保存。近年來,組學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,不僅加深了人們對牦牛高原低氧、高寒適應(yīng)生理結(jié)構(gòu)特征的認(rèn)識,還進(jìn)一步揭示了牦牛高原適應(yīng)的分子機(jī)制,挖掘到許多重要功能基因,也為牦??共∮N和繁殖調(diào)控提供了重要理論依據(jù)。但現(xiàn)有研究還不足以闡明牦牛高原適應(yīng)機(jī)制,隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的深入,有望對牦牛高原適應(yīng)生理基礎(chǔ)和分子調(diào)控機(jī)制作出更為明確的闡釋。