薛 冰

（ 遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧 遼陽(yáng) 111000 ）

絨山羊胚胎移植技術(shù)也稱受精卵移植，是對(duì)遺傳性能和生產(chǎn)性能優(yōu)良的母羊進(jìn)行超數(shù)排卵、人工授精，將早期的胚胎從供體母羊體內(nèi)取出，移植到生理狀態(tài)相同的受體母羊子宮內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成優(yōu)良后代的技術(shù)[1]。絨山羊胚胎移植技術(shù)可充分發(fā)揮優(yōu)良母羊的繁殖潛力，提高繁殖效率、縮短世代間隔、提高生產(chǎn)效率，對(duì)絨山羊的生產(chǎn)實(shí)踐具有十分重要的意義[2]。但在胚胎移植的過(guò)程中存在多種內(nèi)在或外在的因素會(huì)對(duì)胚胎移植的效果產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響最終的移植效率。本文擬從激素和相關(guān)材料選擇、超數(shù)排卵、人工授精、技術(shù)水平、受體羊發(fā)情狀況、供受體羊移植后飼養(yǎng)管理及胚胎質(zhì)量、不同季節(jié)等方面分析影響絨山羊胚胎移植的因素，為獲得滿意的胚胎移植效果及相關(guān)工作開(kāi)展提供參考。

1 材料因素

1.1 激素

進(jìn)行超數(shù)排卵處理時(shí)，供體母羊的年齡、子宮內(nèi)環(huán)境、胎次、體重、營(yíng)養(yǎng)水平等因素均會(huì)對(duì)激素的使用劑量產(chǎn)生影響[3]。激素的種類、貯存、注射方法和部位等因素也會(huì)對(duì)超排效果產(chǎn)生影響，經(jīng)產(chǎn)絨山羊和初產(chǎn)絨山羊使用的激素劑量也應(yīng)不同。確定激素劑量時(shí)，體重和體況等也是應(yīng)充分考慮的因素。此外，不同生產(chǎn)廠家、時(shí)間、批次的藥品性能也存在一定的差異，必要時(shí)在使用前需經(jīng)過(guò)藥品試驗(yàn)[4]。

1.2 試劑

胚胎移植過(guò)程中培養(yǎng)液的制備至關(guān)重要。培養(yǎng)液的主要成分是水（應(yīng)使用無(wú)菌的超純水）和血清，超純水使用超純水儀制備，儀器型號(hào)pulsel+pURELABFlex，超純水電阻率一般應(yīng)大于10 MΩ，優(yōu)質(zhì)超純水應(yīng)達(dá)18.25 MΩ。血清的組成比較復(fù)雜，使用前要對(duì)購(gòu)買的血清進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證是否符合處理要求[5]。培養(yǎng)液還需檢測(cè)pH值、滲透壓和毒性。其他的試劑和藥品要嚴(yán)格分區(qū)貯存和放置，配置溶液時(shí)要保持無(wú)菌，精確稱量，貼好標(biāo)簽并做好儲(chǔ)藏。

1.3 設(shè)備與耗材

使用儀器一般包括：體式顯微鏡、羊?qū)Ｓ酶骨荤R、水浴鍋、加熱板、集卵杯、35 mm培養(yǎng)皿、二路式?jīng)_胚管、巴氏玻璃管、套管針、0.22 μm 濾器、微量移液槍（1 mL 和200 μL）、槍頭（1 mL 和200 μL）、酒精燈、75%酒精、95%酒精、面巾紙、方瓷盤、記號(hào)筆、記錄本等[6]。設(shè)備和耗材使用時(shí)要注意無(wú)菌操作[7]，實(shí)驗(yàn)室保持整潔、干凈、無(wú)菌，制備溶液時(shí)要做好玻璃容器的清潔和無(wú)菌處理。

