范敬靜 常彩芳 陳 宇 韓永平 劉金祿 周小英 白 雪

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院感染內(nèi)科 (河北 張家口，075000) 2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院微生物科

慢性乙型肝炎(CHB)是因感染乙型肝炎病毒(HBV)所致，若不及時治療，可能發(fā)展為肝硬化和肝癌，嚴(yán)重威脅患者的生命安全?？共《局委熓歉纳艭HB患者預(yù)后的有效措施之一，主要是通過乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)清除和血清學(xué)轉(zhuǎn)換達(dá)到治療的目的[1,2]。聚乙二醇化干擾素α(PEG-IFNα)是治療HBeAg陽性CHB患者的有效方式之一，可通過作用于HBV逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶，抑制HBV復(fù)制，延緩疾病進(jìn)展，提高患者生活質(zhì)量，但CHB患者的藥物耐受一直是臨床治療難點。既往研究報道抗病毒治療的療效及耐藥突變密切相關(guān)，某些耐藥基因可導(dǎo)致HBV耐藥突變，進(jìn)而增加治療難度[3,4]。Toll樣受體10(TLR10)基因是一種無特異性配體的寡受體，可通過與TLR2作用對下游白細(xì)胞介素-1分泌進(jìn)行調(diào)控，介導(dǎo)信號通路抑制HBV復(fù)制。TLR2與HBV感染密切相關(guān)，但TLR10基因多態(tài)性在HBV感染過程中的免疫應(yīng)答作用機(jī)制的相關(guān)報道較為少見[5,6]?；诖?，研究以92例HBeAg陽性CHB患者作為研究對象，予以PEG-IFNα治療，檢測TLR10基因多態(tài)性并分析其與患者免疫應(yīng)答的關(guān)系，為臨床治療方案的制定提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 基本資料 選取我院2019年8月至2020年8月收治的92例HBeAg陽性CHB患者作為研究對象，其中男52例，女40例；年齡23～79歲，平均(48.43±3.22)歲。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《CHB防治指南》[7]中診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)常規(guī)乙型肝炎標(biāo)志物檢測確認(rèn)為HBeAg陽性者，年齡>18歲；②臨床資料完整；③入組前未使用抗病毒藥物；④患者或家屬知情且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并全身性感染、免疫系統(tǒng)疾病者；②藥物或飲酒導(dǎo)致的肝功能異常者；③認(rèn)知障礙或精神疾病者；④拒絕或不配合研究患者。

1.3 治療方案及分組 患者均進(jìn)行PEG-IFNα治療，治療6個月后患者血清HBV DNA<2 000 IU/ml且達(dá)到HBeAg、乙型肝炎e抗體(HBeAb)血清轉(zhuǎn)換者為應(yīng)答組(44例)，未達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)為非應(yīng)答組(48例)。

1.4 觀察指標(biāo)及研究方法

1.4.1 一般資料及生化指標(biāo) 收集兩組患者性別、年齡等資料，并取患者清晨空腹靜脈血約3 ml，使用湖南圣湘生物科技有限公司試劑盒，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測患者HBV DNA載量。使用廈門英科新創(chuàng)科技有限公司試劑盒，采用7180型全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。

1.4.2 TLR10基因RS10004195位點基因型和等位基因檢測 取患者清晨空腹靜脈血約3 ml，置于含有乙二胺四乙酸二鈉的抗凝管內(nèi)，于-80℃保存，使用上海捷瑞生物工程有限公司1408G26型全血基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，核酸定量分析儀檢測DNA濃度。然后進(jìn)行PCP擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：DNA模板0.5 μl，10×緩沖液2.5 μl，MgCl25 mmol/L，引物0.5 μl，dNTP 0.5 μl，TaqDNA聚合酶0.25 μl。TLR10基因RS10004195位點上游引物為 5′-CCTGGGTGACAAAGTGAGACCCTACCT-3′，下游引物為5′-CTTAAACCCCATCCGCCCTCTT-3′；擴(kuò)增產(chǎn)物由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行基因序列分析。分析TLR10基因RS10004195位點TT(野生型)、AA+AT(變異型)基因分布頻率，及A、T等位基因頻率分布情況，探討基因型分布頻率和等位基因頻率在不同免疫應(yīng)答患者中分布情況。

1.4.3 TLR10基因RS11096957位點基因型和等位基因檢測 TLR10基因RS11096957位點上游引物為5′-CTTAAACCCCATCCGCCCTCTT-3′，下游引物為5′-GTAGCCTGCCCATCTTAAACAC-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 2 min，94℃變性45 s，58℃退火90 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)95℃預(yù)變性 2 min，94℃變性45 s，56℃退火90 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)。檢測TLR10基因RS11096957位點CC(野生型)、AC+AA(變異型)基因分布頻率，及A、C等位基因頻率分布情況，探討基因型分布頻率和等位基因頻率在不同免疫應(yīng)答患者中分布情況。

