么童童,劉偉龍,于文靜,劉翠蘭,石洪堂,劉志強(qiáng)

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 a.婦科;b.醫(yī)學(xué)研究中心,濱州 256603)

子宮內(nèi)膜癌是一種起源于子宮內(nèi)膜上皮組織的惡性腫瘤,在我國(guó)發(fā)病率逐年上升,在歐洲西方國(guó)家居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位,盡管子宮內(nèi)膜癌治療相關(guān)研究取得一定進(jìn)展,但5年生存率未見(jiàn)顯著改善。腫瘤是一種包括多種細(xì)胞類(lèi)型的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng),除腫瘤細(xì)胞外,還包括腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞、微環(huán)境中的生長(zhǎng)因子和代謝物等,它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲能力和藥物反應(yīng)具有深遠(yuǎn)的影響[1]。

傳統(tǒng)的原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法一直廣泛用于子宮內(nèi)膜惡性腫瘤相關(guān)研究,但由于缺乏腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞之間和腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用的準(zhǔn)確描述,且原代細(xì)胞株在傳代過(guò)程中可能發(fā)生突變,難以再現(xiàn)子宮內(nèi)膜惡性腫瘤復(fù)雜的異質(zhì)性,因此這種二維(2d)細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果對(duì)于臨床試驗(yàn)的指示作用備受質(zhì)疑。長(zhǎng)期保存患者樣本的另一種方法是將腫瘤碎片直接接種到免疫缺陷小鼠皮膚或其他部位,由此產(chǎn)生的人源異種移植(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX)模型不僅保留了原始腫瘤的組織學(xué)特征,而且可以類(lèi)似于臨床環(huán)境的方式進(jìn)行藥敏測(cè)試。但由于固有的遺傳差異,PDX不能完全重現(xiàn)人類(lèi)免疫系統(tǒng),不能模擬人類(lèi)對(duì)癌變的特異性反應(yīng)[2]。構(gòu)建PDX模型費(fèi)用高、耗時(shí)長(zhǎng),限制了其大規(guī)模應(yīng)用。隨著免疫治療在腫瘤學(xué)中地位的提升,使用免疫缺陷小鼠構(gòu)建的PDX模型無(wú)法重現(xiàn)人類(lèi)特異性免疫反應(yīng),也無(wú)法在臨床前試驗(yàn)中評(píng)估免疫治療藥物。子宮內(nèi)膜癌研究仍缺乏切實(shí)可靠的組織模型,迫切需開(kāi)發(fā)新型子宮內(nèi)膜癌臨床前模型,以改進(jìn)藥物研發(fā)和藥物反應(yīng)預(yù)測(cè),從而解決不良反應(yīng)率問(wèn)題,提高癌癥患者的生存率[3]。子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官的成功構(gòu)建,使得女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的治療研究有了進(jìn)一步突破。子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官(endometrial carcinoma-derived organoids)是一種多細(xì)胞三維(3d)組織結(jié)構(gòu),是體外特定3d細(xì)胞培養(yǎng)條件下,由子宮內(nèi)膜原發(fā)惡性腫瘤細(xì)胞增殖形成的類(lèi)器官臨床前研究模型。類(lèi)器官技術(shù)提供了更準(zhǔn)確有效的腫瘤異質(zhì)性表達(dá)組織,兼顧了腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用,已成為橋接傳統(tǒng)2d細(xì)胞培養(yǎng)和組織功能模型之間差距的潛在工具。由于3d系統(tǒng)支持健康上皮細(xì)胞的生長(zhǎng),因此類(lèi)器官模型提供了其他腫瘤衍生模型系統(tǒng)所沒(méi)有的優(yōu)勢(shì)——適合研究腫瘤發(fā)展的早期階段[4]。此外,出于與動(dòng)物模型相關(guān)的倫理考慮,類(lèi)器官模型的實(shí)踐更被視為是一種優(yōu)勢(shì)[5]。本文將就近幾年來(lái)子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官的培養(yǎng)進(jìn)展、類(lèi)器官在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制以及藥物篩選和精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用研究進(jìn)行總結(jié)概述,進(jìn)一步分析類(lèi)器官在婦科腫瘤研究方面的局限性和發(fā)展前景。

