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甘草多糖緩解妊娠期暴露代森錳鋅致仔鼠腎臟損傷的保護(hù)作用

2023-03-08 05:02:02孫雨昕宮英闌包佳鷺張偉偉趙俊芳王曉丹
中國獸醫(yī)學(xué)報 2023年2期
關(guān)鍵詞:勻漿空白對照脂質(zhì)

孫雨昕,溫 冉,宮英闌,包佳鷺,張偉偉,趙俊芳,王曉丹,3*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000;2.河北象大合眾生物科技有限公司,河北 正定 050800;3.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 保定 071000)

代森錳鋅(mancozeb,MCZ)屬于二硫代氨基甲酸乙二醇酯(EBDC)類農(nóng)藥,是一種乙烯-二硫代氨基甲酸錳和鋅鹽的混合物,因其低毒性、短期環(huán)境持久性的特點(diǎn)[1],自1948年以來一直在多種農(nóng)作物、觀賞植物上作為常用的廣譜殺菌劑使用[2]。MCZ因其殺菌譜廣、作用位點(diǎn)多、無抗藥性、能為植物補(bǔ)充微量元素鋅的特性,從而提高農(nóng)作物的免疫力,改善農(nóng)作物的品質(zhì),因此被廣泛用于防治蔬菜和果樹等作物中真菌引起的多種病害[3]。然而MCZ及其代謝產(chǎn)物乙撐硫脲[4]可以在對人體有致畸、致癌、影響胚胎著床[5]作用,又在土壤中持久存在,在水中迅速分解,具有高危害潛力,引起了外界的關(guān)注。

近年來,對在實(shí)驗(yàn)動物中產(chǎn)生的MCZ毒性的研究表明,MCZ的EBDC部分導(dǎo)致大鼠肝臟和腎臟中谷胱甘肽狀態(tài)和必需金屬銅穩(wěn)態(tài)改變[6]。有研究發(fā)現(xiàn)MCZ對實(shí)驗(yàn)動物的毒性與生殖毒性、神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌干擾[7]以及睡眠障礙[8]等有關(guān),對人類也有一定的致癌性[9]。國內(nèi)有研究表明,甘草多糖(Glycyrrhizapolysaccharide,GP)對于緩解MCZ毒性的效果較好[10],如誘導(dǎo)細(xì)胞生成活性氧(ROS)[11],增強(qiáng)雞免疫球蛋白IgA和IgG水平[12]、減少肝臟中IL-1β和IFN-γ的升高[13]等提高毒性抵抗力。在MCZ帶來的潛在危害中,農(nóng)業(yè)和工業(yè)工人是發(fā)生MCZ中毒的高風(fēng)險人群,對一般人群也有一定危害性。為此,本試驗(yàn)初步探索妊娠期暴露MCZ對其子代45日齡仔鼠腎臟損傷及GP對妊娠期暴露MCZ誘導(dǎo)子代小鼠腎臟損傷的影響,為人類及動物的健康成長提供相應(yīng)的幫助,為中藥的治療作用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑MCZ(商品級Dithane-M45,80%)、GP(30%)購自西安圣青生物科技有限公司; EastepTMSuper 總RNA 提取試劑盒(LS1040)購自Promega公司;HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 南京諾唯贊生物科技股份有限公司(R323-01);TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)購自 TaKaRa公司 (RR820A);總蛋白定量、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;谷胱甘肽過氧化酶4(GPX4)、鐵死亡抑制蛋白 1 (FSP1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理方法分別選用50只雌性、10只雄性7周齡SPF級昆明小鼠,購自斯貝福實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司,常規(guī)雌、雄分籠飼養(yǎng),自由飲水,1周后合籠飼養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)雌鼠陰栓當(dāng)日定為孕0 d 并換籠單獨(dú)飼養(yǎng)。將50只孕鼠隨機(jī)分為空白對照組(K組)、MCZ對照組(M組)、GP低(D組)、中(Z組)、高(G組)劑量組,每組10只??瞻讓φ战M早晚各灌服1次0.1 mL生理鹽水;MCZ對照組每天早上灌服150 mg/kg的MCZ,晚上灌服0.1 mL生理鹽水;GP低(D組)、中(Z組)、高(G組)劑量組早上灌服150 mg/kg的MCZ、晚上分別灌服50,100,200 mg/kg的GP,所有孕鼠單獨(dú)喂養(yǎng),產(chǎn)后與仔鼠同窩喂養(yǎng),仔鼠21 d時斷奶,泌乳期不飼喂母鼠MCZ。本試驗(yàn)動物處理過程通過河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的動物倫理學(xué)審查。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1仔鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)測定 稱取45日齡仔鼠體質(zhì)量,斷頸處死后摘取腎臟組織,記錄不同組仔鼠腎臟質(zhì)量。腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.3.2仔鼠腎臟組織形態(tài)觀察 將仔鼠腎臟置于4%多聚甲醛溶液中固定,常規(guī)制備石蠟切片,厚度為5 μm,常規(guī)HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察仔鼠腎臟組織形態(tài)變化。

