王一平，趙宗閣，吳星，2，梁爭論，2，毛群穎，2

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.國家衛(wèi)生健康委員會生物技術產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室，北京 102629

疫苗類標準物質是生物制品標準物質之一，可分為3 級，包括WHO（一級）、國家（二級）和企業(yè)（三級）標準物質［1-4］，又可按是否溯源至WHO 國際標準物質（international standard，IS）分為兩類，其中非溯源WHO IS 疫苗類國家標準物質具有一級標準物質的某些特性，如賦值確定、統(tǒng)計學考慮和穩(wěn)定性研究等［5］。目前，我國共有114 個疫苗類國家標準物質，其中20個溯源至WHO IS，包括狂犬病疫苗效力國家標準品、百日咳疫苗效力國家標準品和人乳頭瘤病毒抗體國家標準品等；非溯源WHO IS的疫苗類國家標準物質94 個，包括重組戊型肝炎疫苗抗原國家標準品、柯薩奇病毒A組16型（Coxsackievirus A group 16，CA16）疫苗抗原國家標準品、柯薩奇病毒A 組6 型（Coxsackievirus A group 6，CA6）抗體國家標準品和腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）疫苗效力國家參考品等［6-7］?！吨袊幍洹啡浚?020 版）收錄了42 個疫苗類標準物質，包括卡介苗純蛋白衍生物國家標準品、腦膜炎奈瑟菌血清國家參考品、Sabin 株脊髓灰質炎滅活疫苗D抗原國家標準品等［8］。

我國疫苗類國家標準物質水平居世界前列。定量用EV71 疫苗系列國家標準物質的建立（EV71 抗原國家標準品和EV71中和抗體國家標準品）是該類疫苗國家標準物質在全球的首次研制和應用［9-15］，并隨之提出標準物質也應作為一種產(chǎn)品，對其進行基于風險評估基礎上的生命周期管理［16］。近年，我國疫苗行業(yè)發(fā)展迅速，mRNA 平臺疫苗和新佐劑疫苗（如角鯊烯等）均首次獲批緊急使用，對疫苗類國家標準物質提出了如何引領新技術疫苗研發(fā)的挑戰(zhàn)。為規(guī)范二級標準物質的研制，WHO 頒布了《WHO 抗體類國家（二級）標準物質研制手冊》和《新冠等中和抗體國家（二級）標準物質研制手冊》，對二級標準物質的協(xié)作標定人員和單位資質、標定技術和統(tǒng)計學分析等方面均進行了明確要求［3-5］。為提升疫苗類國家標準物質的準確性和科學性，本文結合近年WHO對生物制品二級標準物質的要求，進一步提出加強我國疫苗類國家標準物質研制及管理方面的思考，制定疫苗類國家標準物質的優(yōu)先建立原則，以合理利用資源，保障供應及滿足重大傳染病等公共衛(wèi)生的緊急需求。

1 疫苗類國家標準物質的發(fā)展

1952 年，我國研制出首個疫苗國家標準物質，即標準細菌濁度標準品（比濁管）［17］，2022 年，溯源至WHO IS的SARS-CoV-2 中和抗體國家標準品（品種編號：280034）獲批使用［18-19］，70 年間中國食品藥品檢定研究院（National Institutes for Food and Drug Control，NIFDC）共研制疫苗類國家標準物質114 個，為我國疫苗的質控和評價提供了標尺。其中，EV71 疫苗抗原國家標準品和中和抗體國家標準品的研制加速了我國企業(yè)對EV71疫苗的研發(fā)進程，為我國手足口病的防控做出了貢獻，被WHO 稱為監(jiān)管科學應用的典范［20］。在上述EV71 疫苗中國國家標準物質的基礎上，由NIFDC 與英國國家生物制品檢定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）聯(lián)合主導建立了EV71 疫苗抗原和中和抗體WHO IS［9-15］，表明我國疫苗國家標準物質的研制水平居世界前列。

目前，在我國114 個疫苗國家標準物質中，病毒類標準物質有49個，細菌類標準物質有65個。其中病毒類標準物質包括效力（抗原）檢測17個、效價（抗體）檢測11個、DNA和蛋白質殘留量檢測9個、病毒滴度測定8 個，病毒鑒別4 個；細菌類標準物質包括效力（抗原）檢測46 個、菌種鑒別12 個、效價（抗體）檢測3個、菌種濃度測定3個，特異性毒素檢測1個［21］。

