未張怡，韓 飛，范婷婷，陳子賢，李寒梅，袁非凡，叢日華*，李 賢*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100； 2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥物與化工分院，楊凌 712199)

雞大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一種細菌性感染病，壅結(jié)于腸出現(xiàn)拉稀糞，熱邪傷肝可見肝表面有灰白色壞死點，其基本證候類型是濕熱壅積[1]。當(dāng)雞群受該菌感染后會造成嚴重影響，如：器官受損、飼料利用率降低、死淘率增加等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，致病性大腸桿菌進入機體后，血液可吸收由菌體裂解釋放的內(nèi)毒素從而引起肝組織病理學(xué)損傷、肝細胞凋亡、氧化損傷和脂肪細胞因子增加[3-5]，且對肝功能和代謝的影響呈劑量依賴性。肝是機體代謝主要器官，尤其對脂質(zhì)合成、分解和運輸發(fā)揮著重要作用[6]。肝組織受損可引起膽固醇代謝活動異常。以往研究發(fā)現(xiàn)，用鼠檸檬酸桿菌處理小鼠來模擬大腸桿菌病生理模型，膽固醇生物合成顯著上調(diào)[7]；采用內(nèi)毒素處理小鼠，肝組織膽固醇和甘油三酯合成增加[8]。然而，有關(guān)致病性大腸桿菌感染影響肉雞肝組織膽固醇代謝的研究目前相對較少。

苦參為豆科槐屬植物苦參的干燥根，性寒味苦，其作為一種常用中藥已廣泛用于生產(chǎn)實踐，具有清熱燥濕、解毒殺蟲等功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其還有抗菌消炎和增強機體免疫力等作用[9]，同時有研究表明，苦參還具有抗高脂飼料性脂肪性肝炎的作用。研究發(fā)現(xiàn)，苦參可使高脂血癥大鼠肝組織中甘油三酯(hepatic triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TCH)，血清中TG、TCH、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)顯著降低[10-11]。蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)或北蒼術(shù)的干燥根，有健脾燥濕、祛風(fēng)散寒等功能，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，該藥材具有抗菌消炎、保肝、降血糖等作用[12]，同時有研究表明，蒼術(shù)具有抗脂肪形成的作用。研究發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)可抑制由高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體重增加以及血清TCH和肝脂質(zhì)水平增加[13-14]?？鄥⑸n術(shù)均有抗菌消炎作用，兩藥合用可使抗菌作用增強。研究發(fā)現(xiàn)，苦參蒼術(shù)對炎性物質(zhì)刺激具有明顯抵抗作用，從而減輕炎癥反應(yīng)[15]。它還可以顯著降低由大腸桿菌導(dǎo)致的雞死亡率的增加，改善雞的生長發(fā)育受阻[16]。然而，苦參蒼術(shù)顆粒是否可通過調(diào)控肝組織膽固醇代謝途徑，來緩解大腸桿菌所致肉雞肝組織膽固醇合成異常，目前還不清楚。因此，本試驗擬以人工胸部肌肉注射致病性大腸桿菌肉雞為研究模型，并在飲水中添加不同濃度苦參蒼術(shù)顆粒，探究其通過影響肝組織膽固醇代謝來緩解肉雞肝組織膽固醇合成異常的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥材

苦參蒼術(shù)顆粒劑，由西安康樂動物藥業(yè)有限公司贈送，生產(chǎn)工藝：先取蒼術(shù)加水蒸餾，收集蒸餾液，4 ℃冷藏后分離油層，得揮發(fā)油備用；取苦參加水煎煮2次，提取沸液，濾過，濃縮后用75%乙醇4 ℃過夜沉淀，濾過回收乙醇，加水至每1 mL含生藥約1.5 g，調(diào)節(jié)pH至9.0～11.0，用三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷液，濾過，回收溶劑至無三氯甲烷氣味，得浸膏，用一步制粒機霧化顆粒備用，蒼術(shù)揮發(fā)油加入吐溫-80，隨后加入顆粒中混合均勻即可?？鄥⑸n術(shù)藥物提取生產(chǎn)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)見表1，苦參蒼術(shù)藥物制劑質(zhì)量控制要點見表2。

