康助習(xí) 匡 黎 郭 俊 權(quán)瑞泉 魏 英

國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院腫瘤科 (湖北 十堰，442000)

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，主要病因是肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞發(fā)生癌變，惡性程度及轉(zhuǎn)移率較高[1，2]。原發(fā)性肝癌全球發(fā)病率正逐年增長(zhǎng)，在全球惡性腫瘤的發(fā)病率中排名第五，死亡率位居第三[3]。近年來，肝癌的診斷方法、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的快速發(fā)展，臨床上對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展、診斷及治療有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，但肝癌患者的預(yù)后仍差，特別是對(duì)難以切除或已經(jīng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌的治療方法和手段有限，預(yù)后極差。胡椒堿是一種從胡椒屬植物中提取的生物堿，在中國(guó)和印度是常用的食品和傳統(tǒng)藥物[4]。研究表明，胡椒堿具有抗感染、抗氧化、抗驚厥、抗炎、保肝、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等廣泛的藥理作用[5]。學(xué)者通過研究黑色素瘤誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)，胡椒堿可通過抑制其轉(zhuǎn)移而減少腫瘤的形成，由此可見，胡椒堿對(duì)抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移有一定的作用[6]。然而有關(guān)胡椒堿對(duì)肝癌的作用機(jī)制研究較少。微小RNA(miR)是一類長(zhǎng)度20～24 nt的內(nèi)源性、非編碼的RNA基因產(chǎn)物，可與mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)相結(jié)合而達(dá)到抑制其翻譯，或通過與mRNA翻譯區(qū)結(jié)合而直接引起mRNA的剪切，從而負(fù)調(diào)控靶基因[7]。人類miR-132位于第17號(hào)染色體上，是眾多具有潛在調(diào)控腫瘤的miRNA之一[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-132在肝癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌等組織中表達(dá)水平明顯低于正常組織，同時(shí)與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，有望成為抑制惡性腫瘤的新靶點(diǎn)[9]。本研究基于miRNA-132信號(hào)通路的基礎(chǔ)上，探究胡椒堿對(duì)肝癌的血管形成及腫瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L的青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，每48 h換液1次。待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳代2～3 d 1次，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c雄性裸鼠55只，SPF級(jí)，4周齡，體質(zhì)量15～18 g，均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2016-0006。將裸鼠全部置于22～26℃、相對(duì)濕度40%～60%的環(huán)境中，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理原則，經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 試劑與儀器 胡椒堿(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；DMEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素(美國(guó)Hyclone公司)；miR-132 類似物(銳博生物科技有限公司)；兔抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、E2F3單克隆抗體(美國(guó)Epitmics公司)；MTT試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司)；XDS-1B型顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)；TGL16型離心機(jī)(長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.4 模型制備和分組 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HepG2細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，用PBS溶液重懸，與Matrigel等體積混合，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，皮下注射于45只裸鼠右側(cè)腋下部位，接種量為0.2 ml，5 d后可見裸鼠右上肢腋下觀察有黃豆大小腫瘤生成，至腫瘤生長(zhǎng)至20～40 mm3時(shí)視為造模成功，40只裸鼠成功制備肝癌模型。剩余10只小鼠不接種HepG2細(xì)胞，設(shè)為空白組。待裸鼠瘤體積生長(zhǎng)至100～150 mm3時(shí)，將成功制備肝癌模型40只小鼠隨機(jī)分為模型組(肝癌小鼠模型組)、胡椒堿組(肝癌小鼠模型給予胡椒堿干預(yù)組)、miR-132組(肝癌小鼠模型給予miR-132類似物組)、聯(lián)合組(肝癌小鼠模型給予胡椒堿聯(lián)合miR-132類似物組)，每組10只。

