張凱川，王晉宇，李守軍，賈 坤*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642；2.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣州 510642；3.廣東省寵物工程技術研究中心，廣州 510642)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)是腸桿菌科克雷伯菌屬的一種常見的條件性致病菌[1-2]，存在于人和動物的腸道和呼吸道，可引起肺炎、支氣管炎、泌尿道系統(tǒng)和創(chuàng)傷的感染，甚至腦膜炎、腹膜炎和敗血癥等[3]。近年來，肺炎克雷伯菌引起的動物群體性細菌性感染的疾病不斷增多[4-6]。此外，由于抗菌藥物的廣泛使用，導致該菌對多種抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性，從而使該菌所致疾病的預防和治療難度增大，因而其發(fā)病率和死亡率均明顯升高[7]，給養(yǎng)殖業(yè)造成的損失亦日趨嚴重。

羊感染肺炎克雷伯菌主要引起肺炎以及上呼吸道感染等，有些病羊表現(xiàn)為流鼻涕、咳嗽和呼吸急促等癥狀[8]。由于肺炎克雷伯菌病死率較高，會造成一定的經(jīng)濟損失，因此對它的關注日漸增加，羊感染肺炎克雷伯菌的報道也越來越多。本試驗從廣東省各個羊場采集了150份有呼吸道疾病羊的樣品，利用PCR方法分離鑒定出肺炎克雷伯菌，并對其進行了毒力、耐藥基因和ERIC-PCR基因分析，為羊源肺炎克雷伯菌的更深入研究奠定了理論基礎，同時為廣東羊場的臨床用藥提供了參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集

采集廣東省3個不同市羊場的150份患呼吸道疾病病羊鼻拭子樣品，進行細菌分離培養(yǎng)。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基均購自青島海博試劑有限公司，DL2000 Marker、ExTaqDNA聚合酶均購自TaKaRa公司；革蘭氏染色試劑、藥敏紙片均購自杭州濱和微生物試劑有限公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；DL2000 DNA Marker、100 bp DNA Ladder(Dye Plus)、Premix Taq (Ex Taq version 2.0 plus dye) 等購自寶生物(大連)工程有限公司。

1.3 細菌分離培養(yǎng)

將采集的150份鼻拭子樣品分別接種于LB瓊脂平板上，37 ℃需氧培養(yǎng)24 h后進行純化培養(yǎng)，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)。

1.4 染色鏡檢

挑取純化后的單菌落，按常規(guī)方法進行革蘭染色，觀察菌體形態(tài)。

1.5 PCR鑒定肺炎克雷伯菌

根據(jù)細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌DNA。肺炎克雷伯菌特異性(khe溶血酵素基因[9])引物序列如下：5′-ATGAAACGACCTGATTGCATTCGC-3′；5′-TTACTTTTTCCGCGGCTTACCGTC-3′，預期擴增片段長度496 bp。擴增體系(25 μL)：2×Taq Mix Buffer 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min， 55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳時間為45 min，電壓90V，電泳結束采用凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.6 藥敏試驗

依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)手冊對包括頭孢菌素類、大環(huán)內酯類等在內的21種常用抗菌藥物進行藥敏試驗[10]，測定分離菌對抗菌藥物的抑菌圈直徑，判定分離菌對抗菌藥物的敏感性。

1.7 肺炎克雷伯菌毒力基因檢測

參照文獻[11,12]，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫公布的毒力基因相關序列設計相關引物(表1)。分別擴增分離菌的相關毒力基因。反應體系為25 μL：上、下游引物各1 μL，基因組DNA 2 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，Tm(50～58 ℃)45 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)后；72 ℃延伸10 min。

表1 肺炎克雷伯菌毒力基因引物序列Table 1 Virulence gene sequence of Klebsiella pneumoniae

1.8 肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測

參照文獻[13,14]，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫公布的耐藥基因相關序列設計相關引物(表2),以提取的細菌基因組DNA為模板，進行耐藥基因PCR擴增。反應體系為20 μL：2×Taq PCR StarMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板2 μL，剩余用ddH2O補齊。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，相應Tm30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。