2 處理因素

2.1 超數(shù)排卵

超數(shù)排卵是絨山羊胚胎移植首要的基本措施，適宜的季節(jié)為9 月下旬至11 月上旬[8]，供體母羊在超數(shù)排卵前需要觀察1~2個(gè)完整的發(fā)情周期，并做好記錄。超排藥物使用進(jìn)口促卵泡激素（FSH），以加拿大產(chǎn)的FOLLTROPIN—V（20 mL/瓶）為首選，一般使用劑量為8 mL，效果比較穩(wěn)定。目前，同期發(fā)情處理主要使用陰道內(nèi)放置孕酮栓（CIDR）法，以新西蘭產(chǎn)的效果最好[9]，操作方法簡(jiǎn)單，是目前主要的同期發(fā)情處理方法。供受體同一天放栓，之后每天到羊舍觀察是否有栓脫落并及時(shí)補(bǔ)放。對(duì)供、受體羊進(jìn)行處理時(shí)，應(yīng)注意以下兩方面的問(wèn)題：

（1）目前使用低劑量超排要保證沖胚數(shù)量多、質(zhì)量好、妊娠率高[10]。超排前應(yīng)仔細(xì)閱讀藥品說(shuō)明書，稀釋FSH時(shí)，使用一次性無(wú)菌注射器精確量出20 mL 稀釋液，稀釋時(shí)針尖對(duì)準(zhǔn)瓶壁，不要沖出泡沫或?yàn)⒊鲆后w。稀釋后的藥品必須保存在4 ℃的冰箱內(nèi)，最好是現(xiàn)用現(xiàn)配。進(jìn)行超排注射時(shí)，注射位置選在臀部三角肌部位，早上打左邊，晚上打右邊。超排打針最忌打飛針，必須深部肌肉注射；打針時(shí)必須有記錄，以免重復(fù)注射。對(duì)超排時(shí)的天氣及溫度變化也要記錄詳盡，積累相關(guān)資料。

（2）選擇譜系清楚、檢疫合格、遺傳性能穩(wěn)定、生產(chǎn)性能優(yōu)良、精液品質(zhì)良好的公羊，采取本交和人工授精。本交是經(jīng)試情的母羊發(fā)情后與種公羊混圈，觀察到首次配種后同圈超過(guò)24 h、配種比例在1∶2 之內(nèi)以保證有效配種。種公羊數(shù)量不足或依照選配計(jì)劃通常采用人工授精方式。

2.2 人工授精

種公羊精液的品質(zhì)是提高絨山羊胚胎移植成功率的前提，可保障提供足量的合格胚胎。公羊應(yīng)具有較高的育種價(jià)值和優(yōu)良的遺傳特性，檢查未患有布氏桿菌病、結(jié)核、副結(jié)核等疾病，生殖系統(tǒng)功能正常，身體狀況良好，精液品質(zhì)好，膘情適中。成年產(chǎn)絨量應(yīng)達(dá)1 500 g以上，經(jīng)后裔測(cè)定具有穩(wěn)定的遺傳特性，精液品質(zhì)良好，活力達(dá)0.7以上。

精液品質(zhì)的優(yōu)劣是提高絨山羊受胎率的關(guān)鍵。常溫人工授精實(shí)際操作中要求精子活力在0.7 以上，每次輸精有效精子數(shù)不少于30×106。精液檢查必須在37 ℃的環(huán)境中進(jìn)行，否則精子運(yùn)動(dòng)遲緩，影響檢查結(jié)果。精液采集后，越快稀釋越好，否則精子會(huì)因缺乏營(yíng)養(yǎng)而死亡，稀釋后的精液要保持在25~30 ℃的環(huán)境中。采精前對(duì)公羊外生殖器、采精、稀釋、輸精用器皿嚴(yán)格消毒，配種時(shí)對(duì)母羊外陰部要嚴(yán)格消毒，一只羊用一個(gè)開(kāi)膣器，避免重復(fù)使用。輸精次數(shù)不少于3次，絨山羊最好隔6 h輸精一次，超排后的供體第二次配種最重要。授精前要檢查精液的品質(zhì)，對(duì)精子的活力進(jìn)行鑒定，以保證較高的受精率。影響受精的因素有很多，包括輸精時(shí)間、部位、次數(shù)、精液質(zhì)量及活力等。為保證輸精的成功率應(yīng)在上、下午各輸精1次，間隔8~12 h為宜，第2 d若母羊繼續(xù)發(fā)情應(yīng)再輸精1次直至停止發(fā)情。