1.3.3仔鼠血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)含量測定 仔鼠血液3 000 r/min離心,取上清,分裝,-20℃ 保存待測。取上清液分別用BUN、Cr試劑盒測定仔鼠血清中BUN和Cr含量。

1.3.4仔鼠腎臟組織勻漿中T-AOC、GSH-Px、SOD、MDA含量測定 取仔鼠腎臟按試劑盒說明書制備10%組織勻漿,提取其上清液,分裝,-20℃保存待測。取組織勻漿上清液,按照說明書分別用T-AOC、GSH-Px、SOD、MDA試劑盒測定腎臟組織中T-AOC、GSH-Px、SOD、MDA含量。

1.3.5仔鼠腎臟組織勻漿中GPX4、FSP1、TGF-β1含量測定 取仔鼠腎臟按ELISA試劑盒說明書制備10%組織勻漿,提取其上清液,分裝,-20℃保存待測。取10%組織勻漿上清液,按照說明書分別用ELISA試劑盒測定腎臟組織勻漿中GPX4、FSP1、TGF-β1的含量。

1.3.6仔鼠腎臟組織中GPX4、NADPH氧化酶4(NOX4)、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(NF-κB)p65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平測定 用總RNA提取試劑盒提取仔鼠腎臟中總RNA,再用反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,-20℃保存。采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測目的基因GPX4、NOX4、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平,引物由大連寶生物有限公司設(shè)計合成(表1)。反應(yīng)條件:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,39個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,用2-△△Ct表示目的基因的相對表達(dá)量。

表1 引物信息

1.4 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Excle整合數(shù)據(jù),SPSS進(jìn)行單因素方差分析,Graphpad Prism 9.0繪圖,差異比較通過One-Way ANOVA評估,*表示MCZ對照組與空白對照組相比,#代表GP組與MCZ對照組相比,*/#P<0.05表示為差異顯著,**/##P<0.01表示為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 對45日齡仔鼠腎臟組織形態(tài)的影響HE染色結(jié)果顯示,空白對照組,腎小球大小正常,周圍界限清晰,腎小管上皮細(xì)胞排列整齊,管腔大小正常;MCZ組腎小囊囊腔變小,周圍界限不清晰,腎小管上皮細(xì)胞部分脫落,腎小管腔里充有均質(zhì)紅染的不等量蛋白性物質(zhì),管腔堵塞;與MCZ組相比,GP組腎小球形狀較正常,腎小囊囊腔結(jié)構(gòu)較清晰,管腔大小較正常(圖1)。

A.空白對照組;B.MCZ對照組;C.GP低劑量組;D.GP中劑量組;E.GP高劑量組。紅色箭頭.腎小囊囊腔變小,周圍界限不清晰;綠色箭頭.腎小管腔里充有均質(zhì)紅染的不等量蛋白性物質(zhì);黑色箭頭.腎小管上皮細(xì)胞部分脫落

2.2 對45日齡仔鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響如圖2所示,在體質(zhì)量方面,MCZ組與空白對照組相比下降,且差異極顯著(P<0.01),用GP與MCZ聯(lián)合處理后差異不顯著;在腎臟指數(shù)方面,MCZ組與空白對照組相比上升,且差異顯著(P<0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組,且高劑量組差異極顯著(P<0.01)。

