江南松，吉 星，王亞新，孫城濤，汪 洋，陳紅梅，程龍飛，黃 瑜，吳聰明*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建省禽病防治重點實驗室，福州 350013)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)是重要的條件致病菌，通過獲得SCCmec元件成為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)，已對人類和動物健康造成了嚴(yán)重影響，并引起了世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注[1]。家畜是MRSA的重要貯庫[2]，其中，豬是家畜相關(guān)MRSA(livestock-associated MRSA, LA-MRSA)的主要宿主，歐美和中國的豬源MRSA優(yōu)勢克隆分別為ST398型[3]和ST9型[4]，兩者均通過獲得大量耐藥基因而表現(xiàn)出了不同特征的廣泛耐藥。噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)是介導(dǎo)SA耐藥性傳播的重要機制之一[5]。大部分SA菌株攜帶有穩(wěn)定整合在染色體中的前噬菌體序列[6]，但各克隆譜系中前噬菌體的流行情況不盡相同[7-8]，不同克隆的適應(yīng)性進(jìn)化和流行也可能與之相關(guān)。

CC5型SA中Sa7int前噬菌體攜帶率較高[7-8]，ST398型LA-MRSA中不攜帶Sa3int和Sa4int前噬菌體，但Sa2int較為流行[9]。Sa3int前噬菌體是ST398型LA-MRSA得以在人類定殖傳播的關(guān)鍵因素[10]，其定殖于動物后丟失Sa3int前噬菌體并獲得甲氧西林和四環(huán)素耐藥性[11]，前噬菌體影響了ST398型MRSA在人或動物定殖的適應(yīng)性[12]。研究表明，SA中許多耐藥基因和移動元件可通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行水平傳播[13]。噬菌體φ80α和噬菌體φ29可介導(dǎo)I型和IV型SCCmec元件在MRSA USA300種群中傳播[14]。噬菌體φ54可包裝ST398型MRSA中的SCCmec元件[15]。此外，Sa2int、Sa3int、Sa5int、Sa7int型噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)事件已有報道，其中，Sa2int型噬菌體φ11和φ80α已被廣泛應(yīng)用于SA研究[16]。前期研究表明，ST9型MRSA株間的基因組差異主要在于前噬菌體序列，且不包含Sa3int型噬菌體所攜帶的人類定殖相關(guān)的毒力因子[17]。然而，我國豬源ST9型MRSA中前噬菌體的流行情況，以及耐藥基因可否通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行水平傳播的研究仍未見報道。

因此，本研究基于已保存的我國豬源ST9型MRSA菌株及其全基因組數(shù)據(jù)，對前噬菌體的分布特征及序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析；對前噬菌體進(jìn)行誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗，測定轉(zhuǎn)導(dǎo)子體外適應(yīng)性代價。本研究旨在闡明豬源ST9型MRSA中前噬菌體的流行情況，探究其介導(dǎo)耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的可能性，分析前噬菌體對我國豬源MRSA耐藥性發(fā)展和流行克隆形成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株和序列

菌株來源于2010—2016年在我國11省分離保存并已全基因組測序的119株豬源ST9型MRSA[17-18]，所有全基因組序列均已上傳NCBI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov),并發(fā)布于基因組登錄編號PRJNA487590、PRJNA433075。此外，本研究增加了NCBI數(shù)據(jù)庫中12株已發(fā)布的ST9型MRSA全基因組數(shù)據(jù)用以生物信息比較分析(表1)；在親緣關(guān)系分析中，加入了NCBI中4株不同分型的MRSA噬菌體序列(表1)。

表1 16個菌株及噬菌體基因組數(shù)據(jù)登錄編號Table 1 The accession No. of 16 strain and phage genomes

