張振翼 袁增江 張 欣 趙孟雷 徐殿國(guó)

1.邯鄲市中心醫(yī)院普外科 (河北 邯鄲，056000) 2.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室

肝癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，由于其高轉(zhuǎn)移潛力，已成為癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。盡管在肝癌的診斷和治療方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但是患者的預(yù)后仍較差[2]。因此，探索其潛在的病理機(jī)制對(duì)于尋找可以改善肝癌患者治療水平的新策略尤為重要。微小RNA(miRNA)作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，通過(guò)靶向蛋白質(zhì)編碼基因的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)發(fā)揮其功能，該蛋白參與調(diào)節(jié)眾多生物學(xué)過(guò)程。研究證實(shí)在多種人類(lèi)癌癥中都發(fā)現(xiàn)了改變的miRNA水平，并且在腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[3]。微小RNA-191(miR-191)作為一種高度保守的血清外泌體miRNA，在20多種不同的癌癥類(lèi)型中均異常表達(dá)，也是肝細(xì)胞癌(HCC)治療的潛在致癌靶標(biāo)。在HCC癌細(xì)胞中，miR-191被證明具有調(diào)節(jié)作用，通過(guò)DNA甲基化并參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的調(diào)控[4]。Krüppel樣因子(KLF)屬于控制基本細(xì)胞過(guò)程的鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族。KLF6是KLF家族的成員，在細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用[5]。研究表明，KLF6抑制了細(xì)胞周期蛋白D的表達(dá)，導(dǎo)致HCC衍生細(xì)胞中的G1細(xì)胞周期停滯[6]。有研究報(bào)道，布比卡因可抑制胰腺癌細(xì)胞和人前列腺癌細(xì)胞侵襲、遷移和增殖[7,8]。目前尚無(wú)關(guān)于布比卡因?qū)Ω伟┘?xì)胞作用機(jī)制的研究，本研究擬探討布比卡因?qū)Ω伟〩epG2細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡及miR-191/KLF6信號(hào)軸的影響，為肝癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑及儀器 肝癌HepG2細(xì)胞系(上海漢博生物科技有限公司，批號(hào)SCSP-917)，布比卡因(岳陽(yáng)市嘉誠(chéng)生物科技有限公司，原料藥，純度99%，批號(hào)2180-95-3)，順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)20200516)，胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡試劑盒(北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)YH5778、YH6019、YH7119、YH5007)，TRIzol試劑、TAQMAN MICRORNA定量PCR試劑盒、裂解緩沖液、蛋白含量測(cè)定試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)BL-11335、BL-16472、BL-20176、BL-20135、BL-30017)，兔抗KLF6抗體、兔抗GAPDH抗體、山羊抗兔二抗、增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海恪敏生物科技有限公司，批號(hào)BY-5784R、BY-0844R、EM-1009、BY-2911R)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)240i)，酶標(biāo)儀(上海寶予德科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)K3 Plus)，Transwell小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，型號(hào)3415)，光學(xué)顯微鏡(德國(guó)LIOO公司，型號(hào)JDS300)，流式細(xì)胞儀(廣州吉源生物科技有限公司，型號(hào)CyFlow Cube6)，熒光定量PCR系統(tǒng)(杭州博日科技股份有限公司，型號(hào)FQD-16A)，凝膠成像系統(tǒng)(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)GIS300)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 肝癌HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后，加入到含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞覆蓋率為70%左右時(shí)使用胰蛋白酶消化、傳代。

將肝癌HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為肝癌HepG2細(xì)胞組、順鉑組(3.0 μg/ml)[9]、布比卡因低劑量組(2.5 mg/ml)、布比卡因高劑量組(5.0 mg/ml)[8]。

肝癌HepG2細(xì)胞組：肝癌HepG2細(xì)胞液(細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml)在10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。順鉑組、布比卡因低劑量組、布比卡因高劑量組：細(xì)胞培養(yǎng)方法同肝癌HepG2細(xì)胞組，分別加入濃度為3.0 μg/ml的順鉑、2.5 mg/ml、5.0 mg/ml的布比卡因。以上各組設(shè)8個(gè)平行樣，培養(yǎng)72 h。

1.3 細(xì)胞增殖測(cè)定 各組肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，在96孔板中每孔加入1×104個(gè)肝癌HepG2細(xì)胞，48 h后加入10 μl CCK-8試劑，在37℃下放置4 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度(OD)，根據(jù)OD計(jì)算細(xì)胞存活率，另設(shè)空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)液、CCK-8試劑)，細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD/空白對(duì)照組OD×100%。