1 子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官的培養(yǎng)進(jìn)展

腫瘤類(lèi)器官的細(xì)胞大部分來(lái)源于患者體內(nèi)切除的腫瘤組織,利用Matrigel作為細(xì)胞外基質(zhì),構(gòu)建更接近人體系統(tǒng)的腫瘤微環(huán)境。既往文獻(xiàn)表明,類(lèi)器官培養(yǎng)是一種可持續(xù)發(fā)展技術(shù),在體外條件下允許基于Matrigel基質(zhì)膠的培養(yǎng)物無(wú)限增殖細(xì)胞[6]。Jamaluddin等[7]以子宮內(nèi)膜水凝膠優(yōu)化了子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官的培養(yǎng)。

患者源性腫瘤類(lèi)器官培養(yǎng)在食管癌、胃癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌等多種類(lèi)型惡性腫瘤中已普遍應(yīng)用[8-9],但在婦科腫瘤中的應(yīng)用尚處于起步階段,該培養(yǎng)方案在子宮內(nèi)膜癌中的有效性仍有待確定?；谄渌?lèi)型惡性腫瘤類(lèi)器官培養(yǎng)方案,Maru等開(kāi)發(fā)了一種有效的子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官培養(yǎng)方法——基質(zhì)凝膠雙層類(lèi)器官培養(yǎng)[10],即先將癌細(xì)胞在固化的Matrigel上過(guò)夜孵育,次日再用Matrigel覆蓋活細(xì)胞,子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官培養(yǎng)成功率為100%(4/4)。Boretto等[11]發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官時(shí),調(diào)整介質(zhì)成分有利于長(zhǎng)期增殖。Tumara等[12]使用離心后的癌性腹水作為濃縮的腫瘤細(xì)胞,在一定程度上保留了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所需的微環(huán)境。Wu等[13]利用從癌灶中提取的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)作為腫瘤基質(zhì)的主要成分。

子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官培養(yǎng)過(guò)程中,Boretto等發(fā)現(xiàn)高級(jí)別類(lèi)器官形態(tài)通常表現(xiàn)為致密、無(wú)可見(jiàn)管腔,原位植入小鼠可產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)移性、侵襲性強(qiáng)的原發(fā)性腫瘤,而低級(jí)別類(lèi)器官通常表現(xiàn)為腺樣形態(tài),管腔清晰至中等,植入小鼠體內(nèi)后形成符合子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展的局部腫瘤[11]。這證明在類(lèi)器官中,癌癥分級(jí)與細(xì)胞異質(zhì)性息息相關(guān),子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官成功再現(xiàn)了原發(fā)腫瘤的組織學(xué)和異質(zhì)性,保留了遺傳和分子特征。子宮內(nèi)膜癌的病理分型包括子宮內(nèi)膜樣癌、鱗狀細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌、漿液性、黏液性、未分化型癌、癌肉瘤等[14],從高分化到低分化不同病理類(lèi)型的子宮內(nèi)膜癌中培養(yǎng)類(lèi)器官[11],這對(duì)于生存率低、預(yù)后差的低分化子宮內(nèi)膜癌至關(guān)重要。

2 類(lèi)器官在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制中的研究

基因突變、組蛋白修飾和DNA甲基化是人類(lèi)子宮內(nèi)膜癌病理學(xué)分子改變的基礎(chǔ)。已知的發(fā)生于子宮內(nèi)膜癌中的常見(jiàn)突變基因有TP53、PTEN、PIK3CA、FBXW7和KRAS。根據(jù)臨床、病理和分子特征,子宮內(nèi)膜癌曾被分為兩大類(lèi):I型雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜樣腺癌占80%,而II型腫瘤為非雌激素依賴(lài)型,包括漿液性癌、透明細(xì)胞癌和癌肉瘤[3]。Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌與PTEN、KRAS和PIK3CA突變有關(guān),Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌通常顯示TP53和HER-2擴(kuò)增。診斷分期和組織學(xué)亞型是風(fēng)險(xiǎn)分類(lèi)的主要決定因素,并指導(dǎo)輔助化療和放療的應(yīng)用[15]。然而,子宮內(nèi)膜癌往往是異質(zhì)性的,可能同時(shí)包含Ⅰ型和Ⅱ型分子表型,從而限制了二元分類(lèi)的應(yīng)用。Kandoth等對(duì)373例子宮內(nèi)膜癌的TCGA(癌癥基因組圖譜)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,將子宮內(nèi)膜癌基因組重新分類(lèi)為四類(lèi):超突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型、低拷貝數(shù)型、高拷貝數(shù)型。研究表明,25%的高級(jí)別子宮內(nèi)膜樣癌表現(xiàn)出類(lèi)似于漿液性癌的分子表型[16],因此,分子分型使我們對(duì)腫瘤的異質(zhì)性有了更清晰的認(rèn)識(shí),也更利于患者的個(gè)體化治療。