1.2 主要試劑耗材

TSA、LA、LB培養(yǎng)基購自北京陸橋生物科技有限公司，蛋白酶K、溶菌酶、溶葡萄球菌素、DNase I、RNase A、SM buffer均購自生工生物工程(上海)有限公司，檸檬酸三鈉、二水合氯化鈣、氯仿均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，聚乙二醇、絲裂霉素C購自索萊寶(北京)生物科技有限公司，病毒基因組DNA快速提取試劑盒(R4173)購自廣州美基生物科技有限公司，細(xì)菌基因組DNA/RNA快速提取試劑盒(DP302)購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 前噬菌序列分析

1.3.1 序列預(yù)測和分型 分別使用PHASTER[19]和Prophage Hunter[20]對以上MRSA菌株基因組序列進(jìn)行前噬菌體區(qū)域預(yù)測。分別以PHASTER score大于120與Prophage Hunter score大于0.9為參考，對照序列中aatL和aatR位點、溶原性模塊、復(fù)制模塊、轉(zhuǎn)錄控制模塊、頭尾模塊的位置來確定完整前噬菌體區(qū)域。根據(jù)SA噬菌體分型方法[7]，使用Blastn[21]對完整前噬菌體序列進(jìn)行比對分型。

1.3.2 基因篩查和親緣關(guān)系分析 使用Blastn對完整前噬菌體序列與數(shù)據(jù)庫Resfinder[22]和VFDB[23]分別進(jìn)行耐藥基因和毒力基因篩查。使用Easyfig v2.2.2[24]比較不同分型前噬菌體結(jié)構(gòu)。使用MAFFT[25]將提取的前噬菌體序列對齊并建立矩陣，使用Fasttree[26]進(jìn)行親緣關(guān)系分析，使用iTOL[27]進(jìn)行g(shù)gtree[28]，對進(jìn)化樹進(jìn)行可視化。

1.4 前噬菌體誘導(dǎo)

1.4.1 誘導(dǎo)和濃縮 參照轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗方法[29]，在誘導(dǎo)株的新鮮培養(yǎng)物(OD600 nm= 0.3～0.5)中加入絲裂霉素C至終濃度為1 μg·mL-1，同時設(shè)立無絲裂霉素的空白對照組，置于37 ℃以轉(zhuǎn)速120 r·min-1下避光培養(yǎng)6～8 h。待菌液明顯澄清后，加入氯仿[V(氯仿)∶V(菌液)=1∶10]，震蕩混勻15 min。在4 ℃條件下以10 000 r·min-1離心混合液10 min，小心吸出上清液。上清液通過0.22 μm孔徑濾器進(jìn)行滅菌，得到噬菌體懸浮液，置于4 ℃冰箱中備用。

在噬菌體懸浮液中加入適量DNase I(100 U·mL-1)和RNase A(1 mg·mL-1)，并在37 ℃孵育30 min，加入PEG8000[V(噬菌體)∶V(PEG8000)=4∶1]混勻，并于4 ℃靜置過夜后，于16 000 r·min-1離心10 min,獲得噬菌體顆粒沉淀，加1 mL SM buffer重懸混勻。重懸液中加入1/10體積氯仿抽提，并于3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，獲得濃縮后的噬菌體懸浮液。

1.4.2 宿主測定和分離純化 參照轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗方法[29]，使用雙層平板法對噬菌體的宿主范圍進(jìn)行測定。于恒溫56 ℃下，將1 mL指示菌株的新鮮培養(yǎng)物(OD600 nm= 0.3～0.5)與4 mL的0.7%LB瓊脂混勻，均勻傾倒在已制備好的單層TSA(或LB)瓊脂平板上，制備成雙層平板。將5～8 μL噬菌體液滴加于雙層平板上，隨后置于37 ℃條件下,靜置培養(yǎng)24 h。