表2 肺炎克雷伯菌耐藥基因序列Table 2 Klebsiella pneumoniae resistance gene sequence

1.9 肺炎克雷伯菌ERIC-PCR分型

1.9.1 引物設計 參照文獻[15]，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫公布的ERIC-PCR相關序列設計相關引物，引物序列如下：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，引物由天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.9.2 ERIC-PCR擴增 以提取細菌基因組DNA為模板，進行ERIC-PCR擴增，采用20 μL反應體系：2×TaqPCR StarMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。

PCR反應程序為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min;4 ℃保存，PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.9.3 ERIC-PCR聚類圖譜分析 ERIC-PCR電泳圖譜首先采用 Quantity One(Bio-Rad，USA)軟件進行擴增條帶分析，識別結果記錄方法：針對某一條帶，軟件自動識別后“有”記作“1”，“無”記作“0”，并輔助相應的人工校對；再采用NTSYSpc 2.1軟件計算得到遺傳相似性系數(shù)矩陣和遺傳距離矩陣，隨后利用遺傳距離矩陣采用非加權配對算術平均法對分離株進行遺傳聚類分析；最后根據(jù)聚類結果進行系統(tǒng)進化樹的構建，比較不同來源菌株間的親緣關系。

2 結 果

2.1 肺炎克雷伯菌分離鑒定

本試驗通過革蘭染色及PCR鑒定的方法，在150份樣品中共分離出42株肺炎克雷伯菌，總分離率為28%(42/150)，該菌在LB固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)白色不透明型菌落，其邊緣光滑，中央略微突起(圖1)。

圖1 肺炎克雷伯菌在LB固體平板上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of Klebsiella pneumoniae on LB plate

革蘭染色鏡檢結果如圖2A顯示，該菌呈現(xiàn)紅色，形態(tài)表現(xiàn)為較短粗的桿菌，單獨、成雙或短鏈狀排列，無芽孢和鞭毛。PCR結果顯示(圖2B)，擴增條帶大小為496 bp，分離得到細菌均攜帶溶血酵素基因khe，鑒定為肺炎克雷伯菌。

A.革蘭染色結果(1 000×)；B. 部分菌株PCR鑒定(M. DL2000 DNA相對分子質量標準；1～12. 肺炎克雷伯菌分離菌kp1、kp7、kp13、kp15、kp194-7、kp17-13、kp131、kp268、kp2、kp11、kp6、kp9；N. 陰性對照)A. Gram-negative staining results (1 000×); B. PCR identification results of some isolates (M. DL2000 DNA marker; 1-12. Klebsiella pneumonia: kp1, kp7, kp13, kp15, kp194-7, kp17-13, kp131, kp268, kp2, kp11, kp6, kp9; N. Negative control)圖2 肺炎克雷伯菌分離株的鑒定Fig.2 Identification results of Klebsiella pneumonia isolates

2.2 藥敏試驗

通過對42株肺炎克雷伯菌進行21種常用抗生素的藥敏試驗，結果顯示，肺炎克雷伯菌分離株對其中16種抗生素有不同程度的耐藥性，對阿莫西林、氧氟沙星、青霉素等耐藥率達100%，對恩諾沙星、阿奇霉素耐藥率達30%以上，而對頭孢吡肟、復方新諾明、氨芐西林/舒巴坦的敏感性達100%，具體詳見圖3。

1.頭孢吡肟；2.頭孢曲松；3.頭孢呋辛；4.阿莫西林；5.氨芐西林/舒巴坦；6.氯霉素；7.復方新諾明；8.慶大霉素；9.多黏菌素B；10.四環(huán)素；11.美羅培南；12.苯唑西林；13.阿米卡星；14.諾氟沙星；15.強力霉素；16.青霉素G；17.環(huán)丙沙星；18.恩諾沙星；19.阿奇霉素；20.麥迪霉素；21.氧氟沙星1. Cefepime; 2. Ceftriaxone; 3. Cefuroxime; 4. Amoxicillin; 5. Ampicillin/sulbactam; 6. Chloramphenicol; 7. Complex sulfamethoxazole; 8. Gentamycin; 9. Polymyxin B; 10. Tetracyclin; 11. Meropenem; 12. Oxacillin; 13. Amikacin; 14. Norfloxacin; 15. Doxycycline; 16. Penicillin G; 17. Ciprofloxacin; 18. Enrofloxacin; 19. Azithromycin; 20. Medemcyin; 21. Ofloxacin圖3 肺炎克雷伯菌藥敏結果Fig.3 Drug sensitivity of Klebsiella pneumoniae

