姚逸萍，趙德義，陳杉彬*，曹建全，張曉蒙，孫偉，趙文梅，劉建波，楊海存，郝飛克

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京， 100015)2(山東景芝白酒有限公司，山東 安丘， 262119)3(酒類品質(zhì)與安全國(guó)際聯(lián)合研究中心, 北京， 100015)

酒精進(jìn)入人體后首先經(jīng)過(guò)血液進(jìn)入肝臟，通過(guò)肝臟功能代謝分解，主要對(duì)肝臟造成嚴(yán)重壓力。短期飲酒會(huì)造成嘔吐、記憶力減退、情緒不穩(wěn)定等神經(jīng)問(wèn)題。長(zhǎng)期過(guò)量飲酒可能會(huì)造成脂肪肝、酒精性肝炎及肝硬化等疾病。酒精中毒和酒精造成的損傷已成為普遍問(wèn)題。飲酒后可能主要對(duì)體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激刺激，在體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的自由基。自由基過(guò)多及清除自由基時(shí)可能會(huì)發(fā)生自由基防御體系障礙，會(huì)引起過(guò)氧化反應(yīng)而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害。自由基積累增多會(huì)引起細(xì)胞、組織的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，進(jìn)而造成氧化損傷，同時(shí)還能引起機(jī)體炎癥的發(fā)生。細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)依賴溶酶體介導(dǎo)的長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)或受損細(xì)胞器降解的主要機(jī)制。自噬在真核生物中普遍存在，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞自我保護(hù)以及生存等生理、病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。細(xì)胞通過(guò)響應(yīng)應(yīng)激信號(hào)，如營(yíng)養(yǎng)缺乏，會(huì)迅速啟動(dòng)自噬信號(hào)通路，形成閉合的雙層膜結(jié)構(gòu)，包裹細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的/長(zhǎng)壽命蛋白、受損細(xì)胞器或侵入的病原體，與溶酶體融合，形成自噬溶酶體進(jìn)行降解并回收利用降解產(chǎn)物以應(yīng)對(duì)不利環(huán)境[2]。炎癥是微生物病原體感染或組織損傷所激活的機(jī)體保護(hù)性反應(yīng)。細(xì)胞自噬與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，模式受體Toll樣受體的激活能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，而細(xì)胞自噬又對(duì)炎癥反應(yīng)有調(diào)控作用[3-5]。

中國(guó)白酒含有復(fù)雜的成分。其中包含多種小分子活性肽，小分子活性肽具有清除體內(nèi)過(guò)量氧自由基活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)，減少脂質(zhì)過(guò)氧化，提高機(jī)體免疫力，抗疲勞，調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、促進(jìn)酒精代謝等功能?；艏畏f等[6]采用直接濃縮并結(jié)合液液萃取法從芝麻香型白酒中分離純化出一種三肽，并通過(guò)高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀確定其氨基酸序列為 Arg-Asn-His(RNH)，含量為(18.78±0.34) μg/L。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RNH通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶包括過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物(glutathione peroxidase, GSH-PX)酶的活性來(lái)清除氧化損傷產(chǎn)生的ROS，同時(shí)可以抑制過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的上升，從而提高細(xì)胞抗氧化能力[7]。WU[8]等在一種芝香型白酒中檢測(cè)出短肽Ala-Lys-Arg-Ala(AKRA)，并發(fā)現(xiàn)其在HepG2細(xì)胞中可以減少ROS的生成，增加SOD活性，并減少M(fèi)DA的含量，有具有一定的抗氧化作用，但未進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)理。除RNH、AKRA外，還有2條抗氧化肽曾被報(bào)道過(guò)，其氨基酸序列分別為Pro-His-Pro(PHP)[9]和Asp-Arg-Ala-Arg(DRAR)[10]。