若雙層平板上存在透明噬菌斑，則受試菌株對該噬菌體敏感。從上層瓊脂切下噬菌斑，重懸于1 mL SM Buffer中，于4 ℃靜置過夜。用10倍體積的對數(shù)生長期宿主菌株接種噬菌體液，于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜，經(jīng)少量氯仿抽提和低速離心，取上清液，獲得噬菌體懸浮液。重復(fù)以上步驟直至噬菌斑大小、形狀無明顯差異為止。選擇噬菌斑數(shù)量50～100個的平板進(jìn)行計數(shù)，按該平板對應(yīng)噬菌體稀釋比例計算噬菌體液的滴度(PFU·mL-1)。

1.4.3 形態(tài)觀察 將鍍碳支持膜銅網(wǎng)放在封口膜上，吸取1滴純化后的噬菌體液滴于銅網(wǎng)上，室溫靜置2～5 min。用帶尖的濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余噬菌體液，干燥1 min。滴加1滴2%磷鎢酸溶液(pH7.2)，染色1 min。用濾紙吸去多余染液，室溫靜置30 min后,置于透射電鏡下觀察。

1.5 轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗

1.5.1 噬菌體、供體菌和受體菌選擇 如表2所示，選擇宿主范圍較廣的4株噬菌體作為轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗噬菌體；根據(jù)噬菌體的共有宿主，選擇MRSA菌株LN-DL44-2和BJ-PNB40作為供體菌；因工程菌株RN4220具有對大部分抗生素的敏感性、不包含質(zhì)粒、對噬菌體的易感性，所以選擇其作為受體菌株。

表2 轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗中的噬菌體、供體菌和受體菌Table 2 Phages, donors and recipient in transduction experiment

1.5.2 轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒獲得和富集 參照轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗方法[29]，將0.5 mL供體菌過夜培養(yǎng)物稀釋至5 mL含0.01 mol·L-1CaCl2的LB培養(yǎng)基中，孵育至OD600nm為0.2～0.4，加入50 μL噬菌體液(加入體積可根據(jù)噬菌體滴度適當(dāng)調(diào)整，使感染復(fù)數(shù)MOI值為0.1～1)，繼續(xù)在37 ℃下孵育至混合液清晰透明。加入200 μL氯仿混勻抽提并16 000 r·min-1離心10 min，取上清液，獲得噬菌體懸浮液。按照“1.4.2”所述測定滴度，并重復(fù)以上步驟獲得109PFU·mL-1左右的噬菌體液，用0.22 μm濾器過濾并保存。

1.5.3 轉(zhuǎn)導(dǎo) 參照轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗方法[30]，根據(jù)供體菌株耐藥表型和基因型，制作含0.01 mol·L-1CaCl2的LB單一抗性平板，抗菌藥物種類及用量見表3。將受體菌株的過夜培養(yǎng)物稀釋于10 mL含0.01 mol·L-1CaCl2的LB肉湯中[V(菌液)∶V(肉湯)=1∶10]，置于37 ℃，以轉(zhuǎn)速180 r·min-1條件下培養(yǎng)4 h，使菌液OD600為0.8～1，以獲得高濃度且生長狀態(tài)良好的受體菌。受體菌于離心機中以1 500g離心5 min，棄上清液。加入2 mL含0.01 mol·L-1CaCl2的LB肉湯重懸沉淀。

表3 抗性平板藥物濃度Table 3 Concentration of antibacterial agents in resistance medium mg·L-1

重懸的受體菌液分為試驗組和空白對照組，分別加入500 μL轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體液和肉湯，置于37 ℃以轉(zhuǎn)速200 r·min-1條件下，培養(yǎng)30 min，進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。隨后，加入適量的預(yù)冷檸檬酸鈉溶液終止轉(zhuǎn)導(dǎo)，混合液中檸檬酸鈉終濃度為0.02 mol·L-1，溶液pH5.5。將混合物在4 ℃ 1 000g離心15 min。加入300 μL含0.02 mol·L-1檸檬酸鈉的預(yù)冷LB肉湯重懸沉淀，將重懸菌液均勻涂布于LA抗性瓊脂平板(含0.02 mol·L-1檸檬酸鈉，重復(fù)3個平行，每皿100 μL菌液)，置于37 ℃靜置培養(yǎng)24～36 h。對轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)目計數(shù)，從3個獨立的重復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗計算出轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)(CFU)與噬菌斑形成單位數(shù)(PFU)，計算轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率。