Maru團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)了15例卵巢癌類(lèi)器官和6例子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官(其中5例病理類(lèi)型為子宮內(nèi)膜樣癌,1例透明細(xì)胞癌)[17],對(duì)基因組分析發(fā)現(xiàn)TP53和PTEN基因的突變率從原發(fā)腫瘤中的70%增加到類(lèi)器官中的近100%,表明基因的雜合性缺失和點(diǎn)突變是腫瘤中大多數(shù)癌細(xì)胞共有的原始突變,這些癌細(xì)胞在類(lèi)器官中富集。相比之下,類(lèi)器官中NF1基因的突變率較原發(fā)腫瘤從13%顯著增加到95%,ARID1A基因的突變率從77%增加到81%,提示類(lèi)器官培養(yǎng)期間存在腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性和克隆選擇。這項(xiàng)研究表明腫瘤衍生類(lèi)器官保留了子宮內(nèi)膜癌原始腫瘤的組織學(xué)和遺傳學(xué)特征以及腫瘤內(nèi)異質(zhì)性,有助于深入了解婦科腫瘤的發(fā)病機(jī)制。

上述研究表明患者來(lái)源類(lèi)器官培養(yǎng)物與原發(fā)腫瘤非常相似,子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官再現(xiàn)原發(fā)腫瘤的突變情況,并揭示疾病特異性基因表達(dá),是體外腫瘤培養(yǎng)更有效的替代物。類(lèi)器官有望成為廣泛認(rèn)可的女性生殖系統(tǒng)腫瘤研究模型。應(yīng)用類(lèi)器官可更好地探究婦科惡性腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制,并更精準(zhǔn)有效地治療相關(guān)疾病。

3 類(lèi)器官在藥物篩選及個(gè)性化治療中的應(yīng)用

近年來(lái),精準(zhǔn)診療在子宮內(nèi)膜癌領(lǐng)域進(jìn)展迅速,高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展加深了我們對(duì)子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制和分子遺傳特征的理解,分子分型檢測(cè)、靶向治療、免疫治療的應(yīng)用逐漸廣泛[11],高通量測(cè)序可在廣泛的癌癥類(lèi)型中生成大型數(shù)據(jù)庫(kù),利用這個(gè)不斷擴(kuò)展的數(shù)據(jù)庫(kù),我們能將復(fù)雜的腫瘤基因組學(xué)與治療反應(yīng)聯(lián)系起來(lái),并為個(gè)性化腫瘤學(xué)提供一個(gè)平臺(tái),提供對(duì)癌癥基因組景觀的見(jiàn)解,并確定新的潛在治療靶點(diǎn)。

3.1 一線藥物篩選 研究表明,類(lèi)器官基本上保留了原發(fā)腫瘤的組織學(xué)和遺傳學(xué)特征以及腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性,因此可以確定治療靶點(diǎn),從而能正確評(píng)估藥物毒性,確定殺滅腫瘤細(xì)胞的最佳劑量,同時(shí)減少對(duì)正常組織造成的損害[18]。子宮內(nèi)膜癌的臨床前藥物篩選研究已使用子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官作為個(gè)性化醫(yī)療決策的工具來(lái)預(yù)測(cè)患者對(duì)治療方案的反應(yīng)結(jié)果。Girda等成功從子宮內(nèi)膜腫瘤中培養(yǎng)出患者源性類(lèi)器官,以進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)[19],證明紫杉醇、TK1(酪氨酸激酶)抑制劑和STAT3(信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子)抑制劑對(duì)子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官的生長(zhǎng)抑制作用。