目前關(guān)于短肽AKRA的相關(guān)功能研究較少，僅初步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)判斷其具有一定的抗氧化能力，但這種抗氧化能力的具體作用機(jī)理還未進(jìn)行深入研究。本研究通過(guò)人正常肝細(xì)胞，對(duì)短肽AKRA的抗氧化作用，調(diào)控細(xì)胞自噬和抑制炎癥反應(yīng)的具體機(jī)理進(jìn)行了進(jìn)一步研究，并通過(guò)酒精性肝損傷模型觀察了AKRA對(duì)酒精性肝損傷在體內(nèi)的保護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Ala-Lys-Arg-Ala(AKRA)，純度≥98%，由超純水配制為150 g/L，吉爾生化有限公司；人正常肝細(xì)胞LO2購(gòu)買于國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，為49～56日齡雄性C57BL/6 J小鼠，體重18～22 g，動(dòng)物的飼養(yǎng)溫度為(23±2) ℃，相對(duì)濕度為(50±5) %，光照時(shí)間12 h/d，自由飲食，5 只/籠，合籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)處理均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理與保護(hù)相關(guān)規(guī)定，并隨時(shí)接受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的監(jiān)督與檢查，許可證號(hào)為 (JK)2021-W-003；RPMI-1640培養(yǎng)基、雙抗HyClone青鏈霉素、0.25 %胰蛋白酶，美國(guó)Gibco公司；CCK-8，日本Dojindo公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、AAPH，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Lysis Buffer細(xì)胞裂解液，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；核蛋白分步提取試劑盒BB-3104，貝博生物；CAT、GSH、SOD、MDA、總膽固醇(total cholesterol，T-cho/ TC)、血清中甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，南京建成生物技術(shù)研究所；脫脂牛奶、BCA試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液(P1040)，索萊寶公司；Marker(1610374)，BIO-RAD公司；一抗：核因子E-2-相關(guān)因子(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2) (16396-1-AP)、Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1) (10503-2-AP)、炎性因子核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB) (10745-1-AP)、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,INOS) (18985-1-AP)、環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX2) (12375-1-AP)，英國(guó)Proteintech公司；LC3(PM036)，P62(PM045)，日本MBL公司；3-磷酸甘油醛脫氫酶(5174S) (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)，CST公司；二抗：Rabbit(7074S)，CST公司；ECL曝光液，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF), 美國(guó)Merck millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)賽默飛科技有限公司；SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置， 美國(guó)Bio-Rad公司；標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，北京百晶生物技術(shù)有限公司；ChemiScope 6200 Touch科學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS與1%(體積分?jǐn)?shù))雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)LO2細(xì)胞，該細(xì)胞屬于單層貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁達(dá)到80%～90%時(shí)，使用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化傳代，每2～3 d進(jìn)行1次傳代。

1.3.2 細(xì)胞存活率測(cè)定

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的LO2細(xì)胞，加入適量0.25%胰蛋白酶消化約3 min。用含10%FBS與1%雙抗的RPMI-1640的培養(yǎng)液,接種于96孔板，每孔100 μL，接種細(xì)胞量為1.6×104每孔。分為空白組、正常對(duì)照組和不同劑量AKRA組(AKRA濃度為0～6.4 mg/mL)，每組3個(gè)平行。置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)板，每孔加入100 μL CCK8預(yù)混液[V(完全培養(yǎng)液)∶V(CCK8)=9∶1],置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h, 采用SpectraMax iD3酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度值，測(cè)定完成后按照公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率：

(1)

式中：OD實(shí)驗(yàn)組為測(cè)定孔讀數(shù)數(shù)值;OD空白孔為無(wú)添加讀數(shù)數(shù)值;OD正常對(duì)照組為只加1640培養(yǎng)基處理細(xì)胞讀數(shù)數(shù)值。

1.3.3 AKRA對(duì)氧化損傷細(xì)胞內(nèi)MDA含量和抗氧化酶活性的影響

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的LO2細(xì)胞，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化約3 min。用含10%FBS與1%雙抗的RPMI-1640的培養(yǎng)液，接種于6孔板，每孔2 mL, 接種細(xì)胞量為2×105每孔。分為空白對(duì)照組、AAPH處理組(400 μmol/L)、低劑量AKRA組(AKRA質(zhì)量濃度為1 mg/mL)、中劑量AKRA組(AKRA質(zhì)量濃度為3 mg/mL)和高劑量AKRA組(AKRA質(zhì)量濃度為6 mg/mL)，首先用AKRA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理21 h, 然后再用AKRA+AAPH同時(shí)處理3 h，經(jīng)由冷PBS清洗2次后，用Lysis Buffer裂解細(xì)胞，取上清液嚴(yán)格按照BCA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，同時(shí)，測(cè)定脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA、抗氧化酶(CAT、SOD)活力和GSH含量。