挑選單個轉(zhuǎn)導(dǎo)子菌落接種于相同抗性的LA瓊脂平板(含0.02 mol·L-1檸檬酸鈉)，置于37 ℃靜置培養(yǎng)24～36 h以確認(rèn)并純化轉(zhuǎn)導(dǎo)子。

1.5.4 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體及轉(zhuǎn)導(dǎo)子的基因檢測 根據(jù)DNA提取試劑盒說明，提取轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒及轉(zhuǎn)導(dǎo)子的基因組DNA。其中，優(yōu)化后的噬菌體DNA提取步驟如下：

將20 μL蛋白酶K與200 μL BB5溶液混勻15 s，隨后加入200 μL噬菌體液混勻?；旌衔镉?6 ℃靜置15 min后，加入250 μL無水乙醇并渦旋混勻，室溫靜置15 min。將以上內(nèi)容物加入離心柱，在轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1條件下離心1 min。向離心柱中加入500 μL VHB溶液，在轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1條件下離心1 min，并重復(fù)該步驟1次。將離心柱和收集管在轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1條件下離心3 min，以去除殘留乙醇。在室溫下，將離心柱靜置15 min后，向中央濾膜上滴加50 μL dd2H2O，并靜置1 min。在轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1條件下離心1 min，洗脫獲得噬菌體DNA。

對細(xì)菌噬菌體、轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體、供體菌株、受體菌株、轉(zhuǎn)導(dǎo)子分別進(jìn)行已探明耐藥基因的檢測(表4)。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52～57 ℃ 30 s，72 ℃ 1～1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

表4 耐藥基因引物Table 4 The primers of resistant genes

1.6 轉(zhuǎn)導(dǎo)子的耐藥性及適應(yīng)性測定

1.6.1 藥敏試驗 以ATCC29213為質(zhì)控菌株，根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法測定供、受體菌及轉(zhuǎn)導(dǎo)子對應(yīng)抗生素敏感性。

1.6.2 生長曲線 取供、受體菌株及轉(zhuǎn)導(dǎo)子過夜培養(yǎng)物1 mL稀釋至100 mL的LB肉湯，置于恒溫37 ℃培養(yǎng)至菌液OD600 nm為0.5。稀釋菌液1 000倍后，于全自動酶標(biāo)儀中37 ℃培養(yǎng)24 h，每30 min測定1次OD600 nm值，并繪制生長曲線。生長曲線上每株轉(zhuǎn)導(dǎo)子的OD600 nm值、平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差值均經(jīng)單因素方差分析(one-way ANOVA analysis)和Tukey-Kramer分析進(jìn)行分組檢驗，以比較各菌株體外生長速率的顯著性差異。

1.6.3 體外競爭試驗 對供體菌株及轉(zhuǎn)導(dǎo)子共培養(yǎng)，取共培養(yǎng)物分別于LA平板和含4 μg·mL-1頭孢西丁LA平板篩選培養(yǎng)，并進(jìn)行菌落計數(shù)。參考Nielsen等[37]的計算公式計算適應(yīng)性差異。

2 結(jié) 果

2.1 前噬菌體的流行特征

2.1.1 前噬菌體的流行情況 序列分析結(jié)果表明，豬源ST9型MRSA的前噬菌體攜帶率為78.6%(103/131株)，其中，63株MRSA攜帶結(jié)構(gòu)完整的前噬菌體序列，僅4株含兩條及以上完整前噬菌體序列。