此外,Chen等開(kāi)發(fā)了大規(guī)模敏感性分析,用276種分子靶向化合物進(jìn)行藥物篩選[20],發(fā)現(xiàn)MI-136是一種針對(duì)menin-MLL復(fù)合物的有效子宮內(nèi)膜癌抑制劑。首先對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜癌的腫瘤類(lèi)器官進(jìn)行無(wú)偏藥物篩選,通過(guò)調(diào)節(jié)HIF通路確定MI-136是一種潛在的子宮內(nèi)膜癌抑制劑,這是一種不同于治療急性髓性白血病和前列腺癌的新機(jī)制。此外,該研究成功培養(yǎng)了4例源自患者的原發(fā)性子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官,發(fā)現(xiàn)MI-136顯著抑制了類(lèi)器官的生長(zhǎng)。需進(jìn)一步進(jìn)行臨床驗(yàn)證以關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)。

Tamura等選擇對(duì)子宮內(nèi)膜癌標(biāo)準(zhǔn)治療藥物(紫杉醇和卡鉑)具有較高耐藥性的患者,建立相應(yīng)類(lèi)器官模型[12],驗(yàn)證了硼替佐米、卡非佐米、地那昔布和帕諾比諾司他對(duì)該類(lèi)型腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖具有顯著抑制作用,這些抗癌藥物可能是開(kāi)發(fā)子宮內(nèi)膜癌治療新方案的候選藥物。通過(guò)對(duì)原發(fā)腫瘤與類(lèi)器官的基因表達(dá)譜分析,實(shí)驗(yàn)顯示類(lèi)器官的基因表達(dá)與原發(fā)腫瘤相似,再將類(lèi)器官植入小鼠體內(nèi),異種移植物的基因表達(dá)譜與其原發(fā)腫瘤的基因表達(dá)譜也相似,證明類(lèi)器官的特征概括了來(lái)源腫瘤組織的組織結(jié)構(gòu)和表達(dá)譜,在免疫缺陷小鼠中移植后仍長(zhǎng)期存在。因此類(lèi)器官可被穩(wěn)定且持續(xù)地用于臨床條件下評(píng)估抗癌藥物療效,適合進(jìn)行高通量藥物篩選。

3.2 激素治療 Girda等[19]發(fā)現(xiàn),富維司坦(雌激素受體抑制劑)可抑制7種PDO培養(yǎng)物中的4種,這提示雌、孕激素在類(lèi)器官形成和(或)生長(zhǎng)中的重要性,可利用類(lèi)器官增殖情況評(píng)估其對(duì)雌二醇或雌激素受體信號(hào)的依賴(lài)性。既往研究表明,子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的孕激素效應(yīng)是由子宮內(nèi)膜基質(zhì)成分的旁分泌信號(hào)介導(dǎo)的,因此類(lèi)器官微環(huán)境的發(fā)展對(duì)于雌/孕激素相關(guān)藥物作用研究至關(guān)重要。

3.3 免疫治療 個(gè)性化高通量藥物篩選結(jié)合患者源性腫瘤樣本的基因組分析,可為個(gè)體患者分層和確定有效的癌癥治療方案,并可能有助于發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)抗癌藥物藥理作用的標(biāo)記物。然而,來(lái)源于上皮細(xì)胞的腫瘤類(lèi)器官可能無(wú)法識(shí)別靶向腫瘤-基質(zhì)相互作用的藥物,如腫瘤血管生長(zhǎng)因子抑制劑。迄今為止,類(lèi)器官模型未能完全捕獲影響藥物敏感性和耐藥性的腫瘤-基質(zhì)相互作用,這提示免疫腫瘤學(xué)的開(kāi)發(fā)依賴(lài)于類(lèi)器官的升級(jí)。