現(xiàn)行版《中國藥典》三部（2020版）共收錄疫苗標準物質42 個，其中病毒類標準物質22 個，細菌類標準物質20 個。病毒類標準物質包括效力（抗原）檢測8 個、效價（抗體）檢測3 個、DNA 和蛋白質殘留量檢測5 個、病毒滴度測定6 個；細菌類標準物質包括效力（抗原）檢測13個、菌種鑒別1個、效價（抗體）檢測2個、菌種濃度測定3個，特異性毒素檢測1個［8］。

2 疫苗類國家標準物質相關法規(guī)及指南文件

疫苗類國家標準物質相關法規(guī)和指南文件包括WHO 指南、現(xiàn)行版《中國藥典》和ISO 17034：2016《標準物質/標準樣品生產(chǎn)者能力認可準則》等。WHO 于1978 年頒布了《WHO 生物制品標準物質的制備和建立指南》［22］，其后為進一步規(guī)范疫苗二級標準物質，于2011 年頒布了《建立國家和其他二級疫苗標準物質的WHO 研制手冊》［2］，其中明確了二級標準物質研制的要求，并于2022年分別頒布了《WHO抗體類國家（二級）標準物質研制手冊》和《新冠等中和抗體國家（二級）標準物質研制手冊》［3-4］?！吨袊幍洹啡浚?020版）通則《生物制品國家標準物質制備和標定》對生物制品國家標準物質的定義、分類、原材料篩選、制備、標定、穩(wěn)定性、替換批等進行了明確規(guī)定［23］。依據(jù)中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CANS）要求，疫苗標準物質的研制和分發(fā)也應符合ISO 17034：2016《標準物質/標準樣品生產(chǎn)者能力認可準則》［24］。

3 WHO近年對二級標準物質的技術要求介紹

WHO 于2022 年4 和6 月分別頒布了《抗體類二級標準物質研制手冊》和《新冠抗體二級標準物質研制手冊》，進一步明確了二級標準物質的技術要求。

3.1 候選原材料的同質性 WHO提出候選原材料應與被檢測的分析物性質盡可能一致，明確可使用與檢測樣品相似的生物制品材料作為候選原材料，如所建立標準物質具有方法特異性，原材料則可選擇重組類抗體和動物血清等替代物，且鼓勵實驗室設法解決可替代性問題。我國在研的SARS-CoV-2 XBB株中和抗體國家標準品和XBB 株sIgA 國家標準品難以獲得高滴度，且需大量抗新變異株的廣譜人源血清及黏膜分泌的sIgA 抗體作為候選原料，因此，正探討采用重組抗體等原料制備候選標準品，但在標定時應充分考慮不同原材料可能帶來的影響，通過協(xié)作標定證明該原材料的可替代性。

3.2 協(xié)作標定 協(xié)作標定是通過與更高一級標準物質同時進行檢測，確定候選標準物質溯源量值的過程，是標準物質研制的關鍵階段。因此WHO 提出：①協(xié)作標定應在具有豐富經(jīng)驗和專業(yè)知識的專家及統(tǒng)計學專家支持下開展，由領域內有經(jīng)驗的機構，如WHO 合作中心（WHO collaborating centre，WHO CC）組織協(xié)作標定。可采用不同檢測方法，但同時盡量采用WHO CC 提供的統(tǒng)一方法進行標定；②所采用的方法均應經(jīng)過驗證，并預設實驗成立接受標準，在研究開始前，應建立檢測方法精密性、線性、定量限和分析測量范圍的接受標準，只有符合接受標準的檢測才能被認為是1 次有效實驗；③實驗應使用適宜的統(tǒng)計模型，對每個獨立檢測需評估統(tǒng)計模型有效性，并需證明符合預設的系統(tǒng)和樣品適應性標準；④應遵循良好的統(tǒng)計原則進行標定賦值，如線性模型，應評估一級和二級標準物質之間平行性，并通過統(tǒng)計分析獲得候選標準品的最終標定值和不確定度（measurement uncertainty，MU）。二級標準物質需計算MU，以95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）表示，多采用不同實驗室（相同檢測方法）多次檢測結果計算［25-26］。檢測次數(shù)越多，MU 下降水平越大。在設計時，需評估累積MU 的影響，確定是否符合標準物質的預期用途。當標準物質是用于校準高精密性的檢測方法或在非常狹窄范圍內做出判定時，MU 高的二級標準物質將不適用。