根據(jù)SA噬菌體分型方法，按照不同功能模塊對完整結(jié)構(gòu)的前噬菌體序列進(jìn)行分型。結(jié)果如圖1所示，整合酶位點分型(int)中，Sa2int和Sa4int占47.7%和30.8%；抗阻遏物位點分型(ant)中，ant5占58.5%；復(fù)制位點分型(rep)中，dnaD2b占67.7%；尿嘧啶核酸酶位點分型(dut)中，dut2占86.2%；血清學(xué)位點分型(SG)中，SGA占97%；酰胺酶位點分型(ami)中，ami1和ami2占46.2%和50.8%。因此，豬源ST9型MRSA完整前噬菌體流行分型為Sa2int/Sa4int-ant5-dnaD2b-dut2-SGA-ami1/ami2，也可簡化為整合酶分型Sa2int型和Sa4int型。

不同顏色代表噬菌體分型中的各相關(guān)模塊Different colors represent relevant modules in phage typing圖1 豬源ST9型MRSA分離株前噬菌體分型Fig.1 The prophage typing of porcine MRSA ST9 isolates

通過基因比對，發(fā)現(xiàn)所有前噬菌體序列均不含SA耐藥基因，僅2.9%(3/103株)的前噬菌體序列含毒力基因。菌株GD-G39、GD-G44和SH-WF33所攜帶前噬菌體分別包含腸毒素基因簇seg-sei-sem-sen-seo-seu、血友病因子結(jié)合蛋白基因vwb、腸毒素基因seo。

2.1.2 前噬菌體的親緣關(guān)系和結(jié)構(gòu)特征 本研究對所有完整前噬菌體序列進(jìn)行了親緣關(guān)系分析。如圖2所示，前噬菌體序列被分為兩個親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的進(jìn)化枝，Clade-A和Clade-B間的平均核苷酸差異為21.5%。兩個分支的組間、組內(nèi)的前噬菌體分型、基因組長度和基因數(shù)量無明顯相關(guān)。但來源于ST22型SA的前噬菌體φtp310-2、來源于ST80型SA的前噬菌體φ7410PVL與來源于ST398型SA的φstauST398-2均聚集于Clade-A，且同源性較高。

左側(cè)標(biāo)簽分別代表噬菌體的整合酶位點分型、抗阻遏物位點分型、復(fù)制位點分型、尿嘧啶核酸酶位點分型、酰胺酶位點分型、血清學(xué)位點分型；右側(cè)柱狀圖分別代表噬菌體的大小(藍(lán))和基因數(shù)量(綠)；紅色虛線和綠色虛線分別表示Clade-A和Clade-B株；灰色陰影區(qū)域代表除Sa2int和Sa4int前噬菌體外其他分型噬菌體The left labels represent the integrase type, antirepressor type, replication module type, dUTPase type, amidase type and serological type of bacteriophage respectively; The right histogram represents the phage size (blue) and gene number (green) respectively; The red dotted line and the green dotted line indicate Clade-A and Clade-B strains respectively; The gray shaded area represents other phenotypic phages except for Sa2int and Sa4int prophages圖2 豬源ST9型MRSA分離株完整前噬菌體親緣關(guān)系Fig.2 The phylogeny of intact prophages in porcine MRSA ST9 isolates

為探究ST9型MRSA前噬菌體的結(jié)構(gòu)特征，對不同int分型前噬菌體進(jìn)行了結(jié)構(gòu)比較。如圖3所示，與噬菌體φStauST398-2(Sa2int)相比，φGD-G44(Sa1int)、φQD-CD9(Sa4int)和φGD-G51(Sa5int)分別具有52%、65%和60%的相似度，φNX-T44(Sa2int)、φSD-YI040(Sa6int)、φLN-DL44-2(Sa7int)及φBA01611-1(Sa9int)具有較高同源性。所有前噬菌體均享有一段保守的核心功能區(qū)域：包裝模塊、形態(tài)模塊和裂解模塊，據(jù)此推測噬菌體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中存在非保守區(qū)域的基因交換。

各色箭頭代表編碼不同噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白的基因；陰影部分代表不同噬菌體之間的序列相似度The colored arrows represent the genes encoding different phage structural proteins; The shaded parts represent the sequence similarity among different bacteriophages圖3 各整合酶分型前噬菌體基因結(jié)構(gòu)比較Fig.3 Genomic structure comparison among prophages with each integrase typing

