任宇婷，喬美靈，孫子羽，張桂蓮，滿都拉*，陳忠軍*

1(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)2(內(nèi)蒙古池園酒業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特，011500)

高級醇又稱雜醇油(higher alcohols)，是指碳原子數(shù)大于2的醇類，具有醇甜和助香功能，同時也是形成酯類和醛類等風味物質(zhì)的重要前體，在酒類風味物質(zhì)組成中占有重要地位。白酒中常見的高級醇包括正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇、己醇和苯乙醇等。研究發(fā)現(xiàn)，高級醇代謝途徑主要有氨基酸降解途徑(Ehrlich pathway)和合成代謝途徑(Harris pathway)(圖1)。其中，Ehrlich pathway是支鏈氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶作用下形成相應(yīng)的α-酮酸，α-酮酸經(jīng)脫羧和還原，形成比原氨基酸少一個碳的高級醇[1]。如蘇氨酸(Thr)生成正丙醇、亮氨酸(Leu)生成異戊醇、纈氨酸(Val)生成異丁醇、異亮氨酸(Ile)生成活性戊醇(2-甲基丁醇)、苯丙氨酸(Phe)生成苯乙醇等[2-3]。Harris pathway是由糖通過糖酵解途徑生成丙酮酸(α-酮酸)，丙酮酸經(jīng)脫羧還原形成高級醇[4]。

圖1 高級醇代謝途徑

氨基酸是微生物生長代謝所需氮源之一，在發(fā)酵過程中主要由蛋白質(zhì)經(jīng)芽孢桿菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物和酶作用下代謝生成[5-6]。當游離氨基酸含量較高時酵母菌主要利用Ehrlich pathway合成高級醇，而游離氨基酸耗盡時主要利用Harris pathway合成高級醇[7]。在葡萄酒發(fā)酵過程中添加丙氨酸(Ala)和纈氨酸(Val)能顯著增加異丁醇的含量[8]。黃酒釀造中添加纈氨酸(Val)可增加異丁醇和異戊醇的含量[9]。因此，氨基酸種類和含量是影響酒類發(fā)酵過程中高級醇生成的重要因素之一[10-12]。

微生物合成高級醇的生理目的之一是平衡細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，即將NADH的H+傳遞給醛轉(zhuǎn)變?yōu)榇?，以平衡NADH/NAD+的比例[13]。因此，氧化還原狀態(tài)是影響微生物合成高級醇的另一重要原因。目前清香型白酒發(fā)酵過程中游離氨基酸含量變化，以及在混合微生物作用下游離氨基酸與高級醇合成的相關(guān)性尚不清楚，并且在發(fā)酵過程中Ehrlich pathway和Harris pathway對高級醇合成的貢獻性尚不明確。基于以上，本研究以清香型白酒為研究對象，通過測定發(fā)酵過程中高級醇含量、氧化還原電位和游離氨基酸含量變化，分析高級醇與氧化還原電位和游離氨基酸之間的關(guān)系，探究清香型白酒發(fā)酵過程中高級醇生成規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

酒醅樣品采集于北方某清香型白酒廠，地缸發(fā)酵，采集發(fā)酵周期為28 d的大楂樣品，采集時間為發(fā)酵 0、3、5、7、10、12、15、18、21、24、28 d，每個時間點分別采集3個發(fā)酵缸的酒醅樣品。

1.1.2 試劑和儀器

鹽酸、氯化鈉、磷酸(分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；磺基水楊酸，天津永晟精細化工有限公司；標準品Amino Acids Mixture Standard Solution(Type H)，日立高新科學(xué)公司；仲辛醇(色譜純)，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；甲醇(色譜純)，賽默飛世爾科技公司。

TR-901土壤ORP電位計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SCIENTZ-IID超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18KS Sigma高速離心機，上海成貫儀器有限公司；LA8080高速氨基酸自動分析儀，日立高新科學(xué)公司；TriPlus 500VL頂空進樣器、Trace 1300氣相色譜儀、ISQ7000質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技公司；BCD-249CF美菱冰箱，合肥美菱股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高級醇含量測定