1.4.4 TLR10基因多態(tài)性與臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性 以HBeAg陽性CHB患者PEG-IFNα治療后是否發(fā)生免疫應(yīng)答為自變量(0=非應(yīng)答，1=應(yīng)答)，以TLR10基因中A基因型攜帶、A等位基因頻率分布為因變量，分析TLR10基因RS10004195位點和RS11096957位點基因型分布頻率和等位基因頻率與免疫應(yīng)答的關(guān)系，分析 LR10基因多態(tài)性與HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者PEG-IFNα治療臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基本資料比較 兩組患者性別、年齡、HBV DNA載量、ATL、AST水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者TLR10基因RS10004195位點基因型和等位基因頻率分布比較 TLR10基因RS10004195位點基因型Hardy-Weinberg平衡分析顯示，研究人群不具有特異性(χ2=3.18，P=0.105)，應(yīng)答組AA+AT型基因分布頻率(77.27%)顯著高于非應(yīng)答組(52.08%)，A等位基因頻率(65.91%)顯著高于非應(yīng)答組(41.67%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者TLR10基因RS10004195位點基因型和等位基因頻率分布比較 [例(%)]

2.3 兩組患者TLR10基因RS11096957位點基因型和等位基因頻率分布比較 TLR10基因RS11096957位點基因型因型Hardy-Weinberg平衡分析顯示，研究樣本能夠代表總體(χ2=4.09，P=0.078)。應(yīng)答組AC+AA型基因分布頻率(70.45%)與非應(yīng)答組(62.50%)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而應(yīng)答組A等位基因頻率(61.36%)顯著高于非應(yīng)答組(39.58%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組患者TLR10基因RS11096957位點基因型和等位基因頻率分布比較 [例(%)]

2.4 TLR10基因多態(tài)性與HBeAg陽性CHB患者PEG-IFNα治療臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性 TLR10基因RS10004195位點中，A型基因，A等位基因頻率和RS11096957位點中A等位基因頻率是HBeAg陽性CHB患者PEG-IFNα治療臨床轉(zhuǎn)歸的獨立危險因素(OR>1，P<0.05)，見表4。

表4 TLR10基因多態(tài)性與HBeAg陽性慢性CHB患者PEG-IFNα治療臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性

3 討論

CHB患者的治療過程中通過抑制HBV DNA聚合酶來持續(xù)降低血清HBV DNA水平，促進(jìn)ALT正常，進(jìn)而改善患者肝臟組織學(xué)病變，阻止病情進(jìn)展。HBV誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是造成肝臟損傷和炎癥的主要原因，宿主通過免疫反應(yīng)來清除病毒，病毒通過免疫逃逸來避免清除，進(jìn)而保持免疫應(yīng)答的平衡[8,9]。而基因型突變后導(dǎo)致HBV清除能力改變，進(jìn)而導(dǎo)致免疫應(yīng)答能力改變，從而影響影響抗病毒治療應(yīng)答和病毒的清除[10,11]。本次研究中TLR10基因RS10004195位點A型基因，A等位基因頻率突變，及RS11096957位點中A等位基因頻率是導(dǎo)致PEG-IFNα治療后臨床歸轉(zhuǎn)的獨立危險因素，其基因表達(dá)與HBeAg陽性CHB患者免疫應(yīng)答密切相關(guān)，可為臨床基因調(diào)節(jié)治療提供理論基礎(chǔ)。