1.5 給藥 胡椒堿組小鼠經(jīng)腹腔注射50 μmol/L胡椒堿；miR-132組小鼠經(jīng)腹腔注射200 μl miR-132類似物干預(yù)；聯(lián)合組小鼠經(jīng)腹腔注射50 μmol/L胡椒堿和200 μl miR-132類似物干預(yù)；空白組和模型組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水干預(yù)。1次/d，共14 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 腫瘤體積測(cè)定 從第1次腹腔注射給藥開始，每隔1 d用游標(biāo)尺測(cè)量腫瘤的最大長(zhǎng)經(jīng)與短經(jīng)，2 d 1次，同時(shí)計(jì)算小鼠體內(nèi)的腫瘤體積均數(shù)，繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線。瘤體積=(長(zhǎng)×寬2)/2。

1.6.2 抑瘤率測(cè)定 于第15天處死各組部分裸鼠，取出裸鼠腫瘤組織，稱取其質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=(1-治療組腫瘤質(zhì)量/對(duì)照組腫瘤質(zhì)量)×100%。

1.6.3 腫瘤組織病理學(xué)觀察 麻醉處死各組部分裸鼠，取出腫瘤組織，固定于4%多聚甲醛溶液中24 h，石蠟包埋組織，用切片機(jī)將組織切成厚度為4 μm的薄片，二甲苯脫蠟、乙醇脫水后，用蘇木精染色切片3 min，伊紅染色1 min。中性樹膠將清洗后的切片組織封片。光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理學(xué)變化。

1.6.4 ELISA檢測(cè)血清VEGF含量 取各組裸鼠眼球血，將血液置于冰浴中1～2 h，于4℃環(huán)境4 000 r/min離心10 min，收集上層血清。用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中VEGF含量。

1.6.5 腫瘤組織微血管密度(MVD)檢測(cè) MVD檢測(cè)操作步驟按照試劑使用說明書進(jìn)行，按照Weidner標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)將切片在低倍光鏡下(×100)確定腫瘤內(nèi)CD34染色陽性的微血管密集區(qū)域，在陽性染色最密集區(qū)域，在高倍光鏡視野下(×100)選取5個(gè)視野進(jìn)行血管計(jì)數(shù)，取平均值為切片的MVD值。

1.6.6 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)肝組織中miR-132、GP73表達(dá) 取各組裸鼠肝組織200 mg，冰上剪碎組織，用裂解液裂解組織成組織懸液，4℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上層血清，用BCA法對(duì)總蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。將組織置于12% SDS-PAGE上，隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5% BSA封閉。加入一級(jí)抗體，抗miR-132(1∶1 000)，抗GP73(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)，于4℃條件下孵育1～2 h。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，在室溫環(huán)境下結(jié)合1 h。用ECL系統(tǒng)試劑盒觀察所有條帶。通過Image J軟件分析條帶密度。

1.6.7 雙熒光素酶報(bào)告靶基因熒光檢測(cè) 利用生物信息學(xué)軟件(TargetScan7.1)，預(yù)測(cè)miR-132調(diào)控高爾基體糖蛋白73(GP73)基因結(jié)合序列，設(shè)計(jì)合成GP73 3'-UTR序列及突變后GP73 3'-UTR序列，將合成的兩種目的基因片段分別克隆到pmir GLO熒光素酶報(bào)告基因載體，構(gòu)建GP73 3'-UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體(pmiR-GLO-wt-survivin)及其突變型載體(pmir GLO-mut-survivin)。

使用LipofectamineTM3000分別將這兩種重組載體質(zhì)粒與miR-132 mimics(miR-132)或miR-132陰性對(duì)照(NC)共同轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞。48 h后對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠腫瘤體積比較 給藥結(jié)束后，模型組裸鼠的瘤體積生長(zhǎng)為(151.32±10.16)mm3，和模型組相比，miR-132組(103.67±7.62)mm3、胡椒堿組(98.36±7.15)mm3和聯(lián)合組(58.45±4.21)mm3裸鼠的瘤體積均顯著降低，且聯(lián)合組瘤體積較胡椒堿組和miR-132組降低更明顯(P<0.05)；miR-132組和胡椒堿組裸鼠瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率比較 模型組腫瘤生長(zhǎng)抑制率為0，miR-132組、胡椒堿組、聯(lián)合組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為(31.1±4.13)%、(33.2±4.25)%與(56.3±5.22)%。和模型組相比，miR-132組、胡椒堿組和聯(lián)合組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率顯著增加(P<0.05)；聯(lián)合組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)抑制率明顯高于miR-132組和胡椒堿組(P<0.05)。