表1 苦參蒼術(shù)藥物提取生產(chǎn)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Quality control standards of extraction and production of kushen-cangzhu granules

表2 苦參蒼術(shù)藥物制劑質(zhì)量控制要點Table 2 Key points of quality control of drug preparation of kushen-cangzhu granules

1.2 試驗試劑

禽致病性大腸桿菌菌液，由西北農(nóng)林科技大學(xué)微生物實驗室提供；蘇木精-伊紅染色液，購自北京索萊寶科技有限公司；總膽固醇(TCH酶法)測試盒(液體)，購自南京建成生物科技有限公司；甘油三酯(TG酶法)測試盒(液體)，購自南京建成生物科技有限公司；血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測試盒(液體沉淀分離法)，購自南京建成生物科技有限公司；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒(雙試劑直接法)(酶標(biāo)儀及生化分析儀)，購自南京建成生物科技有限公司；TRIzol總RNA提取試劑盒，購自康潤生物科技有限公司；2×SYBR Green qPCR Master mix，購自Vazyme生物科技有限公司；Hiscript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)，購自Vazyme生物科技有限公司。

1.3 試驗動物分組與處理

試驗動物選用1日齡健康白羽肉雞40只，公母比例1∶1，飼養(yǎng)方式為籠養(yǎng)，室內(nèi)溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%。將白羽肉雞正常飼喂至21日齡后，隨機分為5組，每組8只，編號后由胸部肌肉注射菌液進行致病。

A組為空白對照組，胸部肌肉注射0.9%的氯化鈉溶液；

B組為模型對照組，接種0.7 mL致病性大腸桿菌菌液(8.37 ×108CFU·mL-1)；

C組接種菌液24 h后，苦參蒼術(shù)低劑量(3.6 g·L-1)飲水給藥，給藥7 d，同時進行觀察記錄；

D組接種菌液24 h后，苦參蒼術(shù)中劑量(5.5 g·L-1)飲水給藥，給藥7 d，同時進行觀察記錄；

E組接種菌液24 h后，苦參蒼術(shù)高劑量(7.3 g·L-1)飲水給藥，給藥7 d，同時進行觀察記錄。

1.4 樣品采集與處理

苦參蒼術(shù)顆粒給藥7 d后進行樣品采集，每組挑選6只最接近平均體重的肉雞進行靜脈采血，在4 ℃條件下3 500×g離心10 min，取血清-30 ℃保存?zhèn)溆?。隨后將肉雞放血處死后，剖開腹腔立即采集肝組織，其中一部分經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存供后期使用，另一部分組織浸于4%的多聚甲醛溶液中固定供制備石蠟切片備用。

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 器官指數(shù) 肉雞剖前對每只雞進行稱重，稱重后解剖，解剖后迅速分離各個臟器，用生理鹽水沖洗臟器上的血漬，吸干水分后稱重，使用以下公式進行計算：內(nèi)臟器官指數(shù)=內(nèi)臟器官重量(g)/宰前活重(kg)。

1.5.2 血清膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平測定 取-30 ℃保存的血清，送往楊凌示范區(qū)醫(yī)院進行血常規(guī)檢測。

1.5.3 肝組織膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白測定 先采用氯仿/甲醇萃取法提取，提取方法參考文獻[17]，然后按照試劑盒說明書操作。

1.5.4 肝組織形態(tài)切片的制作和觀察 肉雞解剖后，迅速將肝分離，在肝左葉邊緣無損傷部位取樣，使用多聚甲醛固定，取適當(dāng)大小的組織，進行流水沖洗、脫水、透明、浸蠟包埋。使用石蠟切片機切厚度5 μm，進行HE染色。在研究級正置顯微鏡(Ni-U，尼康公司，東京，日本)下觀察，并拍照。