1.3.4 蛋白免疫印跡

在收集的蛋白樣品中加入5×蛋白上樣緩沖液, 98 ℃金屬浴加熱5 min。將蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔，通過(guò)Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置，每塊膠以電流為20 mA的電流強(qiáng)度進(jìn)行恒流電泳。在目的蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1 cm以上時(shí)結(jié)束或在溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，關(guān)閉電源，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。使用標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜電壓為120 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60 min。轉(zhuǎn)膜完畢后，把PVDF膜放置到含5%(體積分?jǐn)?shù))脫脂牛奶的TBS/T溶液 (tris-HCl tween)中，室溫封閉60 min。封閉結(jié)束，用封閉緩沖液稀釋一抗，室溫下孵育2 h，使用TBS/T緩沖液，重復(fù)洗滌3次，每次5 min。用封閉緩沖液稀釋二抗，室溫下孵育40 min。使用TBS/T緩沖液，重復(fù)洗滌3次，每次5 min。利用ChemiScope 6200 Touch科學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。使用Image J對(duì)蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模

實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將50只小鼠隨機(jī)分成5組，分別為空白對(duì)照、食用酒精組、低劑量AKRA組、中劑量AKRA組、高劑量AKRA組。其中食用酒精組、AKRA低劑量組、AKRA中劑量組、AKRA高劑量組分別灌胃120 μL的 52%vol食用酒精，空白組灌胃等劑量生理鹽水。其中AKRA低劑量組、AKRA中劑量組、AKRA高劑量組分別每天注射0.1 g/kg bw AKRA、0.2 g/kg bw AKRA和0.4 g/kg bw AKRA，30 d，最后一次注射后禁食不禁水，8 h后，眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟組織和血液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其中，將右半部肝臟組織通過(guò)10%(體積分?jǐn)?shù))中性多聚甲醛固定制備石蠟切片，肝臟組織病理學(xué)變化采用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色后觀察；其余肝臟組織存于-80 ℃冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查

肝臟組織用10%中性多聚甲醛固定24 h后轉(zhuǎn)入70%(體積分?jǐn)?shù))酒精溶液中脫水處理24 h，常規(guī)石蠟包埋后制作厚度約4 μm的切片，使用C8H10進(jìn)行脫蠟處理，酒精梯度(95%、90%、80%、75%，體積分?jǐn)?shù))脫水；蘇木精染色；鹽酸醇分化；0.5%伊紅染色后常規(guī)梯度酒精(75%、80%、90%、95%，體積分?jǐn)?shù))脫水后經(jīng)100%乙醇Ⅰ(10 min)，100%酒精Ⅱ(10 min)；最后經(jīng)二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片，在Nikon光學(xué)顯微鏡Eclipse Ci-L下，選取不同的視野拍照并分析肝臟組織病理學(xué)變化。

1.3.7 小鼠肝功能和血脂水平的檢測(cè)

小鼠眼球取血，靜置時(shí)間30 min，經(jīng)3 000 r/min離心10 min，得到血清，并將其轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱進(jìn)行低溫保存。按照試劑盒使用說(shuō)明書，通過(guò)賴氏法檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT水平。小鼠體內(nèi)血清中TC水平、血清中TG水平、HDL和LDL的水平分別通過(guò)膽固醇氧化酶-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)法(cholesterol oxidase-peroxidase，COD-PAP)、磷酸甘油氧化酶-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)法(glycerophosphate oxidase-peroxidase，GPO-PAP)、直接檢測(cè)法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Prism 9.0分析處理數(shù)據(jù)，組間檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行試驗(yàn)的平均值，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(standard error, SE)表示；圖表由Prism 9.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度AKRA對(duì)細(xì)胞存活率及相關(guān)氧化指標(biāo)的影響