準確稱取2.5 g(準確至0.01 g)酒醅樣品到頂空瓶中，加入10 mL基體改性劑；并加入10 μL的內(nèi)標溶液(2.2 g/L)，立即擰緊瓶蓋，混勻待測。GC-MS測定條件[14]：初始溫度為35 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速率升高至150 ℃并保持5 min，再以5 ℃/min 的速率升高至230 ℃ 并保持2 min。載氣為高純度氦氣，氣體流速為1.0 mL/min，進樣器溫度250 ℃，傳輸線溫度260 ℃，離子源溫度280 ℃。質(zhì)譜儀EI發(fā)射電流為50 μA，EI的離子能量為70 eV。m/z掃描35～450 amu的總離子流，使用NIST 2.3譜庫比對。進樣方式為不分流進樣，進樣量為1.0 mL。根據(jù)GC-MS 檢測的高級醇和內(nèi)標的峰面積計算不同發(fā)酵時期酒醅中高級醇含量。

1.2.2 氧化還原電位測定

取樣前使用土壤ORP電位計測定酒醅氧化還原電位，參比電極位于發(fā)酵缸中心位置，ORP電極位于參比電極兩側(cè)并且與參比電極的距離相等，待儀器測定數(shù)值鎖定后記錄數(shù)值。

1.2.3 游離氨基酸含量測定

稱取1 g(準確至0.01 g)酒醅樣品，準確加入5 mL水，在25 ℃條件下超聲處理10 min(100 W，40 kHz)，于10 000 r/min離心10 min。取上清液5 mL加入5 mL 10%磺基水楊酸，混合均勻置4 ℃冰箱冷藏靜置60～120 min，于12 000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機分析[5]。使用高速氨基酸分析儀測定酒醅中游離氨基酸含量。以峰面積定量，根據(jù)標準氨基酸的校正因子和樣品稀釋因子計算酒醅中氨基酸的含量。

1.2.4 統(tǒng)計分析

使用SPSS 24.0對氧化還原電位、高級醇和游離氨基酸含量進行單因素方差分析和聚類分析，使用R語言(Psych)計算Spearman相關(guān)性系數(shù)，使用Origin Lab 2017及R語言(ggplot2)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中高級醇含量變化

在整個發(fā)酵過程中，高級醇含量在發(fā)酵0 d時最低，發(fā)酵0～3 d含量迅速升高，此后隨發(fā)酵進行呈現(xiàn)先降低再增加的規(guī)律，不同高級醇最高含量出現(xiàn)時間有所不同(圖2)。丙醇在發(fā)酵0 d時未檢測出，在發(fā)酵3 d時達到最高(360.89 μg/kg)，發(fā)酵28 d時含量為269.37 μg/kg。異戊醇和異丁醇在發(fā)酵24 d時含量最高(5 163.06、3 310.56 μg/kg)，此后略有下降，發(fā)酵28 d時含量分別為5 091.24、3 100.37 μg/kg。2-甲基丁醇(活性戊醇)在發(fā)酵7 d時含量最高(1 437.46 μg/kg)，發(fā)酵28 d時含量為1 350.88 μg/kg。苯乙醇在發(fā)酵28 d時含量最高為279.36 μg/kg。正戊醇、正丁醇和正己醇的含量相對較低，在發(fā)酵24 d時含量最高(7.88、26.22、33.26 μg/kg)，此后略有下降，發(fā)酵28 d時含量分別為7.46、24.64、29.57 μg/kg。整體來看，在發(fā)酵結(jié)束時(發(fā)酵28 d)各高級醇累計含量之間的關(guān)系為異戊醇>異丁醇>2-甲基丁醇>丙醇> 苯乙醇>正己醇>正丁醇>正戊醇。