2.3 技術(shù)水平

供體的采胚均采用手術(shù)法，分為2~4細(xì)胞期和桑囊期；受體母羊進(jìn)行胚胎移植現(xiàn)主要采用手術(shù)法和非手術(shù)法兩種方式[11]。手術(shù)法是在腹部作一切口，找到輸卵管和子宮角引出切口外，用注射器將沖洗液注入輸卵管或子宮，另一方向用試管或表皿接取沖洗液。但會(huì)使子宮、輸卵管和卵巢暴露于體外，易發(fā)生出血或粘連現(xiàn)象[12]，這也是影響胚胎移植成功率的一個(gè)制約因素[13]。非手術(shù)的內(nèi)窺鏡法在腹部的開(kāi)口小，子宮、輸卵管和卵巢不會(huì)全部暴露，不會(huì)引起子宮粘連，也可減少手術(shù)損傷[14]，而且對(duì)子宮體結(jié)合部位的組織牽引較輕微，對(duì)胚胎發(fā)育和著床影響甚微，與手術(shù)法相比可顯著提高受胎率[11]。目前，為重復(fù)使用受體羊，避免造成受體羊子宮粘連，加快手術(shù)時(shí)間，已放棄手術(shù)法移植，而逐步采用非手術(shù)法移植，即利用腹腔內(nèi)窺鏡與子宮鉗的配合，無(wú)需切開(kāi)腹腔進(jìn)行移植的方法。此外，操作者的技術(shù)水平也至關(guān)重要[15]，需熟練掌握整個(gè)手術(shù)過(guò)程，還應(yīng)具有嚴(yán)格的無(wú)菌意識(shí)，將對(duì)羊的傷害降到最小。

3 母體因素

3.1 供體羊

供體絨山羊母羊品質(zhì)是胚胎移植能否成功一個(gè)非常重要的因素[16]，應(yīng)具備遺傳優(yōu)勢(shì)、育種價(jià)值。供體母羊生產(chǎn)性能優(yōu)異，產(chǎn)絨量高，遺傳性能穩(wěn)定；體質(zhì)健康，體況適中，發(fā)情周期和生殖功能均正常，無(wú)生殖系統(tǒng)疾病。選擇2~5 周歲的經(jīng)產(chǎn)母羊?yàn)橐?，系譜要記錄準(zhǔn)確、膘情適中，最好連續(xù)觀察2個(gè)正常發(fā)情周期以上。常規(guī)要求是在超排處理前15 d 內(nèi)不進(jìn)行免疫，單獨(dú)組群飼養(yǎng)，避免發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)[6]。在日常生產(chǎn)中，為充分利用種質(zhì)資源，沒(méi)有繁殖問(wèn)題的老齡優(yōu)質(zhì)母羊在淘汰前可作為供體進(jìn)行超排，雖超排效果略差，但從胚胎利用方面考慮相對(duì)合算。

3.2 受體羊

受體絨山羊發(fā)情周期和繁殖性能正常[5]，體型中上等，體質(zhì)良好，母性和泌乳性能好，對(duì)化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)敏感，年齡2~5 周歲，且健康無(wú)傳染性疾病，體況良好，以經(jīng)產(chǎn)母羊?yàn)橐恕＿B續(xù)觀察到2個(gè)以上的正常發(fā)情，同期發(fā)情處理前不做免疫和應(yīng)激處理，盡量單獨(dú)飼養(yǎng)。切勿將體況差的母羊列為受體羊，因?yàn)榻?jīng)過(guò)同期發(fā)情處理、移植手術(shù)后，母羊的受胎率低，且易出現(xiàn)流產(chǎn)，影響生產(chǎn)效率。