當使用多個檢測方法標定時，還應考慮以下4點：①使用預先規(guī)定并經(jīng)統(tǒng)計學專家認可的統(tǒng)計方法；②每種檢測方法應單獨分析，分別計算候選二級標準物質與IS的標定值及MU；③不同方法及實驗室間檢測誤差均應進行統(tǒng)計分析；④需評估導致標定值出現(xiàn)顯著異質性、非線性或斜率差異的任何因素，應合并計算二級標準品的所有有效標定值的算術或幾何均值及95%CI。但應通過統(tǒng)計分析，在獲得數(shù)據(jù)分布一致的前提下進行合并賦值。

4 實例介紹：SARS-CoV-2 中和抗體國家標準品研制

為支撐我國SARS-CoV-2 疫苗的研發(fā)和應用，NIFDC 作為WHO CC 之一，依據(jù)《WHO 抗體類國家（二級）標準物質研制手冊》《新冠等中和抗體國家（二級）標準物質研制手冊》及《中國藥典》三部（2020版）的相關要求［1，4，23］，建立了我國首批溯源至WHO IS 的SARS-CoV-2中和抗體國家標準品［18-19］，研制要點如下。

4.1 制備、檢測及穩(wěn)定性研究 選擇與檢測樣品及WHO IS 同質的恢復期人血清作為原材料，經(jīng)檢測符合相關要求。結合原材料的穩(wěn)定性和標準品研制的急迫性，采用液體安瓿瓶分裝形式制備兩份候選標準品（lot202102、lot20200905），經(jīng)檢測含量均一性均較好，中和抗體幾何變異系數(shù)（geometric coefficients of variation，GCV）分別為24%和33%；于25 和37 ℃放置15 d，中和抗體效價均未明顯下降，穩(wěn)定性良好。兩份候選標準品均符合候選標準品研制要求。

4.2 協(xié)作標定 具有SARS-CoV-2中和抗體檢測經(jīng)驗的9 個實驗室參加協(xié)作標定，分別采用經(jīng)過驗證的活病毒和假病毒中和抗體檢測方法，在預設實驗可接受條件的前提下，以WHO IS 為參考，同時對包含這兩份候選標準品、第1 代國家標準品及不同效價、不同毒株感染患者的恢復期血清樣本同時進行3 次以上獨立有效檢測。由NIFDC 在滿足實驗成立預設條件的情況下，采用NIFDC biostats 軟件進行結果計算和統(tǒng)計分析，結果顯示，候選標準品（lot202102）可將真病毒法和假病毒法的實驗室間差異分別從原來的64%～148%和36%～115%降至29%～88%和7%～54%，可有效降低每份樣本在不同實驗室間的檢測誤差；而候選標準品（lot20200905）僅能降低部分樣品的實驗室間檢測差異。同時，候選標準品（lot202102）還可將全部樣本的真病毒法與假病毒法檢測均值的比值從4.3～12.4 倍降至0.6～1.6 倍，且經(jīng)相關性分析提示，其可有效降低真病毒法和假病毒法間的檢測差異，兩者呈高度相關（r=0.869 0，P＜0.05）。

4.3 賦值 將全部檢測結果依據(jù)WHO IS轉換為可溯源IS的結果，以X擬合Y建模進行數(shù)據(jù)分布和均值統(tǒng)計檢驗，結果顯示，候選標準品（lot202102）采用真病毒法和假病毒法檢測均值差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.973 3），但離散度不同，因此合并賦值為：580（460～740）和580（520～640）IU/mL。第1代國家標準品溯源至IS的結果經(jīng)統(tǒng)計分析顯示，真病毒法和假病毒法檢測結果差異有統(tǒng)計學意義（P=0.023 9），且集散度不同，因此分別賦值為：330（280～390）和520（410～660）IU/mL。目前候選標準品（lot202102）已批準為我國第2 代SARS-CoV-2中和抗體國家標準品（品種批號：280034-202102），在NIFDC官網(wǎng)上可查詢和訂購。