1.5.5 實時熒光定量qPCR檢測肉雞肝組織膽固醇合成相關(guān)基因mRNA的表達 將凍存于-80 ℃的肝組織樣品取出，剪取50 mg組織樣品加入離心管中剪碎，每管加入1 mL TRIzol和陶瓷珠子，在組織破碎儀(歐諾儀器，天津，中國)進行破碎。參考說明書提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。合成的cDNA樣品，采用RT-qPCR檢測膽固醇合成相關(guān)因子HMGCR、SREBP2、SCAP、胰島素誘導(dǎo)基因1(Insig1)、胰島素誘導(dǎo)基因2(Insig2)和CYP7A1的mRNA水平的變化。在PubMed數(shù)據(jù)庫查詢相關(guān)基因的mRNA序列，截取保守序列區(qū)片段，利用Pick Primer設(shè)計擴增目的基因的引物序列，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，序列詳見表3。

表3 引物信息Table 3 Primers information

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2019對肉雞肝臟指數(shù)、血清和肝組織膽固醇水平進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用RT-qPCR技術(shù)對40只肉雞膽固醇合成關(guān)鍵因子HMGCR、SREBP2、SCAP、Insig1、Insig2、CYP7A1 mRNA相對表達量進行分析后用Excel 2019對肝組織膽固醇合成關(guān)鍵因子進行統(tǒng)計處理，采用SPSS 26.0中的單因子方差分析(one-way ANOVA)、多重比較(LSD)法、獨立樣本T檢驗分析添加苦參蒼術(shù)顆粒及大腸桿菌菌液對肉雞肝臟指數(shù)、血清和肝組織膽固醇水平、肝組織膽固醇合成關(guān)鍵因子的影響。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。以P<0.01為差異極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。用Graphpad Prism 7作圖。

2 結(jié) 果

2.1 苦參蒼術(shù)顆粒劑對白羽肉雞肝臟指數(shù)的影響

如表4所示，和空白對照組相比，模型對照組肉雞體重顯著降低(P<0.05)；低劑量組肉雞體重顯著高于模型對照組(P<0.05)。各處理組間肝重?zé)o差異。和空白對照組相比，模型對照組肝臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)；而低劑量組肝臟指數(shù)和模型對照組相比顯著降低(P<0.05)。

表4 飲水中添加苦參蒼術(shù)顆粒對肉雞肝臟指數(shù)的影響(n=8)Table 4 Effect of supplemented kushen-cangzhu granules in drinking water on liver index of broilers (n=8)

2.2 苦參蒼術(shù)顆粒劑對白羽肉雞肝組織形態(tài)的影響

飲水中添加苦參蒼術(shù)顆粒對肉雞肝組織形態(tài)的影響見圖1。如圖所示，空白對照組肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常。和空白對照組相比，模型對照組肝血竇擴張充血(見黑色箭頭)，肝小葉中央靜脈周圍和肝血竇內(nèi)有大量炎性細胞浸潤(見紅色箭頭)，肝細胞排列紊亂，胞漿界限模糊(見紅色圓圈區(qū)域)。飲水中添加苦參蒼術(shù)顆粒后有效緩解致病性大腸桿菌導(dǎo)致的肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組A. Blank control group; B. Model control group; C. Low-dose group; D. Medium-dose group; E. High-dose group圖1 飲水中添加苦參蒼術(shù)顆粒對肉雞肝組織形態(tài)的影響(n=3)Fig.1 Effect of supplemented kushen-cangzhu granules in drinking water on liver histomorphology in broilers (n=3)

2.3 苦參蒼術(shù)顆粒劑對白羽肉雞血清膽固醇和甘油三酯水平的影響

不同處理肉雞血清TCH和TG的變化見表5。

表5 飲水中添加苦參蒼術(shù)顆粒對血清膽固醇和甘油三酯的影響(n=6)Table 5 Effect of supplemented kushen-cangzhu granules in drinking water on serum cholesterol and triglyceride (n=6) mmol·mL-1

血清中TCH、HDL-C和LDL-C含量及 LDL-C/HDL-C比值在各組間未見差異。和空白對照組相比，模型對照組血清TG含量顯著增加(P<0.05)；而低、高劑量組血清TG含量與模型對照組相比顯著降低(P<0.05)。