2.2 前噬菌體的誘導(dǎo)結(jié)果

對挑選的60株含完整前噬菌體的菌株進(jìn)行誘導(dǎo)試驗，結(jié)果表明，58株可被成功誘導(dǎo)為噬菌體，其中Sa2int型21株，Sa4int型噬菌體22株，其余分型的15株。所有噬菌體均在雙層平板上呈現(xiàn)出直徑約1 mm大小相似、形狀規(guī)則的噬菌斑。以所有保存菌株作為測試菌株，進(jìn)行噬菌體宿主范圍測定。結(jié)果表明，所有噬菌體株宿主范圍差異較大。挑選其中4株宿主范圍較廣的噬菌體株φQD-J1、φSD-PW88、φGD-G14、φGD-G51進(jìn)行形態(tài)觀察及轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗。

電鏡結(jié)果(圖4)顯示，4株噬菌體均具六邊形外廓頭部，長度為75～100 nm；尾部較長，為200～300 nm。頭尾軸向兩端及尾部被磷鎢酸深著色，富含雙鏈DNA。根據(jù)SA噬菌體分類標(biāo)準(zhǔn)及國際病毒分類方法[38]，這4株噬菌體可被歸類于有尾噬菌體目(Caudovirales)長尾噬菌體科(Siphoviridae)。

圖A～D分別代表φQD-J1、φSD-PW88、φGD-G14、φGD-G51電鏡下形態(tài)Figures A to D represent φQD-J1, φSD-PW88, φGD-G14, φGD-G51 morphology under electron microscope圖4 透射電鏡下的各噬菌體形態(tài)Fig.4 Morphology of each phage isolate under transmission electron micrograph

2.3 噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力

轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗結(jié)果表明，在MOI為0.5～1.0時，4株噬菌體均可獲得供體菌LN-DL44-2中基因aadD、tet(L)和ccrC2，其中耐藥基因aadD和tet(L)可被成功轉(zhuǎn)導(dǎo)至受體菌株RN4220(圖5)。aadD和tet(L)分別介導(dǎo)RN4220對卡那霉素和四環(huán)素的耐藥性。然而，以菌株BJ-PNB40為供體獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體則不攜帶任何耐藥基因及功能基因。4組噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率較低，但Sa4int型噬菌體φQD-J1和φSD-PW88的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率較其他噬菌體略高(表5)。

表5 轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗結(jié)果Table 5 The results of transduction experiment

圖A～C分別代表各轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒中攜帶aadD、tet(L)和ccrC2的基因檢測結(jié)果，圖D～E分別代表各轉(zhuǎn)導(dǎo)子中攜帶aadD和tet(L)的基因檢測結(jié)果Figures A to C respectively represent the detection results of genes carrying aadD, tet (L) and ccrC2 in each transducing phage particle, and Figures D to E respectively represent the detection results of genes carrying aadD and tet(L) in each transductant圖5 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒和轉(zhuǎn)導(dǎo)子中耐藥基因檢測結(jié)果Fig.5 The results of resistance genes detection in transducing phage particles and transductants

2.4 轉(zhuǎn)導(dǎo)子的耐藥性及適應(yīng)性

2.4.1 轉(zhuǎn)導(dǎo)子的耐藥性 藥敏試驗可知，相比于RN4220，4株噬菌體對應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)子tJ1、tPW88、tG14、tG51對卡那霉素MIC提高128倍～256倍，對四環(huán)素MIC提高32倍～64倍。

2.4.2 轉(zhuǎn)導(dǎo)子的體外生長曲線 生長曲線如圖6所示。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，4株轉(zhuǎn)導(dǎo)子的體外生長速率分別與RN4220并無顯著差異(P>0.05),但所有轉(zhuǎn)導(dǎo)子以及RN4220的生長速率均明顯高于供體菌LN-DL44-2。