由圖1可知，與空白組相比較，通過(guò)用不同質(zhì)量濃度(0～6.4 mg/mL)的AKRA處理人肝源細(xì)胞LO2 24 h，細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異(P>0.05)，均在80%以上，表明AKRA在此質(zhì)量濃度下對(duì)LO2細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響和毒性作用，細(xì)胞活力正常。因此后續(xù)選用0～6 mg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖2可知，與空白組相比較，AAPH處理后，LO2細(xì)胞SOD、CAT、GSH水平均呈現(xiàn)不同程度的降低，MDA含量升高。與模型組比較，AKRA處理細(xì)胞后，SOD(P>0.05)、CAT(P>0.05)和GSH(P>0.05)活性在6 mg/mL條件下顯著升高，而MDA活性在6 mg/mL條件下則顯著降低(P>0.05)。通過(guò)用AAPH對(duì)人源肝細(xì)胞進(jìn)行氧化性損傷，多肽AKRA能夠緩解這種損傷，表明AKRA對(duì)AAPH造成的LO2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。

圖1 細(xì)胞存活率

a-SOD活力;b-CAT活力;c-GSH活力;d-MDA活力

2.2 不同濃度AKRA對(duì)細(xì)胞氧化通路的影響

Nrf2屬于核轉(zhuǎn)錄因子家族，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)[11-12]。在生理?xiàng)l件下，Nrf2與Keap1結(jié)合，形成蛋白復(fù)合物，定位于細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞面臨氧化壓力時(shí)，Nrf2與Keap1解離，進(jìn)入細(xì)胞核，并激活抗氧化反應(yīng)元件 (anti-oxidative response element, ARE) 的基因表達(dá)，以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激所引起的損傷[13-14]。如圖3所示，AKRA處理LO2細(xì)胞后，細(xì)胞核中Nrf2蛋白水平升高，Keap1蛋白降低，說(shuō)明Keap1蛋白與Nrf2解離后，經(jīng)蛋白酶體或自噬降解。提示AKRA是通過(guò)調(diào)控Nrf2-Keap1蛋白復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用。

a-氧化通路關(guān)鍵蛋白表達(dá);b-半定量分析

2.3 不同濃度AKRA對(duì)細(xì)胞自噬通路的影響

自噬是細(xì)胞為維持自身代謝發(fā)生的胞質(zhì)組分降解的動(dòng)態(tài)過(guò)程， LC3與P62蛋白是自噬標(biāo)記蛋白[15-17]。P62蛋白可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Keap1蛋白，促使其自噬性降解，以增加Nrf2的入核數(shù)量并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄抗氧化基因[18]。因此，進(jìn)一步觀察了AKRA是否通過(guò)Nrf2影響自噬活性。如圖4所示，LO2細(xì)胞經(jīng)AKRA處理后，LC3蛋白隨AKRA濃度增高而增加，而P62蛋白隨AKRA濃度增高則呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。提示AKRA對(duì)細(xì)胞自噬有促進(jìn)作用，這一作用可能與作用于氧化通路的關(guān)鍵蛋白Nrf2有關(guān)。

a-自噬通路關(guān)鍵蛋白表達(dá);b-半定量分析

2.4 不同濃度AKRA對(duì)細(xì)胞炎癥通路的影響

炎癥與氧化應(yīng)激相輔相成，為進(jìn)一步探索AKRA在LO2細(xì)胞中的抗炎作用，觀察了NF-κB、INOS蛋白及COX2蛋白水平的變化。如圖5所示，與對(duì)照組相比，AAPH處理LO2細(xì)胞后，NF-κB、INOS及COX2等炎性因子表達(dá)增多。經(jīng)過(guò)不同濃度的AKRA處理后，炎癥相關(guān)蛋白NF-κB、INOS、COX2呈現(xiàn)不同趨勢(shì)下降。且NF-κB隨AKRA濃度升高，下降趨勢(shì)更為顯著。該結(jié)果提示AKRA具有一定的抑制炎癥的作用。