3.3 供、受體羊前期飼養(yǎng)管理

供體羊與受體羊處理前1 個(gè)月內(nèi)，可按飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)投喂飼料，最好補(bǔ)飼胡蘿卜避免應(yīng)激[5]。供體羊在采卵前應(yīng)保證良好的飼養(yǎng)條件[17]，粗飼料以優(yōu)質(zhì)苜蓿草為主，同時(shí)補(bǔ)充高蛋白飼料、維生素和礦物質(zhì)（可放置舔磚），并供給清潔的飲水及鹽。圈舍應(yīng)衛(wèi)生、干燥、溫度適宜，避免造成應(yīng)激反應(yīng)[18]。受體羊除保證常規(guī)的飼養(yǎng)方法外，術(shù)前應(yīng)提前補(bǔ)飼充足的維生素及微量元素，保證良好的體況[19]。此外，供體和受體羊的同期發(fā)情水平也是影響胚胎移植的關(guān)鍵因素。同期發(fā)情是使供受體羊排卵同期化[20]，同期化程度越高，移植的成功率越高[21]。通常在供受體羊開(kāi)始同期發(fā)情處理時(shí)肌注維生素A、維生素D、維生素E 注射液，以保證每只羊充分獲得所需的維生素。

3.4 受體羊的發(fā)情狀況

制定移植計(jì)劃時(shí)，供受體羊的配比通常約1∶4[22]，因供體在超排激素待誘導(dǎo)下，通常可達(dá)到適宜的排卵效果。受體羊的發(fā)情與供體羊的同步率將直接影響移植效率。受體羊的發(fā)情鑒定以穩(wěn)定接受試情公羊爬跨為準(zhǔn)，并記錄發(fā)情時(shí)間。此外，發(fā)情的受體母羊被挑出后，其他母羊需早、中、晚共3次試情，以利于及時(shí)篩出發(fā)情羊與供體羊匹配。

3.5 供、受體羊移植后飼養(yǎng)管理

移植后應(yīng)注重營(yíng)養(yǎng)全面供給，制定合理的飼料配方，尤其注重蛋白質(zhì)需求，加強(qiáng)蛋白質(zhì)供應(yīng)[23]，保證胚胎著床和充分發(fā)育。術(shù)后受體羊應(yīng)選擇衛(wèi)生條件比較好的圈舍，生活環(huán)境安靜、溫度適宜，最好單獨(dú)飼養(yǎng)，避免一些不良因素刺激引發(fā)流產(chǎn)[24]。供、受體羊術(shù)后觀察24 h后方可跟群放牧，須仔細(xì)觀察羊，若出現(xiàn)臥地不起、弓腰努責(zé)或不進(jìn)食不排糞的現(xiàn)象應(yīng)及時(shí)處理。術(shù)后不要立即飼喂精料，只喂新鮮干草及清潔的飲水，最好是加鹽的溫水[25]。術(shù)后1 周內(nèi)，恢復(fù)術(shù)前常規(guī)精料飼喂量，移入胚胎的受體羊應(yīng)繼續(xù)喂胡蘿卜，補(bǔ)充足夠的維生素，滿足母體及胎兒的需要。

受體羊術(shù)后1~2個(gè)情期內(nèi)應(yīng)專人觀察返情情況，若返情則應(yīng)進(jìn)行配種或列為下一次移植對(duì)象。未返情的羊應(yīng)防止發(fā)生爭(zhēng)斗，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，注意滿足蛋白質(zhì)的補(bǔ)充。妊娠的中后期注意全面加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，以滿足胚胎快速發(fā)育的需求。大量研究表明，受體羊攝入維生素不足時(shí)會(huì)對(duì)前期的胚胎著床造成不利影響，顯著影響受體羊胚胎移植的效果，甚至?xí)?duì)產(chǎn)后羔羊的生長(zhǎng)造成負(fù)面影響[12]。因此為保證較好的移植效果，必須要做好受體羊的飼養(yǎng)管理。