圖2 不同發(fā)酵時期酒醅高級醇含量

通過比較單位發(fā)酵時間內(nèi)高級醇的積累量發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵0～3 d高級醇的變化最大，遠高于其他發(fā)酵階段。發(fā)酵0～3 d、5～7 d和18～24 d是高級醇主要產(chǎn)生的3個階段，其中發(fā)酵0～3 d為高級醇合成主要階段，而發(fā)酵3～5 d和10～15 d為高級醇主要減少的兩個階段(圖3)。苯乙醇在發(fā)酵18～21 d時積累最快，其余高級醇在發(fā)酵前期(0～3 d)積累最快。研究表明固態(tài)發(fā)酵白酒的高級醇含量會隨發(fā)酵時間的增加呈現(xiàn)上升趨勢[12,14-15]。本研究中，高級醇在發(fā)酵0～3 d積累最快，正戊醇、正丁醇和正己醇的含量在發(fā)酵周期內(nèi)含量遠低于其他高級醇，且存在較大波動。白酒釀造中化學(xué)因素(乙醇和還原糖)對微生物的影響較大，而微生物種類和數(shù)量又影響環(huán)境因素的改變[16]。酵母是產(chǎn)高級醇的主要微生物，其豐度隨發(fā)酵發(fā)生改變，并且在清香型白酒中發(fā)現(xiàn)酵母和細菌“二次增長”的現(xiàn)象[17]。因此，高級醇含量隨發(fā)酵進行呈現(xiàn)波動變化，可能與發(fā)酵過程中多種微生物參與和環(huán)境因素有關(guān)。

圖3 單位時間內(nèi)高級醇含量的平均變化

2.2 發(fā)酵過程中氧化還原電位變化

為探究整個發(fā)酵過程中氧化還原狀態(tài)，對整個發(fā)酵過程中氧化還原電位(Eh)的變化進行跟蹤測定，結(jié)果如圖4所示。發(fā)酵0 d時Eh最高(391.50 mV)，發(fā)酵3 d時Eh最低(223.67 mV)，此后隨發(fā)酵進行氧化還原電位不斷增加，并在發(fā)酵24～28 d穩(wěn)定[(350±1) mV]。發(fā)酵0～5 d Eh差異顯著(P<0.05)，發(fā)酵7～21 d、發(fā)酵24～28 d Eh差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵起始時Eh較高，此時氧氣含量較高，隨著發(fā)酵的進行，好氧微生物繁殖使環(huán)境的氧含量下降，使得Eh快速下降，而后隨發(fā)酵進行產(chǎn)生氧化態(tài)物質(zhì)，使得Eh再次升高[18]。

圖4 不同發(fā)酵時期酒醅氧化還原電位變化

微生物合成高級醇的生理功能相關(guān)研究顯示，高級醇可以抑制其他微生物的生長[19]、平衡微生物的氧化還原穩(wěn)定[20]和作為信號物質(zhì)引誘捕食者的作用[21]。其中，維持細胞內(nèi)氧化還原態(tài)的穩(wěn)定性可能是白酒發(fā)酵中微生物合成高級醇的主要目的。由醛生成醇的過程需要輔酶NADH的參與，NADH經(jīng)氧化產(chǎn)生H+和NAD+，H+與醛結(jié)合生成相應(yīng)的高級醇。在有氧條件下有利于NAD+向NADH生成，如NADH可在碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)代謝等途徑中生成，而較高含量的NADH可促進高級醇的生成[13, 22]。發(fā)酵起始Eh值高為微生物生長提供有利環(huán)境，使得酒醅原料得以降解，在碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)代謝等途徑中獲得NADH。因此，在白酒發(fā)酵前期氧氣可能是產(chǎn)生大量高級醇的主要驅(qū)動因素。隨發(fā)酵進行，酒醅中的氧氣被利用，微生物代謝所產(chǎn)生的還原態(tài)物質(zhì)增加，使得Eh下降，高級醇合成速率降低。發(fā)酵后期隨Eh再次升高，并且酵母菌作為優(yōu)勢微生物存在[23]，可能是發(fā)酵后期高級醇含量再次上升的原因。

2.3 發(fā)酵過程中游離氨基酸含量變化

從整個發(fā)酵過程來看，17種游離氨基酸中有16種游離氨基酸的含量在發(fā)酵0～3 d迅速升高(P<0.05)，并隨發(fā)酵進行整體呈現(xiàn)上升趨勢，只有精氨酸(Arg)含量隨發(fā)酵進行下降(圖5)。高級醇合成的前體氨基酸，亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、蘇氨酸(Thr)和異亮氨酸(Ile)在發(fā)酵28 d時含量最高為4.39、4.03、3.09、2.29 mg/100g，但苯丙氨酸(Phe)在發(fā)酵15 d時含量達到最高(3.35 mg/100g)。此外，丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、甘氨酸(Gly)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)和蛋氨酸(Met)含量在發(fā)酵28 d時達到最高，分別為7.53、6.13、5.24、2.35、2.12、1.82、1.56、1.07、0.69 mg/100g。半胱氨酸(Cys)在發(fā)酵10 d時含量最高(0.43 mg/100g)。脯氨酸(Pro)在發(fā)酵18 d時含量最高(4.88 mg/100g)，精氨酸(Arg)在發(fā)酵0 d時含量最高(0.42 mg/100g)。綜上所述，酒醅發(fā)酵過程中游離氨基酸含量隨發(fā)酵進行整體呈現(xiàn)上升趨勢，并且有13種游離氨基酸含量在發(fā)酵28 d達到最高。