2.3 毒力基因檢測

采用PCR方法對肺炎克雷伯菌12種毒力基因rmpA、aerobactin、alls、kfuBC、wcaG、iucB、iroNB、ureA、wabG、uge、fim、ybtA進行檢測，共檢測到10種毒力基因，其中，黏液表型基因rmpA、Fe3+攝取基因kfuBC與細菌尿素酶基因ureA檢出率均>80%，分別為88.0%和85.7%、83.3%，而iroNB和ybtA沒有被檢出，這表明ureA、rmpA、kfuBC毒力基因在廣東地區(qū)感染肺炎克雷伯菌中占主導地位。

2.4 耐藥基因檢測結果

采用PCR的檢測方法對42株肺炎克雷伯菌分離株進行耐藥基因檢測，結果顯示，42株肺炎克雷伯菌分離株均可檢測出多種耐藥基因，其中，氨基糖苷類耐藥基因aphA、aacC4、aacC2的檢出率分別為42.9%(18/42)、28.6%(12/42)、23.8%(10/42)，喹諾酮類耐藥基因qnrA的檢出率為40.5%(17/42)，β-內酰胺類耐藥基因SHV的檢出率為35.7%(15/42)，大環(huán)內酯類耐藥基因ermC的檢出率為16.7%(7/42)，而磺胺類以及碳青霉烯類的耐藥基因未被檢出，分離所得的肺炎克雷伯菌均含有2種及2種以上的耐藥基因。

2.5 ERIC-PCR分型結果

采用ERIC-PCR對細菌進行分型，42株肺炎克雷伯菌ERIC-PCR分型結果見圖4。結果顯示，運用ERIC-PCR法能擴增出較為清晰的ERIC圖譜，每個分離株的ERIC條帶大小均為100～4 000 bp，擴增條帶數(shù)為5～8。

M. DL5000 DNA相對分子質量標準；1～20. 肺炎克雷伯菌分離菌；N. 陰性對照M. DL5000 DNA marker; 1-20. Klebsiella pneumonia isolates; N. Negative control圖4 部分肺炎克雷伯菌ERIC-PCR電泳圖Fig.4 ERIC-PCR electrophoresis of part of Klebsiella pneumonia

運用NTSYSpc2.1軟件對上述ERIC電泳圖譜進行聚類分析，使用非加權配對平均法 (UPGMA)計算得到聚類樹狀圖(圖5)，從圖中可以看到42株肺炎克雷伯菌具有較高的相似性，根據(jù)聚類圖譜親緣遠近關系，當相似值處于80.0%以上,可認定為同一類群，結果顯示，42株肺炎克雷伯菌分離株可分為7個不同的類群(表3)，其中，遺傳多樣性優(yōu)勢群為群體Ⅰ，菌株所占比例為66.6%.

圖5 42株肺炎克雷伯菌的ERIC-PCR聚類圖Fig.5 ERIC-PCR clustering of 42 strains of Klebsiella pneumoniae

表3 42株肺炎克雷伯菌菌的ERIC-PCR聚類分析表Table 3 ERIC-PCR cluster analysis of 42 strains of Klebsiella pneumoniae

3 討 論

肺炎克雷伯菌是常見的條件致病菌，易感染人和動物，而且廣泛分布于動物的呼吸道及腸道中，發(fā)病死亡率高，給防治增加了一定的難度，感染率僅次于大腸桿菌，必須要嚴加控制[16]。在2018年，新疆曾報道1例綿羊感染肺炎克雷伯菌，同時做了部分生物學特性研究[17]。2019年，朱利霞等[18]以肺炎克雷伯菌流行病學，耐藥現(xiàn)狀等方面進行綜述。隨后，2020年對內蒙古通遼市一羊場的病死羊進行采樣，分離鑒定得出致死菌株是肺炎克雷伯菌，并且發(fā)現(xiàn)菌株出現(xiàn)耐藥情況[19]。而在廣東省有關羊源肺炎克雷伯菌的報道不是很多，本研究從廣東不同規(guī)?；难驁霾杉?50份呼吸道樣品，共分離到42株肺炎克雷伯菌分離株，具有較高分離率。王哲紅[20]從新疆地區(qū)495份牛鼻拭子樣品中分離得到60株肺炎克雷伯菌，分離率為11.95%。貢嘎等[21]從西藏地區(qū)109份牦牛呼吸道樣品中分離得到8株肺炎克雷伯菌分離株，分離率為7.76%。表明在不同省市由于南北氣候環(huán)境以及飼養(yǎng)管理模式的不同，導致肺炎克雷伯菌分離率具有較大差異。