圖6 供體、受體菌株以及轉(zhuǎn)導(dǎo)子的體外生長曲線Fig.6 In vitro growth curves of donor, recipient strains and transductants

2.4.3 轉(zhuǎn)導(dǎo)子的適應(yīng)性代價 體外競爭性試驗結(jié)果如表6所示，RN4220與各轉(zhuǎn)導(dǎo)子相比均顯示出了較小的競爭性優(yōu)勢，各轉(zhuǎn)導(dǎo)子的適應(yīng)性代價(C)均在2%以內(nèi)。

表6 轉(zhuǎn)導(dǎo)子的適應(yīng)性代價Table 6 The fitness cost of transductants %

3 討 論

本研究基于細(xì)菌全基因組序列，對豬源ST9型MRSA中前噬菌體進(jìn)行了預(yù)測，對完整前噬菌體序列進(jìn)行分型。在豬源ST9型MRSA的基因組中，前噬菌體的攜帶率達(dá)78.6%，符合SA菌株中前噬菌體的流行情況[7]。63株ST9型MRSA攜帶完整前噬菌體，由于超感染外排機制[39]，其中，大部分菌株僅含1條完整前噬菌體序列。噬菌體的分型方法中，最保守的是整合酶基因(int)類型，與形態(tài)模塊對應(yīng)的血清學(xué)類型(SG)和酰胺酶類型(ami)。因此，我國豬源ST9型MRSA前噬菌體分型也可描述為Sa2int/Sa4int-SGA-ami1/ami2。本研究中， Sa2int和Sa4int型前噬菌體在ST9型MRSA基因組中為優(yōu)勢譜型，且所有菌株均不攜帶Sa3int前噬菌體。該流行情況與LA-MRSA ST398相似[9]，同樣缺失Sa3int前噬菌體。Sa2int前噬菌體通常攜帶編碼殺白細(xì)胞介素的基因luk[7-8]，但豬源ST9型MRSA 中Sa2int前噬菌體卻完全缺失luk。因此，Sa3int前噬菌體的丟失、前噬菌體中毒力基因的缺失可能對豬源ST9型MRSA在我國流行產(chǎn)生了一定程度的影響。我國豬源ST9型MRSA前噬菌體呈現(xiàn)出分型的多樣性和較大的基因差異。噬菌體進(jìn)化理論[40]指出，前噬菌體通過功能基因(模塊)間交換而進(jìn)化。SA前噬菌體具有3個特征導(dǎo)致其個體間差異：首先，SA噬菌體基因組中存在的鑲嵌現(xiàn)象，使基因片段在模塊間和模塊內(nèi)更加動態(tài)；第二，在各模塊功能的基因之間插入了外源ORF；第三，噬菌體個體的特定基因、模塊缺失，例如缺少ant基因。

噬菌體宿主范圍和形態(tài)學(xué)鑒定是進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗的必要前置步驟。本研究中各噬菌體宿主范圍無明顯規(guī)律。迄今，關(guān)于不同型別SA噬菌體宿主范圍的相關(guān)研究未見報道。宿主范圍的差異可能是因為SA噬菌體對宿主的裂解和轉(zhuǎn)導(dǎo)被限制在親緣關(guān)系相近的菌株間發(fā)生[41]。菌株對溫和噬菌體不敏感的常見原因是超感染外排機制[39]，SA在已有噬菌體整合至基因組中的情況下，對外源噬菌體保持一定的抵抗作用[41]，超感染外排機制，可能是本研究中轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率較低的原因。因此，噬菌體的宿主范圍可能決定了其轉(zhuǎn)導(dǎo)的成功與否。本研究中，鑒定了4株SA噬菌體。迄今為止，所有已知的SA噬菌體均屬于有尾噬菌體目(Caudovirales)長尾噬菌體科(Siphoviridae)。本研究中的4株噬菌體均為血清學(xué)SGA型。研究已證明了SGA型噬菌體具有轉(zhuǎn)導(dǎo)能力[42]，并且也有SGA噬菌體成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的報道[43]。此外，細(xì)胞壁WTA表面受體是噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑之一[44]。但由于宿主范圍限制及RN4220更易接受外源DNA的特性，本研究中僅使用WTA蛋白缺陷的RN4220作為受體，這可能同樣導(dǎo)致本研究中轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率較低。

轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗表明，氨基糖苷類耐藥基因aadD和四環(huán)素類耐藥基因tet(L)被噬菌體包裝并轉(zhuǎn)導(dǎo)至受體菌內(nèi)。MIC結(jié)果與供體菌有所差異，可能是由于轉(zhuǎn)導(dǎo)子中耐藥基因側(cè)翼序列的差異性而導(dǎo)致表達(dá)量的變化。噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是aadD和tet(L)在ST9菌株中廣泛分布的原因之一。SA中噬菌體可轉(zhuǎn)導(dǎo)位于染色體序列上的基因，也同樣可轉(zhuǎn)導(dǎo)小型質(zhì)粒[45]。本研究中噬菌體是包裝含有耐藥基因質(zhì)?；蛘呤侨旧w上耐藥基因而發(fā)生了轉(zhuǎn)導(dǎo)，該過程不得而知，仍需后續(xù)深入研究。在轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒中檢測到SCCmec-XII元件中的ccrC2基因，這表明噬菌體可能參與了SCCmec-XII的菌株間水平轉(zhuǎn)移，可為ST9型MRSA中SCCmec-XII元件的廣泛分布提供了一種合理的可能性。而噬菌體未包裝SCCmec-XII的其它組分的原因尚不清楚。其原因可能是因為：1)SCCmec-XII的att序列不同于噬菌體中的att序列而無法同源重組；2)噬菌體中att序列被SCCmec-XII中的部分基團，例如ccrC2，所占據(jù)而阻止其它部分的包裝；3)整合的過程屬于同源重組并且需要特定活性重組酶，該種重組酶可能在供體菌株中不存在；4)SCCmec- XII序列相對較大，完整包裝進(jìn)噬菌體的難度較高。SA前噬菌體的基因組大小為30～50 kb[46],而SCCmec-XII長度約為60 kb。研究表明，完整SCCmec元件的轉(zhuǎn)導(dǎo)事件中，其SCCmec長度均<40 kb[14]。因此，噬菌體可能分別包裝SCCmec元件中的部分基因而轉(zhuǎn)導(dǎo)。

由生長曲線和競爭性試驗結(jié)果顯示，相比于受體菌，轉(zhuǎn)導(dǎo)子幾乎不產(chǎn)生適應(yīng)性代價。與供體菌相比，在無抗條件下轉(zhuǎn)導(dǎo)子仍保持著競爭性優(yōu)勢。細(xì)菌獲得耐藥性可引起某些生物學(xué)方面的損害，表現(xiàn)為生長速率降低[47]。而細(xì)菌往往對基因組改變導(dǎo)致的適應(yīng)性降低會產(chǎn)生對應(yīng)補償機制。噬菌體整合對于ST9菌株成為優(yōu)勢克隆的對應(yīng)機制仍未有深入研究。

4 結(jié) 論

我國豬源ST9型MRSA中前噬菌體流行率較高，均不攜帶耐藥基因，少數(shù)攜帶毒力基因，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上分為兩個分支，主要分型為Sa2int和Sa4int型。ST9型MRSA的前噬菌體可被誘導(dǎo)為長尾噬菌體，可包裝ccrC2基因至轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒，可包裝且轉(zhuǎn)導(dǎo)耐藥基因aadD和tet(L)至受體菌，各型噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率無明顯差異。轉(zhuǎn)導(dǎo)子獲得卡那霉素和四環(huán)素耐藥性且?guī)缀醪划a(chǎn)生適應(yīng)性代價。