4 其他因素

4.1 胚胎因素

母羊受精后要對(duì)胚胎進(jìn)行收集。胚胎活力會(huì)受到物理、化學(xué)和微生物等因素的影響，因此應(yīng)對(duì)收集到的胚胎進(jìn)行檢查，篩出合格的具有發(fā)育能力的胚胎用于移植[26]。結(jié)合胚胎的發(fā)育狀態(tài)進(jìn)行分級(jí)，選擇進(jìn)行移植或保存。一般胚胎可分為4 個(gè)等級(jí)[27]，1 級(jí)胚胎即為優(yōu)秀胚，發(fā)育正常，胚齡與發(fā)育階段吻合，卵裂球輪廓清楚，細(xì)胞團(tuán)發(fā)育良好，細(xì)胞變性率不超過(guò)10%；2 級(jí)胚胎即為良好胚，發(fā)育基本符合預(yù)定胚齡，輪廓清楚，明暗適中或稍暗、稍淺，細(xì)胞密度較小或小型卵裂球過(guò)多，有小部分突出細(xì)胞和水樣細(xì)胞，細(xì)胞變性率為10~20%；3級(jí)胚胎即為一般胚，輪廓不清晰，色澤過(guò)暗或過(guò)淡，細(xì)胞密度小，突出細(xì)胞占一半多，細(xì)胞變性率為30~40%；4 級(jí)胚胎即為不可用胚，指未受精卵和變形卵。1、2級(jí)胚胎可用于冷凍，3級(jí)可用于鮮胚移植。

4.2 季節(jié)因素

絨山羊的發(fā)情受光照和溫度影響，繁殖季節(jié)主要是集中在秋季，季節(jié)性明顯[28]。楊舁等[29]研究對(duì)不同季節(jié)受體母羊的妊娠率進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在10 月至12 月妊娠率最高。因此，為提高絨山羊胚胎移植的受胎率，胚胎移植的日程盡量選在秋冬兩季進(jìn)行，早春次之，夏季最差。母羊卵巢在繁殖季節(jié)處于活動(dòng)狀態(tài)，卵泡才能夠發(fā)育、成熟，羊表現(xiàn)出正常發(fā)情[30]。因此，絨山羊的胚胎移植時(shí)間應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)氐墓庹蘸蜏囟燃把虻陌l(fā)情狀況選擇。此外，溫度過(guò)高會(huì)對(duì)母羊卵子的發(fā)育、受精、胚胎發(fā)育和著床產(chǎn)生影響，因此秋季到初春這段時(shí)間最合適[5]。而嚴(yán)寒、酷熱均會(huì)對(duì)羊造成應(yīng)激，這些生理上的不良影響會(huì)作用于生殖內(nèi)分泌軸，從而影響發(fā)情和排卵。

5 展望

胚胎移植是羊繁殖領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)，是體外受精、幼齡母羊早期利用（JIVET）、核移植（克?。⑥D(zhuǎn)基因等技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)，也是胚胎工程技術(shù)中的最基本技能操作。通過(guò)胚胎移植技術(shù)可充分發(fā)揮優(yōu)質(zhì)絨山羊母羊的繁殖潛力，經(jīng)超數(shù)排卵生產(chǎn)更多的優(yōu)良母羊后代，縮短母羊的繁殖周期，盡早開(kāi)展后裔生產(chǎn)性能測(cè)定、評(píng)價(jià)種公羊的種用價(jià)值，經(jīng)增強(qiáng)選擇強(qiáng)度縮短育種進(jìn)程。此外，胚胎移植能夠使優(yōu)良不孕的母羊生產(chǎn)后代，對(duì)于存在內(nèi)分泌缺陷或生殖系統(tǒng)障礙的優(yōu)良母羊則可通過(guò)胚胎移植發(fā)揮優(yōu)良種質(zhì)作用。

絨山羊的胚胎移植技術(shù)在一些規(guī)模絨山羊場(chǎng)的生產(chǎn)實(shí)踐中已有一定的應(yīng)用和推廣，但受絨山羊種羊價(jià)格的影響尚未達(dá)到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用階段。目前，胚胎移植過(guò)程中受到各種因素的影響，絨山羊移植后的受胎率略低于綿羊。隨著對(duì)上述多種影響因素進(jìn)行深入的研究和探索，胚胎移植技術(shù)未來(lái)能夠在絨山羊的生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)揮作用。