2.4 苦參蒼術(shù)顆粒劑對白羽肉雞肝組織中總膽固醇和甘油三酯水平的影響

不同處理肉雞肝組織中總膽固醇和甘油三酯水平的變化見表6。中、高劑量組肝TCH含量顯著高于空白對照組(P<0.05)。模型對照組、各劑量組TG含量均顯著低于空白對照組(P<0.05)。中劑量組HDL-C含量顯著高于模型對照組(P<0.05)，而LDL-C含量在苦參蒼術(shù)顆粒各劑量組均顯著高于模型對照組(P<0.05)，中、高劑量組LDL-C/HDL-C的比值均顯著高于模型對照組(P<0.05)。

表6 飲水中添加苦參蒼術(shù)對肝組織膽固醇和甘油三酯的影響(n=6)Table 6 Effect of supplemented kushen-cangzhu granules in drinking water on liver cholesterol and triglyceride (n=6) mmol·mL-1

2.5 苦參蒼術(shù)顆粒劑對肉雞肝組織膽固醇代謝相關(guān)基因的影響

不同處理肉雞肝組織膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA表達水平如圖2所示。結(jié)果表明，與空白對照組相比，模型對照組SCAPmRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，但與模型對照組相比，中劑量組SCAPmRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。同時，與模型對照組相比，中劑量組也均顯著提高了HMGCR和SREBP2 mRNA相對表達量(P<0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)* indicates the difference is significant (P<0.05)圖2 飲水中添加苦參蒼術(shù)顆粒對肉雞肝組織膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響(n=8)Fig.2 Effect of supplemented kushen-cangzhu granules in drinking water on relative mRNA expression of cholesterol metabolism-related genes in liver of broilers (n=8)

3 討 論

禽致病性大腸桿菌是一種常見致病菌，可影響肉雞生產(chǎn)性能。在動物試驗中，畜禽器官發(fā)育情況可作為評價機體能否正常發(fā)揮生理功能的指標(biāo)之一，器官指數(shù)在某種程度上反映了動物機體發(fā)育情況[18]。研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)顯著降低肝損傷小鼠體重的同時增加肝重[19]。本試驗結(jié)果也證實了這一點，致病性大腸桿菌可顯著降低肉雞體重，同時顯著升高肝臟指數(shù)。提示大腸桿菌感染會對肉雞肝組織產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)，飲水中添加苦參蒼術(shù)口服液后對由耐藥性大腸桿菌引起的雞生長發(fā)育受阻具有一定程度的改善作用[16]，這與本試驗飲水中添加苦參蒼術(shù)顆?？娠@著升高肉雞體重，降低肝臟指數(shù)，進而促進肉雞生長結(jié)果一致。表明苦參蒼術(shù)顆?？稍谝欢ǔ潭壬细深A(yù)大腸桿菌對肉雞肝組織造成的不良影響。

細菌和病毒感染是肉雞肝組織發(fā)生炎癥反應(yīng)的主要誘因[20]。LPS作為革蘭陰性菌(大腸桿菌)細胞壁的結(jié)構(gòu)組分，是其產(chǎn)生毒性作用的主要因素[21]。LPS刺激促進肝巨噬細胞中促炎細胞因子的釋放，從而導(dǎo)致肝損傷[22]，促進肝損傷同時會增加氧化應(yīng)激，促進脂質(zhì)蓄積和糖原耗竭[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，LPS導(dǎo)致肝小葉結(jié)構(gòu)模糊不清，肝細胞排列紊亂，中央靜脈和交界處附近有大量炎性細胞浸潤，空泡化和壞死，表現(xiàn)出明顯的肝損傷特征[24-26]，而在本試驗中也發(fā)現(xiàn)模型對照組的肝中有一定量的炎性細胞浸潤，但還未達到損傷程度。以往研究表明，苦參可通過抗炎、抗氧化等對肝起到一定的保護作用[27]，蒼術(shù)可通過降低血清中轉(zhuǎn)氨酶的水平而對肝起到一定的保護作用[28]。在本試驗中同樣發(fā)現(xiàn)，飲水中添加苦參蒼術(shù)顆粒后緩解了由大腸桿菌導(dǎo)致的肝組織形態(tài)學(xué)變化。以上結(jié)果表明，苦參蒼術(shù)顆?？删徑獯竽c桿菌導(dǎo)致的肉雞肝組織炎性細胞浸潤。