a-Thr、Val、Ile、Leu、Phe;b-Glu、Ala、Lys、Pro；c-Asp、Ser、Gly、Cys、Met、Tyr、His、Arg

報道顯示，在白酒發(fā)酵過程中游離氨基酸主要在堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵過程產(chǎn)生，并且大多數(shù)游離氨基酸的含量逐步增加[24]。糖化階段和入池發(fā)酵前期是白酒釀造過程中Tyr和Phe的主要生成階段[25]。對青稞酒和黃酒發(fā)酵過程中游離氨基酸研究表明，其總含量隨發(fā)酵時間的增加而增加[5, 26]。本研究中共有16種游離氨基酸含量隨發(fā)酵時間的增加逐步增加，這與前人的研究結(jié)果類似。發(fā)酵前期微生物大量增殖，蛋白質(zhì)在芽孢桿菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物和酶的作用下水解產(chǎn)生游離氨基酸是造成發(fā)酵前期游離氨基酸含量迅速上升的主要原因[5-6]。

2.4 高級醇和游離氨基酸聚類分析

發(fā)酵過程中高級醇游離氨基酸聚類分析結(jié)果如圖6所示。基于高級醇含量的聚類分析可將發(fā)酵過程分為2個大類(圖6-a)，第1類由發(fā)酵0 d組成，第2類由發(fā)酵3、5、7、10、12、15、18、21、24、28 d組成，這一結(jié)果也進一步說明發(fā)酵前與發(fā)酵后高級醇含量存在顯著不同?；谟坞x氨基酸含量的聚類分析可將發(fā)酵過程分為3個大類(圖6-b)，第1類由發(fā)酵0 d組成，該時間點的游離氨基酸含量最低。第2類由發(fā)酵3、5、7 d組成，該時間段內(nèi)游離氨基酸含量不斷增加，說明隨發(fā)酵進行微生物大量繁殖并代謝產(chǎn)生了游離氨基酸，使得游離氨基酸含量增加。第3類由發(fā)酵10、12、15、18、21、24、28 d組成，該時間段內(nèi)大多數(shù)游離氨基酸含量呈現(xiàn)先降低后升高的規(guī)律。

a-高級醇；b-游離氨基酸

2.5 發(fā)酵過程中游離氨基酸與高級醇的相關(guān)性分析

為進一步明確發(fā)酵過程中高級醇與游離氨基酸之間的關(guān)系，利用Spearman相關(guān)系數(shù)計算發(fā)酵過程中高級醇與游離氨基酸之間的相關(guān)性。部分高級醇與游離氨基酸具有顯著正相關(guān)性(P<0.05)。雖然游離氨基酸與高級醇之間相關(guān)性顯著，但是從相關(guān)系數(shù)看(|r|<0.5)，相關(guān)關(guān)系程度普遍較弱(圖7)。本研究選取具有中等相關(guān)性的(|r|>0.4)高級醇與游離氨基酸進行了進一步的分析。結(jié)果顯示，異戊醇與Gly和Ala，正丁醇與Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Val、Met、Leu、Lys和His，正戊醇與Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Met、Ile、Leu、Lys和His，苯乙醇與Asp、Thr、Ser、Gly、Val、Met、Ile、Leu、Lys和His，丙醇與Cys均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，苯乙醇與Arg呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。