本次研究結(jié)果顯示，TLR10基因RS10004195位點基因型中，應(yīng)答組AA+AT型基因分布頻率為77.27%顯著高于非應(yīng)答組的52.08%，A等位基因頻率(65.91%)顯著高于非應(yīng)答組(41.67%)，說明應(yīng)答免疫組患者TLR10基因RS10004195位點(AA+AT)變異型基因和A等位基因頻率分布頻率較高，這可能與A型基因發(fā)生突變后可能導(dǎo)致病毒清除能力和免疫應(yīng)答能力改變，提示TLR10可能參與了HBV相關(guān)的免疫反應(yīng)。A型基因攜帶者在基因突變后導(dǎo)致HBV核心啟動，進(jìn)而促進(jìn)HBV復(fù)制水平提高，推測A型基因促進(jìn)免疫應(yīng)答，參與肝纖維化和炎癥反應(yīng)過程[12,13]。究其原因，不同HBV基因型對不同抗HBV藥物耐受程度不同，進(jìn)而對患者機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生不同影響。HBeAg陽性患者的肝細(xì)胞、庫否細(xì)胞等過促進(jìn)Th17細(xì)胞分化和外周血單個核細(xì)胞應(yīng)答參與疾病進(jìn)展，HBsAg可通過阻斷JNK-MAPK信號通路抑制巨噬細(xì)胞分泌炎性因子而躲避免疫攻擊，進(jìn)而影響抗病毒治療應(yīng)答和病毒的清除[14,15]。T細(xì)胞的應(yīng)答增強(qiáng)可促進(jìn)HBV清除，而信號途徑被阻斷導(dǎo)致相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過程被改變，病毒抑制或清除的作用被削弱[16,17]。因此，免疫應(yīng)答在CHB患者病情發(fā)展具有重要意義。TLR10在B細(xì)胞核樹突狀細(xì)胞中表達(dá)，可通過MyD 88信號通路介導(dǎo)下游炎性因子分泌，調(diào)節(jié)T細(xì)胞，促進(jìn)TLR10表達(dá)，在缺氧或活性氧氧功能增強(qiáng)時TLR10表達(dá)，當(dāng)TLR10基因突變，可導(dǎo)致下游介導(dǎo)炎性因子分泌信號通路改變，T細(xì)胞調(diào)節(jié)功能被抑制，進(jìn)而導(dǎo)致病毒清除能力降低[18,19]。由此提示，TLR10基因與HBeAg陽性CHB患者免疫應(yīng)答密切相關(guān)，對患者臨床轉(zhuǎn)歸評估具有重要意義。并且，TLR10基因RS11096957位點基因型中，應(yīng)答組基因型分布頻率無明顯差異，而應(yīng)答組A等位基因頻率(61.36%)顯著高于非應(yīng)答組(39.58%)，說明TLR10基因RS11096957位點A等位基因頻率突變與應(yīng)答免疫有關(guān)。究其原因，LR10基因單核苷酸多態(tài)性與幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎、支氣管哮喘、呼吸道合胞病毒感染等多種疾病有關(guān)，其作用機(jī)制尚不明確，但其人體免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，推測其基因表達(dá)可能通過影響免疫應(yīng)答參與HBV發(fā)展過程，進(jìn)而影響患者臨床轉(zhuǎn)歸[20,21]。TLR10是一種功能性受體，并且是唯一調(diào)控TLR2信號通路應(yīng)答抑制性受體，可經(jīng)配體刺激后促進(jìn)TLR2細(xì)胞通路下游炎性因子分泌，機(jī)體野生基因分布降低，血單個細(xì)胞IL-1 受體拮抗劑mRNA和蛋白水平升高，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用，促進(jìn)免疫應(yīng)答，提高HBeAg血清轉(zhuǎn)換率，減輕肝組織壞死程度，逆轉(zhuǎn)纖維化[22,23]。因此，TLR10發(fā)生變異型突變后可導(dǎo)致RS11096957位點A等位基因頻率增加，促進(jìn)免疫應(yīng)答發(fā)生，導(dǎo)致病毒清除能力降低，提示可對HBeAg陽性CHB患者進(jìn)行基因檢測然后根據(jù)基因型和等位基因頻率分布情況進(jìn)行調(diào)節(jié)治療，改善基因耐藥情況，提高臨床治療效果，改善預(yù)后。

另外，對TLR10基因進(jìn)行Logistics回歸分析發(fā)現(xiàn)，TLR10基因RS10004195位點中，A型基因，A等位基因頻率和RS11096957位點中A等位基因頻率是HBeAg陽性CHB患者PEG-IFNα治療臨床轉(zhuǎn)歸的獨立危險因素(OR>1，P<0.05)，提示TLR10基因RS10004195位點A 型基因攜帶者和RS11096957位點A等位基因攜帶者更易發(fā)生免疫應(yīng)答，可通過檢測其基因型分布情況，進(jìn)而為臨床治療提供指導(dǎo)依據(jù)。這可能是因為TRL10在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，可通過與其他TRL協(xié)同，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可通過抑制信號通路中IKB、MAOK、MyDNA88 和TRIF蛋白表達(dá)，影響下游炎性因子分泌，進(jìn)而抑制TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[24,25]。因此，TLR10基因參與HBeAg陽性CHB患者PEG-IFNα治療后臨床歸轉(zhuǎn)過程，可為臨床治療及患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸提供重要參考依據(jù)。但由于本次研究樣本較少，且LR10基因在HBeAg陽性CHB患者PEG-IFNα治療中對免疫應(yīng)答的機(jī)制尚不完善，其與免疫應(yīng)答中的直接關(guān)系還有待深入，還需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究，進(jìn)而為臨床治療方案的制定提供指導(dǎo)依據(jù)。

綜上所述，TLR10基因RS10004195位點A型基因，A等位基因頻率突變，及RS11096957位點中A等位基因頻率是影響HBeAg陽性CHB患者PEG-IFNα治療后臨床歸轉(zhuǎn)的獨立危險因素，其基因表達(dá)與HBeAg陽性CHB患者治療后免疫應(yīng)答密切相關(guān)，可通過檢測其基因表達(dá)為臨床治療及預(yù)后提供指導(dǎo)依據(jù)。