本研究首次依據(jù)WHO 近年頒布的《WHO 抗體類國家（二級）標準物質研制手冊》和《新冠等中和抗體國家（二級）標準物質研制手冊》的技術要求研制標準物質，在研究中由統(tǒng)計學專家分別對真病毒法和假病毒法采用適宜的統(tǒng)計模型，在證明模型有效性的基礎上進行結果計算，賦值過程中依據(jù)統(tǒng)計結果確定是否合并賦值，并以95%CI作為方法特異的MU，避免因方法特性不同可能引入的誤差。該研究結果得到了WHO 標準物質專家的認可，認為對全球二級標準物質的研制有較好的借鑒意義［18］。

5 非溯源WHO IS 疫苗類國家標準物質的優(yōu)先建立原則

目前，國家疫苗類生物標準物質的建立是由NIFDC統(tǒng)一制定計劃，經(jīng)篩選原料、制備標定、審評審批后分發(fā)使用。由于非溯源WHO IS疫苗類國家標準物質的研制特性接近WHO 一級標準物質，為保障我國國家疫苗標準物質供應，滿足重大傳染病應急疫苗的研發(fā)需求，結合WHO 有關一級標準物質優(yōu)先建立的原則及我國疫苗行業(yè)發(fā)展情況，本文提出以下非溯源WHO IS疫苗類國家標準物質優(yōu)先建立的原則。

5.1 已有疫苗類國家標準物質的替換批優(yōu)先于新建疫苗標準物質 保障供應是國家標準物質應用的關鍵，對已有疫苗類國家標準物質，特別是《中國藥典》收錄的標準物質，應及時完成替換批，對保證批簽發(fā)等國家法定檢驗職責和企業(yè)完成疫苗生產(chǎn)和檢定具有重要意義。

5.2 優(yōu)先建立用于重大傳染病等公共衛(wèi)生急需疫苗質控和評價的國家疫苗標準物質 疫苗是應對重大傳染病的有效手段，早期開展相關疫苗質控和評價標準物質研制和供應，做到實物標準先行，可規(guī)范和促進疫苗的研發(fā)進程。EV71 疫苗研發(fā)早期，NIFDC在國家課題的支持下，組織相關企業(yè)成功研制EV71國家疫苗抗原定量標準品和中和抗體定量標準品，有力推動了我國EV71疫苗的研發(fā)進程，為遏制高發(fā)的手足口病疫情提供了有效手段。

5.3 優(yōu)先建立用于多家疫苗企業(yè)質控和評價的標準物質 標準物質的內在屬性應保證不同企業(yè)、不同實驗室檢測結果的可比性，并減少實驗室間檢測誤差。因此，當某種疫苗同時存在多家企業(yè)研發(fā)和生產(chǎn)時，建立穩(wěn)定可靠的標準物質對比較不同企業(yè)疫苗的質量，保證疫苗安全、有效、質量可控具有重要意義。

5.4 優(yōu)先建立已批準工藝和質控標準的疫苗類國家標準物質 處于上市前研發(fā)階段的疫苗具有工藝、質控項目及標準、安全性及有效性等諸多不確定因素，企業(yè)標準物質的建立也需以Ⅲ期臨床保護的批次為基礎，因此，優(yōu)先研制已批準工藝和質控標準的國家疫苗標準物質具有較大可行性和應用意義。

6 小結

疫苗類國家標準物質是銜接國際標準物質與企業(yè)工作標準物質之間重要的紐帶和橋梁，是保證疫苗生產(chǎn)、質控、簽發(fā)和應用的核心物質，其同質性、均一性、賦值準確性和穩(wěn)定性至關重要。COVID-19 疫情加速了我國疫苗行業(yè)的發(fā)展，生命周期理念在生物制品標準物質的應用［16］，新型技術平臺如mRNA疫苗、腺病毒載體疫苗和新佐劑疫苗等的獲批使用均對疫苗類國家標準物質提出了新的要求。本文介紹了WHO 近期二級標準物質的技術要求，列舉我國SARS-CoV-2 中和抗體標準物質建立的實例以進一步強調主要技術要點，并提出制定非溯源WHO IS疫苗類國家標準物質優(yōu)先建立原則的建議，為進一步提升我國疫苗國家標準物質的研制和應用水平提供了思路。