由于抗生素的大范圍使用以及抗感染治療手法的單一，導致肺炎克雷伯菌對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，給養(yǎng)殖業(yè)造成的損失亦日趨嚴重，尤其是超廣譜β-內酰胺酶(Extended Spectrum β-lactamases，ESBLs)和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(Carbapenem resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)的出現(xiàn)增加了對肺炎克雷伯菌感染的難度，此外本次分離出的42株肺炎克雷伯菌對多種抗生素耐藥，其中，阿莫西林、苯唑西林及氧氟沙星耐藥率高達100%，相對的頭孢吡肟和氨芐西林舒巴坦類藥物的敏感性達100%，其余藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，可以采用β-內酰胺酶抑制劑克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦進行預防控制。耐藥基因檢測結果顯示，分離株對氨基糖苷類、喹諾酮類以及β-內酰胺類耐藥基因SHV的檢出率都處于較高水平，其余耐藥基因檢出率較低甚至零檢出，表明對氨基糖苷類、氟喹諾酮類以及β-內酰胺類抗生素呈現(xiàn)不同程度的耐藥，與慶大霉素、氧氟沙星以及阿莫西林的藥敏結果一致。王林峰和王選錠[22]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)SHV-1型酶的肺炎克雷伯氏菌菌株對阿莫西林耐藥，對替卡西林和哌拉西林的敏感性降低，但對頭孢菌素類抗生素敏感，本次研究結果顯示，SHV基因檢出率為35.7%，且分離株對阿莫西林耐藥，對頭孢菌素類抗生素敏感，與上述試驗結果相符。

本研究對分離到的42株肺炎克雷伯菌，檢測12種常見的毒力基因，毒力基因檢測結果顯示，rmpA基因的檢出率為88.0%，表明所分離到的肺炎克雷伯菌菌體可表達莢膜多糖，莢膜多糖是肺炎克雷伯菌最重要最基本的毒力因子之一[23]。rmpA基因存在于毒力菌株的大質粒上，負責調控細菌莢膜的合成，增強細菌毒力[24]。Sun等[25]研究表明，在導致肝膿腫的hvKP中，92.1%(35/38)為rmpA陽性。kfuBC基因的檢出率為85.7%，kfuBC基因可介導Fe3+的攝取，多存在于高毒力肺炎克雷伯菌菌株中，有研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有K1型高毒力肺炎克雷伯菌均攜帶kfuBC基因[26]。基因urea的檢出率為83.3%，基因urea與allS均可調控細菌尿素酶，allS基因可使KP在有氧和無氧條件下都能利用尿素囊而獲得碳源、氮源等能量來源[27]。不同毒力的組合使分離株產(chǎn)生不同的特性，增加了其致病性，雖然毒力基因常見于高毒力肺炎克雷伯菌菌株中，不代表該細菌會產(chǎn)生高致病力，而探究高致病力原因是未來研究高毒力肺炎克雷伯菌感染的方向。

綜上所述，肺炎克雷伯菌在廣東省羊場中存在流行，且耐藥率比較嚴重，需要在實際養(yǎng)殖過程中合理使用抗生素，建議通過藥敏試驗確定給藥種類，可以聯(lián)合應用抗生素，以減少耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，同時能夠達到最好的治療效果。

4 結 論

廣東省羊養(yǎng)殖場中肺炎克雷伯菌分離率較高，同時分離所得菌株大部分為多重耐藥菌株，對喹諾酮類及β-內酰胺類抗生素具有較高的耐藥性，且含有多種毒力基因，具有較高的致病性，在治療肺炎克雷伯菌引起的呼吸道疾病時，可選用多種抗生素進行周期性交替使用，避免細菌耐藥性的產(chǎn)生，同時做好日常防護清潔工作，切斷傳播途徑，減少感染量。