圖7 高級醇與游離氨基酸相關(guān)性分析熱圖

酵母代謝中特定的氨基酸可以通過氨基酸降解代謝途徑形成特定的高級醇，如Thr生成正丙醇、Leu生成異戊醇、Val生成異丁醇、Ile生成活性戊醇(2-甲基丁醇)、Phe生成苯乙醇、Tyr生成酪醇、Trp生成色醇等[2-3]。張文葉等[27]研究表明在山楂酒發(fā)酵中Val、Phe和Leu通過分解代謝生成對應(yīng)高級醇，且Gly可作為異戊醇的前體物質(zhì)在發(fā)酵中使異戊醇含量升高。在黃酒釀造中添加Val增加了異丁醇和異戊醇的含量[9]。在果酒發(fā)酵中，氨基酸在第一階段可被完全消耗掉[28]，但在固態(tài)發(fā)酵白酒中，游離氨基酸逐步產(chǎn)生并且含量隨發(fā)酵的進行而增加[5, 26]。本研究中游離氨基酸含量隨發(fā)酵呈現(xiàn)積累的趨勢，說明有氨基酸源源不斷的產(chǎn)生。因此，可以進一步推斷在后期發(fā)酵過程中，由氨基酸代謝途徑產(chǎn)生高級醇的可能性較大。此外，高粱中Asp、Glu、Pro、Ala、Val、Leu和Phe含量較高[29]，這些都是高級合成的直接前體，且氨基酸間的相互轉(zhuǎn)化也改變氨基酸的種類和含量，這可能是使得非高級醇合成前體氨基酸與高級醇存在相關(guān)性的一個原因。由于白酒發(fā)酵涉及眾多微生物參與，高級醇的代謝更為復(fù)雜多樣，需要進一步利用其他策略深入研究。

3 結(jié)論與討論

高級醇作為酒類中重要的風味物質(zhì)，其形成規(guī)律一直是該領(lǐng)域的研究熱點。由多種微生物參與的傳統(tǒng)白酒發(fā)酵過程中高級醇合成規(guī)律更為復(fù)雜多變。本研究從高級醇合成的環(huán)境條件(氧化還原電位)和物質(zhì)條件(游離氨基酸)兩個角度分析傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵過程中高級醇合成規(guī)律。結(jié)果顯示，高級醇含量在發(fā)酵0～3 d快速升高，并且發(fā)酵0～3 d是高級醇合成的主要階段，但發(fā)酵3～5 d和10～12 d時高級醇含量有所下降。研究表明，高級醇在酶的作用下可轉(zhuǎn)化為醛或酸[30]或與酸類物質(zhì)形成酯類[31]，且乳酸菌能夠降低高級醇的含量[15]。因此，微生物和酶的作用可能使得高級醇含量下降。Eh在發(fā)酵0 d時最高，說明發(fā)酵0 d適合好氧微生物的繁殖代謝。并且有氧條件下有利于環(huán)境中NAD+向NADH轉(zhuǎn)化，較高含量的NADH可促進高級醇的生成，并達到平衡NADH/NAD+比例的目的[13,22]。游離氨基酸含量在發(fā)酵0 d時較低(0～1.8 mg/100g)，隨發(fā)酵進行游離氨基酸逐漸積累。相關(guān)性結(jié)果表明異戊醇、正丁醇、正戊醇、苯乙醇和丙醇均與游離氨基酸呈現(xiàn)顯著相關(guān)。

研究表明高級醇合成途徑與游離氨基酸的含量有關(guān)，當游離氨基酸缺乏時，釀酒酵母主要通過Harris pathway形成高級醇，當游離氨基酸濃度較高，主要通過Ehrlich pathway形成高級醇[7]。而在發(fā)酵0 d Eh值較高，游離氨基酸含量較低。此外，取樣的生產(chǎn)企業(yè)白酒生產(chǎn)工藝中有堆積過程，即在入缸發(fā)酵前低溫大曲與原料混合后堆放一段時間，在這一過程中淀粉開始降解[32]。經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵0 d時還原糖含量為4.21%，高于其他發(fā)酵時間，這為發(fā)酵初始階段由Harris pathway途徑合成高級醇提供有利條件?；谝陨希茰y發(fā)酵初期受氧氣、游離氨基酸的低含量和還原糖的高含量的影響使得高級醇主要通過Harris pathway途徑合成。但白酒發(fā)酵是一個復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化過程，除釀酒酵母以外，其他微生物也具有產(chǎn)高級醇的能力，解析混合微生物發(fā)酵過程中高級醇合成規(guī)律有待進一步深入研究。