a-炎癥通路關(guān)鍵蛋白表達(dá);b-半定量分析

2.5 不同濃度AKRA對(duì)小鼠氧化應(yīng)激的影響

進(jìn)一步觀察AKRA在小鼠體內(nèi)的生理作用。如圖6所示，與食用酒精組比較，不同劑量AKRA處理組小鼠肝組織SOD(P>0.05)、GSH(P>0.05)、CAT(P>0.05)活性呈濃度依賴性升高，MDA(P>0.05)含量剛呈濃度依賴性下降。上述結(jié)果提示，AKRA在體內(nèi)同樣具有抗氧化作用。酒精在肝臟內(nèi)的代謝過(guò)程是氧化還原過(guò)程，因此，進(jìn)一步觀察AKRA是否能夠通過(guò)提高小鼠肝臟的抗氧化能力，達(dá)到在一定程度上保護(hù)酒精造成的肝損傷。

a-SOD活力;b-GSH活力;c-CAT活力;d-MDA活力

2.6 不同濃度AKRA對(duì)小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

如圖7所示，通過(guò)HE染色，空白對(duì)照組小鼠肝組織基本無(wú)明顯病理變化，肝組織排列緊密，肝細(xì)胞正常生長(zhǎng)，無(wú)變性情況；食用酒精組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞出現(xiàn)排列紊亂、纖維化、脂肪滴空泡，其中炎性細(xì)胞較多(圖7-b)。低濃度AKRA組出現(xiàn)肝細(xì)胞排列緊密，肝細(xì)胞胞漿疏松淡染，小葉出現(xiàn)炎性細(xì)胞小灶性浸潤(rùn)(圖7-c)；中濃度AKRA組：門管區(qū)肝細(xì)胞胞漿輕度疏松淡染小葉偶見(jiàn)炎性細(xì)胞小灶性浸潤(rùn)(圖7-d)。高濃度AKRA組出現(xiàn)較少的炎性細(xì)胞小灶性浸潤(rùn)(圖7-e)。長(zhǎng)期飲酒后，已經(jīng)對(duì)肝細(xì)胞出現(xiàn)一定影響，主要包括肝細(xì)胞變性，炎性侵染等，但不同處理均有一定差別，通過(guò)施加AKRA處理后，肝細(xì)胞狀態(tài)明顯優(yōu)于食用酒精，AKRA對(duì)由食用酒精造成的肝損傷起到了一定的保護(hù)作用，從而減少酒精帶來(lái)的肝損傷危害。

a-空白對(duì)照組;b-食用酒精組;c-0.1 g/kg bw AKRA;d-0.2 g/kg bw AKRA;e-0.4 g/kg bw AKRA

2.7 不同濃度AKRA對(duì)小鼠肝臟功能和血脂水平的影響

如圖8所示，與食用酒精組相比較，AKRA處理組小鼠在血清中AST、ALT水平均有一定程度降低。在AST(P<0.05)水平上，不同濃度AKRA處理組分別是食用酒精組的0.900、0.877和0.854倍，但三者之間無(wú)顯著性差異。而在ALT(P<0.05)水平上，不同濃度AKRA處理組不同程度的低于食用酒精組，分別是食用酒精的0.739、0.699和0.682倍，但三者之間無(wú)顯著性差異。在ALP(P<0.05)水平上，不同濃度AKRA處理組分別是食用酒精組的0.899、0.878 和0.849倍，但三者之間無(wú)顯著性差異。與食用酒精組相比較，AKRA不同劑量組小鼠血清中TC(P<0.05)、TG(P>0.05)、LDL(P>0.05)水平相較食用酒精組出現(xiàn)下降的現(xiàn)象(P<0.05)，同時(shí)HDL(P>0.05)水平上升；表明AKRA能在一定程度上緩解食用酒精造成的肝損傷，但無(wú)法使這種損傷恢復(fù)至初始狀態(tài)。