4 子宮內(nèi)膜癌類(lèi)器官的局限性

4.1 腫瘤微環(huán)境 類(lèi)器官技術(shù)彌補(bǔ)了細(xì)胞系和異種移植模型的部分不足,但目前系統(tǒng)仍存在局限性。當(dāng)前類(lèi)器官技術(shù)的主要局限性之一是缺乏真實(shí)的體內(nèi)微環(huán)境,腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)包括血管結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)和免疫細(xì)胞成分[21]。如Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌表現(xiàn)為高度雌激素依賴(lài)性,缺乏TME無(wú)法全面評(píng)價(jià)內(nèi)分泌治療、免疫治療和抗血管生成藥物療效,因此保護(hù)原始患者特異性腫瘤和相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞的空間分布至關(guān)重要,這些相互作用影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化、信號(hào)傳導(dǎo)以及對(duì)化療藥物的耐藥性。

4.2 異質(zhì)性 腫瘤的一部分衍生的類(lèi)器官與該特定腫瘤區(qū)域的基因組圖譜正好匹配,并不代表整個(gè)腫瘤的基因組圖譜。因此,體外腫瘤類(lèi)器官檢測(cè)應(yīng)考慮腫瘤的空間異質(zhì)性。目前類(lèi)器官培養(yǎng)方案的主要限制是無(wú)法放棄動(dòng)物源性基質(zhì)凝膠或膠原蛋白。這些細(xì)胞外基質(zhì)含有未知的細(xì)胞外成分,可能會(huì)意外地改變空間異質(zhì)性,從而影響細(xì)胞行為。

國(guó)際上對(duì)類(lèi)有機(jī)物的研究已將微流控技術(shù)和organon-a-chip技術(shù)應(yīng)用于藥物篩選[22],試圖克服類(lèi)器官培養(yǎng)的缺點(diǎn)。微流控細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已產(chǎn)生了3D培養(yǎng)設(shè)備,這些設(shè)備現(xiàn)在適用于基于球體的類(lèi)器官培養(yǎng),并已被用于體外模擬器官微環(huán)境[23]。這項(xiàng)技術(shù)提供了精確控制微尺度以模擬生理?xiàng)l件和高通量方法的可能性,肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等患者來(lái)源的類(lèi)器官可在1～2周內(nèi)生成和應(yīng)用[24]。此外,芯片上器官[25]已被應(yīng)用于類(lèi)器官,以實(shí)現(xiàn)更接近體內(nèi)組織狀態(tài)的生理或病理模型系統(tǒng),子宮內(nèi)膜癌尚無(wú)應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)的報(bào)道。研究人員致力于制定改進(jìn)的長(zhǎng)期培養(yǎng)方案,包括周?chē)哪[瘤微環(huán)境,以更好地再現(xiàn)原發(fā)腫瘤。在未來(lái)幾年中,罕見(jiàn)的陰道癌和外陰癌也需要類(lèi)似的模型來(lái)改善生存率。

5 總結(jié)與展望

類(lèi)器官保留了原始腫瘤的許多方面,包括組織學(xué)特征、突變譜和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性,表現(xiàn)出強(qiáng)大的可擴(kuò)展性,突破了原始活檢數(shù)量的限制,從而允許基于個(gè)體化治療決策的基因組和功能研究,創(chuàng)建臨床前腫瘤模型和精準(zhǔn)醫(yī)療的未來(lái)視角,用于了解女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生的機(jī)制、抗癌藥物篩選和個(gè)性化藥物,真正為個(gè)體化治療和精準(zhǔn)醫(yī)療服務(wù)。盡管類(lèi)器官是具有廣泛潛在應(yīng)用的生物系統(tǒng),但仍需要更多的努力來(lái)規(guī)范培養(yǎng)方案,并監(jiān)測(cè)長(zhǎng)期培養(yǎng)后的腫瘤異質(zhì)性,這可能會(huì)直接影響藥物篩選結(jié)果。類(lèi)器官技術(shù)的未來(lái)進(jìn)展預(yù)計(jì)將構(gòu)建一個(gè)全面的癌癥模型系統(tǒng),該系統(tǒng)通過(guò)整合腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞、血管和免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)以及腫瘤微環(huán)境來(lái)重現(xiàn)生理?xiàng)l件。這個(gè)強(qiáng)大的模型將為生物標(biāo)志物研究、藥物篩選和更準(zhǔn)確的治療效果預(yù)測(cè)提供強(qiáng)有力的工具,并最終為人類(lèi)健康事業(yè)服務(wù)。