2.3 各組裸鼠腫瘤病理學(xué)比較 空白組為正常的肝組織，可見肝小葉結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心的呈放射狀排列，肝小葉肝細(xì)胞分界清晰，無腫瘤細(xì)胞；模型組可見腫瘤形成，且腫瘤細(xì)胞狀態(tài)良好，數(shù)量較多，大小不等，排列緊密規(guī)則，核畸形，細(xì)胞核深染，核漿比失常；miR-132組、胡椒堿組和聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，核質(zhì)皺縮，細(xì)胞輪廓不規(guī)則；聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞凋亡顯著多于miR-132組和胡椒堿組(圖1)。

圖1 各組裸鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) (HE染色，×200)

2.4 各組裸鼠血清中VEGF含量和MVD比較 見表1。

表1 各組裸鼠血清中VEGF含量比較

2.5 各組裸鼠肝組織中miR-132、GP73表達(dá)比較 和空白組相比，模型組裸鼠肝組織中miR-132表達(dá)顯著降低，GP73蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；和模型組相比，miR-132組、胡椒堿組和聯(lián)合組裸鼠肝組織中miR-132表達(dá)均明顯增加，GP73蛋白表達(dá)均顯著降低，且聯(lián)合組中miR-132和GP73表達(dá)變化最大(P<0.05)；miR-132組和胡椒堿組裸鼠肝組織中miR-132HE GP73表達(dá)比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，△P<0.05；與胡椒堿組相比，#P<0.05

2.6 雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告 結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-132可降低GP73活性(P<0.05)，可見GP73是miR-132的靶基因，見表2。

表2 雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告

3 討論

肝癌是我國(guó)男性發(fā)病率位居第2位的惡性腫瘤，其主要是由肝細(xì)胞、肝內(nèi)膽管細(xì)胞引發(fā)[10]。當(dāng)前臨床治療肝癌的方法有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)及靶向、免疫介入治療等，盡管我國(guó)一直致力于對(duì)肝癌的研究，并在肝癌的檢測(cè)和治療方面取得進(jìn)展，但由于肝癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、早期診斷困難、治療水平限制及腫瘤進(jìn)展迅速且易轉(zhuǎn)移等，導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差等?，F(xiàn)行肝癌化學(xué)治療藥物以阿霉素和5-氟尿嘧啶等最為常用，但這些藥物的治療有效率低且無明顯延長(zhǎng)患者生存期效果，因此尋找和開發(fā)新的特異性高、療效好的抗腫瘤藥物成為肝癌治療的焦點(diǎn)[11]。胡椒堿是生物堿類物質(zhì)，是胡椒的主要生理活性成分之一。其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于桂皮酰胺類，已有研究證明這類化合物具有多種藥理活性，如鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、骨骼肌松弛和抗抑郁等[12]。在抗腫瘤作用的研究中發(fā)現(xiàn)，胡椒堿在體內(nèi)和體外均有良好的抗腫瘤特性，還可以通過抑制轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子和炎癥因子的產(chǎn)生來抑制金屬蛋白酶的活性等[13]。目前關(guān)于胡椒堿對(duì)肝癌腫瘤抑制作用的機(jī)制研究較少，因此本研究旨在研究胡椒堿對(duì)肝癌血管生成及腫瘤的抑制作用。

本研究通過制備肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤，研究結(jié)果顯示，胡椒堿可減少瘤重，抑制肝癌裸鼠的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，且腫瘤抑制率和miR-132干預(yù)效果相似。腫瘤細(xì)胞HE染色顯示，模型組裸鼠腫瘤細(xì)胞狀態(tài)明顯好于胡椒堿組，胡椒堿組腫瘤細(xì)胞狀態(tài)和miR-132組相似。由此提示，胡椒堿可抑制肝癌腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且miR-132類似物也可抑制肝癌所致的腫瘤生長(zhǎng)，效果和胡椒堿相似。吉莉[14]研究證實(shí)，胡椒堿對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人肝癌細(xì)胞HepG2具有較好的抑制作用。