圖2 GP對妊娠期暴露MCZ的45日齡仔鼠體質(zhì)量和腎臟指數(shù)的影響

2.3 對45日齡仔鼠血清中Cr、BUN的影響如圖3所示,在Cr方面,MCZ組與空白對照組相比上升,且差異極顯著(P<0.01),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組,且中、高劑量組差異極顯著(P<0.01);在BUN方面,MCZ組與空白對照組相比上升,且差異顯著(P<0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組,且低、中、高劑量組差異均極顯著(P<0.01)。

圖3 GP對妊娠期暴露MCZ的45日齡仔鼠Cr和BUN的影響

2.4 對45日齡仔鼠腎臟組織中T-AOC、MDA、SOD、GSH-Px水平的影響如圖4所示,在T-AOC方面,MCZ組與空白對照組相比下降,且差異顯著(P<0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組,且高劑量組差異極顯著(P<0.01);在MDA方面,MCZ組與空白對照組相比上升,且差異極顯著(P<0.01),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組,且中、高劑量組差異極顯著(P<0.01);在SOD方面,MCZ組與空白對照組相比差異不顯著,用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組,且高劑量組差異極顯著(P<0.01);在GSH-Px方面,MCZ組與空白對照組相比差異不顯著,用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組,且低劑量組差異顯著(P<0.05)。

圖4 GP對妊娠期暴露MCZ的45日齡仔鼠T-AOC、MDA、SOD、GSH-Px水平的影響

2.5 對45日齡仔鼠腎臟組織中GPX4、FSP1、TGF-β1的影響如圖5所示,在GPX4方面,MCZ組與空白對照組相比差異不顯著,用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組,且中劑量組差異顯著(P<0.05);在FSP1方面,MCZ組與空白對照組相比下降,且差異顯著(P<0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組,且低、中劑量組差異極顯著(P<0.01);在TGF-β1方面,MCZ組與空白對照組相比上升,且差異顯著(P<0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組,且高劑量組差異顯著(P<0.05)。

2.6 對45日齡仔鼠腎組織中GPX4、NOX4、NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量的影響如圖6所示,在GPX4 mRNA相對表達(dá)量方面,MCZ組與空白對照組相比差異不顯著,用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組,且低、高劑量組差異極顯著(P<0.01);在NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量方面,MCZ組與空白對照組相比差異不顯著,用GP與MCZ聯(lián)合處理后,中劑量組差異顯著(P<0.05);在NOX4 mRNA相對表達(dá)量方面,MCZ組與空白對照組相比差異顯著(P<0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組,且中劑量組差異極顯著(P<0.01),高劑量組差異顯著(P<0.05)。

圖6 GP對妊娠期暴露MCZ的45日齡仔鼠GPX4、NOX4、NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討論

MCZ對雌性生殖器官的特異性作用機(jī)制尚不完全清楚,但體內(nèi)試驗(yàn)研究表明,該殺菌劑會損害小鼠胚胎發(fā)育和減數(shù)分裂紡錘體組裝[14],MCZ可能在細(xì)胞水平上間接干擾或損害生殖,并應(yīng)視為生殖毒物,這一點(diǎn)具有高度至中度的可信度[15],除影響本代接觸者的健康外,MCZ還能通過血-胎盤和血-乳屏障[16]影響到子代的健康。MCZ帶來的生殖毒性在卵巢功能方面表現(xiàn)為通過抑制顆粒細(xì)胞活力,減少卵丘擴(kuò)張,抑制中期板形成,誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞分泌孕酮,可能抑制排卵過程中的垂體激增過程來實(shí)現(xiàn)[7],在子宮方面表現(xiàn)為通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜和降低雌激素受體β和整合素β3的表達(dá)來減少球體附著[17],調(diào)節(jié)蛻膜化而影響胚胎著床,并需要進(jìn)一步研究確切的作用模式[18],在中醫(yī)理論中腎臟與生殖息息相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,GP可以抑制MCZ處理后小鼠體質(zhì)量的下降和腎指數(shù)的上升。