肝在調(diào)節(jié)機體代謝穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)機體免疫方面發(fā)揮重要作用，其作為一種重要的代謝器官，主要負責(zé)葡萄糖、脂質(zhì)和膽汁酸的代謝[29]。當(dāng)肝受損時，肝功能發(fā)生異常，肝細胞膜被破壞，導(dǎo)致細胞膜通透性增加[30]，胞內(nèi)酶便會大量溢出至細胞外，參與血液循環(huán)，導(dǎo)致血清中某些酶類含量發(fā)生一定變化。研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠機體注射LPS后會導(dǎo)致血清中TG和TCH含量顯著增加[31]。這與本試驗結(jié)果一致，據(jù)此推斷大腸桿菌導(dǎo)致肝內(nèi)脂代謝發(fā)生異常。而飲水中添加苦參蒼術(shù)顆粒后，顯著降低了肉雞血清和肝中TG含量，從而進一步證明苦參蒼術(shù)顆粒具有降血脂的作用[12,32]。低密度脂蛋白的功能主要是將肝組織中的膽固醇運輸至肝外，而高密度脂蛋白主要將外周組織中的膽固醇帶回肝進行代謝，從而使膽固醇水平處于平衡狀態(tài)。高、低密度脂蛋白膽固醇含量可以間接反映高、低密度脂蛋白的水平。研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加黃酮類化合物(黃芩素)，42日齡肉雞血清中LDL-C及LDL-C/HDL-C顯著降低[33]，而本研究卻發(fā)現(xiàn)，飲水中添加苦參蒼術(shù)顆粒后肉雞血清中LDL-C/HDL-C沒有顯著影響，但肝組織HDL-C、LDL-C及LDL-C/HDL-C顯著增加，這種差異可能是由于藥物種類、肉雞日齡及品種不同而致。提示苦參蒼術(shù)顆粒具有降低肝組織膽固醇水平的趨勢，對抑制肉雞脂肪肝的發(fā)生發(fā)揮著積極的作用。

為明確大腸桿菌引起肉雞肝組織膽固醇代謝異常的確切機制，本研究進一步檢測了膽固醇合成相關(guān)基因的mRNA相對表達量。以往研究發(fā)現(xiàn)，LPS處理巨噬細胞可通過上調(diào)SCAP和SREBP2的表達來激活HMGCR的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)膽固醇積累[34]，同時在HepG2和Huh7細胞中也顯著上調(diào)了HMGCR和SREBP2的表達[35]。相反，在SH-SY5Y細胞中，LPS處理抑制了HMGCR的表達[36]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染顯著抑制肝組織SCAPmRNA的相對表達量。而SCAP表達降低可使肝組織中膽固醇合成減少[37]，這表明LPS對膽固醇合成的影響可能存在種屬和組織之間的差異。提示可能是由于大腸桿菌感染致使內(nèi)源性膽固醇合成不足，造成肉雞肝組織發(fā)生一定的炎性細胞浸潤。膽固醇是細胞膜的重要組成部分，添加苦參蒼術(shù)顆粒后，SCAP、SREBP2和HMGCRmRNA相對表達量顯著增加，促進了肝中膽固醇合成增加，一方面有利于緩解大腸桿菌所致細胞膜的通透性增加[38]，保持細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。另一方面苦參蒼術(shù)顆粒促進肝中膽固醇合成增加的同時上調(diào)HDL-C和LDL-C的表達，促使機體內(nèi)的膽固醇水平處于更加平衡的狀態(tài)。以上這些結(jié)果表明，苦參蒼術(shù)顆粒在由大腸桿菌導(dǎo)致膽固醇合成異常方面具有一定的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，苦參蒼術(shù)顆?？山档脱褐?TG 含量，改善肉雞體重；通過增加肝組織中HDL和LDL水平，促進肝中膽固醇轉(zhuǎn)運、合成、分解來調(diào)控肝組織膽固醇水平，從而緩解大腸桿菌所致的肉雞肝組織膽固醇合成異常。