惡性腫瘤最常見的轉(zhuǎn)移途徑包括淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移，而血管生成是腫瘤生成和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。VEGF是目前已知作用最強(qiáng)的血管生成因子，又稱為血管通透因子，是由腫瘤細(xì)胞分泌并特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種生長(zhǎng)因子[15]。VEGF可以通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。腫瘤一般通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、基質(zhì)降解和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，血管生成和其在分子機(jī)制上極其相似，也是通過以上過程生成血管，可見腫瘤的血管生成和瘤轉(zhuǎn)移密不可分[16]。在治療腫瘤時(shí)，可通過對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的抑制而降低血管的生成，進(jìn)而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。MVD代表著腫瘤的結(jié)構(gòu)血管數(shù)量，在腫瘤的血管形成評(píng)價(jià)中起重要作用，常作為新生血管生成程度的金標(biāo)準(zhǔn)。胡椒堿對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞如乳腺癌、直腸癌、前列腺癌等均有抗腫瘤活性，而且胡椒堿在4T1細(xì)胞乳腺癌模型小鼠和道爾頓淋巴瘤模型小鼠體內(nèi)可以抑制瘤體的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)模型小鼠的生存期，并提高了藥物組的存活期。本研究結(jié)果顯示，胡椒堿組和miR-132組裸鼠血清中VEGF含量和MVD數(shù)量均低于模型組，且miR-132組血清中VEGF含量和MVD數(shù)量和胡椒堿組無顯著差異，提示胡椒堿在一定程度上具有抗腫瘤血管生長(zhǎng)的作用。丁文波等[17]研究證實(shí)，雙丹膠囊聯(lián)合5-FU能抑制肝癌小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，并對(duì)肝癌小鼠的免疫器官有一定程度的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)VEGF的表達(dá)而抑制腫瘤血管生成有關(guān)。

miR-132定位于人類染色體17p13，是一類與炎癥、血管生長(zhǎng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的miRNA。有研究結(jié)果顯示，肝癌組織中miR-132表達(dá)顯著降低，其在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，過表達(dá)miR-132可抑制肝癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[18]。本研究結(jié)果顯示，肝癌裸鼠中miR-132表達(dá)降低，miR-132過表達(dá)和胡椒堿均可提高miR-132表達(dá)。胡椒堿作為常用的調(diào)料已經(jīng)廣泛使用了上百年，其還用于醫(yī)藥、防腐劑和除蟲等方面。胡椒堿類的抗癇靈是我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)第一個(gè)抗癲癇藥品?？拱B靈是國(guó)際首位以兒童為對(duì)象的進(jìn)行臨床觀察的藥品，充分證明了該藥的低毒性和安全性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胡椒堿還有預(yù)防腫瘤發(fā)生發(fā)展的特性。GT73在正常肝細(xì)胞中呈低表達(dá)狀態(tài)，其在病變的肝細(xì)胞尤其是肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高。近年來，GP73作為一種肝癌血清新標(biāo)志物引起廣泛關(guān)注，其敏感度和特異性高于甲胎蛋白。此外，有研究結(jié)果顯示，肝癌患者血清GP73的升高可能是與肝癌細(xì)胞大量合成而分泌到血液中有關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，miR-132和胡椒堿均可抑制肝癌裸鼠肝組織中GP73表達(dá)，提示miR-132與GP73呈顯著復(fù)相關(guān)。雙熒光素酶結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-132可降低GP73活性，進(jìn)一步證實(shí)了GP73是miR-132調(diào)控的直接靶基因。沙敏等[20]研究證實(shí)，在肝癌患者血清中發(fā)現(xiàn)miR-212/miR-132均呈低表達(dá)，且miR-212/miR-132均可對(duì)肝細(xì)胞中的GP73進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而抑制肝癌的增長(zhǎng)。

綜上所述，胡椒堿可通過調(diào)控miR-132負(fù)向調(diào)控GP73抑制肝癌血管形成，同時(shí)也能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。