a-AST活性;b-ALT活性;c-ALP活性;d-T-cho活性;e-TG活性;f-LDL活性;g-HDL活性

3 結(jié)論與討論

為探究一品景芝酒中一種四肽AKRA (Ala-Lys-Arg-Ala)的生理功能及其緩解酒精性肝損傷的可能作用機(jī)理，本研究用不同濃度的AKRA對(duì)人源肝細(xì)胞LO2及C57小鼠進(jìn)行處理，觀察在氧化應(yīng)激條件下的LO2細(xì)胞及酒精性肝損傷模型小鼠的影響作用。AKRA處理細(xì)胞后，可以提高其抗氧化酶活力，不同程度減少由AAPH帶來(lái)的氧化損傷。Nrf2-Keap1是抗氧化信號(hào)通路中的一條關(guān)鍵蛋白復(fù)合物，在各種組織、器官中均能夠表達(dá)。Nrf2的缺失能夠增加小鼠急性酒精暴露導(dǎo)致的死亡率[19-21]。AKRA處理細(xì)胞后，可以加速Nrf2與Keap1解離，能夠促進(jìn)Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核中發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄功能。Nrf2蛋白解離的Keap1蛋白，可能與P62蛋白結(jié)合，通過(guò)自噬途徑進(jìn)行降解，而Nrf2蛋白入核后，可以通過(guò)調(diào)控下游抗氧化蛋白進(jìn)而提高下游抗氧化相關(guān)酶的活力[21]。本研究中使用AKRA處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，LC3蛋白含量升高，同時(shí)P62降解，提高了LO2細(xì)胞的自噬活性。AKRA處理LO2細(xì)胞后，炎性因子NF-κB、INOS、COX2表達(dá)均下降，提示AKRA具有一定的抑制炎癥反應(yīng)的作用。

肝組織病理形態(tài)學(xué)提示，食用酒精組小鼠肝組織呈炎性改變；AKRA各濃度處理組肝細(xì)胞變性數(shù)量及情況均要優(yōu)于食用酒精組小鼠。同時(shí)在對(duì)不同組小鼠肝臟健康相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果表明用AKRA處理誘導(dǎo)的酒精性肝損傷小鼠，能夠在一定程度上緩解的酒精性肝損傷的發(fā)生。目前研究表明酒精能夠產(chǎn)生氧化應(yīng)激引起機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)。乙醇代謝產(chǎn)物乙醛可直接與組織SOD、GSH-PX等抗氧化酶和抗氧化蛋白GSH結(jié)合而導(dǎo)致抗氧化酶活性下降, 造成系統(tǒng)抗氧化功能降低[22-24]。能夠發(fā)現(xiàn)AKRA處理組中的氧化相關(guān)指標(biāo)CAT、GSH、SOD活力均比食用酒精組中不同程度升高，MDA水平降低，表明AKRA對(duì)小鼠的酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用，而這種能力是通過(guò)調(diào)控體內(nèi)抗氧化通路達(dá)到的。

目前研究結(jié)果表明，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均能夠一定程度表明AKRA是通過(guò)調(diào)控抗氧化物酶的活力來(lái)達(dá)到緩解氧化應(yīng)激損傷，保持氧化水平，這與目前針對(duì)AKRA的作用的相關(guān)研究是相符合的。本研究深入探究了AKRA的調(diào)控機(jī)理，發(fā)現(xiàn)其主要是通過(guò)調(diào)控抗氧化關(guān)鍵通路Nrf2-Keap1進(jìn)而影響下游相關(guān)抗氧化酶的合成。同時(shí)還通過(guò)影響細(xì)胞自噬通路關(guān)鍵蛋白及炎癥通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善酒精性肝損傷。但這種緩解能力是有一定限度的，可能是AKRA直接作用與抗氧化通路的某些關(guān)鍵蛋白帶來(lái)的影響。AKRA能夠通過(guò)作用于抗氧化通路關(guān)鍵蛋白、細(xì)胞自噬通路關(guān)鍵蛋白和炎癥通路關(guān)鍵蛋白，提高抗氧化酶活力，減少氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)緩解炎癥損傷，進(jìn)而減緩酒精帶來(lái)的肝臟損害。