腎臟損傷引起體內(nèi)的氧化與抗氧化過程失衡造成氧化應(yīng)激狀態(tài),且腎臟對氧化應(yīng)激高度敏感[19]。血清里的Cr[20]、BUN水平作為高效的腎功能生物標(biāo)志物,被廣泛的用于腎病的診斷與評價。對于母胎,氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化和DNA損傷等可能會造成自然流產(chǎn)[21]等,對體內(nèi)的胚胎也會產(chǎn)生毒性,造成出生體質(zhì)量降低、免疫低下等狀態(tài)[22]。氧化應(yīng)激狀態(tài)時一方面刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的ROS,引起機(jī)體的ROS積累,組織脂質(zhì)過氧化程度升高,MDA水平升高[23],損傷腎臟細(xì)胞,產(chǎn)生細(xì)胞凋亡、腎臟纖維化、炎癥[24]等;另一方面機(jī)體清除自由基的能力下降,表現(xiàn)為T-AOC、SOD、GSH-Px活性下降。T-AOC體現(xiàn)機(jī)體各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平;SOD可以及時修復(fù)受損細(xì)胞[25],將超氧化物自由基轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧分子達(dá)到清除自由基的效果[26],所以SOD活性可以間接體現(xiàn)機(jī)體清除自由基的能力;谷胱甘肽是一種主要的抗氧化劑,可以直接清除自由基,機(jī)體產(chǎn)生的過量的過氧化氫可以被GSH-Px代謝成水分子[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,GP可以抑制MCZ導(dǎo)致的Cr、BUN和 MDA水平的升高,抑制T-AOC、SOD、GSH-Px活性的下降,降低腎臟損傷和脂質(zhì)過氧化程度。

鐵死亡有3種主要調(diào)節(jié)機(jī)制:脂質(zhì)過氧化、鐵離子蓄積和氨基酸代謝紊亂。GPX4和FSP1[28]共同構(gòu)成鐵死亡防御系統(tǒng)[29],ROS等的存在會促進(jìn)鐵死亡的發(fā)展。研究表明,GPX4能降解部分脂質(zhì)過氧化物,從而抑制脂質(zhì)過氧化過程,如果上調(diào)了GPX4的表達(dá)會使機(jī)體對鐵死亡更加不敏感[30]。除此之外,誘導(dǎo)機(jī)體鐵死亡時會導(dǎo)致體內(nèi)ROS升高,促進(jìn)脂質(zhì)過氧化。本試驗(yàn)結(jié)果表明,GP可以抑制MCZ帶來的GPX4、FSP1水平的降低,增加機(jī)體對鐵死亡的耐受性。

TGF-β1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、組織纖維化[31]、腫瘤和免疫等過程的雙向調(diào)節(jié)因子,廣泛參與體內(nèi)各種病理生理過程,在腫瘤細(xì)胞中,早期抑制細(xì)胞增殖從而達(dá)到抗腫瘤作用,在晚期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以達(dá)到抗腫瘤作用[32],TGF-β1在炎性環(huán)境中發(fā)揮抗炎作用,而TGF-β1的過度生產(chǎn)則又會導(dǎo)致急性腎小管損傷;NOX4是NADPH氧化酶,其主要在腎臟組織表達(dá),催化氧生成ROS,對ROS含量敏感[33];NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控多種與炎癥、抗凋亡和腫瘤等有關(guān)的基因表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,GP在仔鼠45日齡時抑制TGF-β1水平,另外,GP還抑制MCZ導(dǎo)致的NOX4、NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平的升高,從而降低腎臟氧化應(yīng)激程度。

綜上所述,GP通過提高45日齡仔鼠的抗氧化能力和對鐵死亡的耐受力而減輕腎臟損傷對機(jī)體帶來的影響,GP低、中、高劑量均對MCZ誘導(dǎo)的45日齡仔鼠的腎臟損傷有一定的抑制效果,其中以中劑量的GP(100 mg/kg)對45日齡仔鼠腎臟的保護(hù)作用最為明顯。

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