1.4 細(xì)胞侵襲水平測(cè)定 各組肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將肝癌HepG2細(xì)胞(8×103個(gè)/ml)接種在基質(zhì)膠包被的Transwell小室上腔中，將含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基添加到Transwell小室下腔中，在37℃下培養(yǎng)24 h后，將上腔室中的細(xì)胞移出，并將下腔室中的細(xì)胞在室溫下使用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，隨機(jī)選取6個(gè)視野用顯微鏡計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞凋亡水平測(cè)定 各組肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶消化并用PBS洗滌兩次，將細(xì)胞用70%的冰冷乙醇固定，重懸于PBS中，采用Annexin V-FITC/PI試劑盒于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 細(xì)胞miR-191、KLF6 mRNA水平測(cè)定 使用TRIzol試劑從肝癌HepG2細(xì)胞中分離總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用TAQMAN MICRORNA定量PCR試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行反應(yīng)。引物由上?？党缮锕こ逃邢薰驹O(shè)計(jì)并合成。引物序列如下：miR-191正向5′-GCATCCTGACGTGTCAGACTA-3′，miR-191反向5′-TACGACGATACGGGATAAGTC-3′；KLF6正向5′-GCAATACTCGCCTTACGGCT-3′，KLF6反向5′-TACACACCTTGTAGTACGCC-3′；GAPDH正向5′-ACAAC-TTTGGTATCGTGGAAGG-3′，GAPDH反向5′-GACCTAGATGGCCTAAACGCTT-3′；熱循環(huán)的條件：95℃ 5 min，95℃ 15 s共40個(gè)循環(huán)，60℃ 30 s退火/延伸。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-191、KLF6 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 細(xì)胞KLF6蛋白水平測(cè)定 使用裂解緩沖液裂解肝癌HepG2細(xì)胞，提取總蛋白，測(cè)定蛋白含量之后通過(guò)凝膠電泳分離蛋白質(zhì)(50 μg/泳道)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂奶封閉膜3 h，將兔抗KLF6抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶500)在4℃下與PVDF膜孵育過(guò)夜，用PBS洗滌3次后，將膜與山羊抗兔二抗孵育3 h，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒和Quantity One軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組肝癌HepG2細(xì)胞存活率、穿膜數(shù)、凋亡率比較 見(jiàn)表1，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞見(jiàn)圖1。流式細(xì)胞儀上檢測(cè)的細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)圖2。

表1 各組肝癌HepG2細(xì)胞存活率比較

圖1 各組肝癌HepG2細(xì)胞穿膜數(shù)比較(結(jié)晶紫染色，×200) (A：肝癌HepG2細(xì)胞組，B：順鉑組，C：布比卡因低劑量組，D：布比卡因高劑量組)

圖2 各組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率比較 (A：肝癌HepG2細(xì)胞組，B：順鉑組，C：布比卡因低劑量組，D：布比卡因高劑量組)

2.2 各組肝癌HepG2細(xì)胞miR-191、KLF6 mRNA水平及KLF6蛋白水平比較 見(jiàn)表2。KLF6蛋白印跡圖見(jiàn)圖3。

表2 各組肝癌HepG2細(xì)胞miR-191、KLF6 mRNA水平比較

圖3 各組肝癌HepG2細(xì)胞KLF6蛋白印跡圖 (A：肝癌HepG2細(xì)胞組，B：順鉑組，C：布比卡因低劑量組，D：布比卡因高劑量組)

3 討論

布比卡因作為一種臨床局部浸潤(rùn)麻醉藥物，最近的一些研究集中于其對(duì)癌細(xì)胞的潛在細(xì)胞毒性。Liu等[10]研究表明，布比卡因可通過(guò)調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡和自噬。Ju等[11]研究表明，布比卡因可降低胃癌細(xì)胞中環(huán)狀RNA 0000376(circRNA0000376)表達(dá)，提高微小miR-145-5p表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌進(jìn)展。有研究顯示布比卡因可呈劑量依賴(lài)性上調(diào)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)表達(dá)進(jìn)而抑制人膀胱癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。鹿素青等[13]研究表明，布比卡因可能通過(guò)促進(jìn)miR-381-3p表達(dá)，抑制E3泛素連接酶(HERC4)表達(dá)，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這些研究均表明布比卡因具有抗癌作用，可有效抑制癌細(xì)胞的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，布比卡因低、高劑量組肝癌HepG2細(xì)胞存活率、穿膜數(shù)低于肝癌HepG2細(xì)胞組，凋亡率高于肝癌HepG2細(xì)胞組；且布比卡因高劑量組肝癌HepG2細(xì)胞存活率、穿膜數(shù)低于布比卡因低劑量組，凋亡率高于布比卡因低劑量組。這與上述研究結(jié)果一致，說(shuō)明布比卡因能明顯抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)其凋亡。

肝癌的發(fā)生和發(fā)展涉及多種基因和環(huán)境因素，這些與許多病理過(guò)程和分子事件有關(guān)。miRNA參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展，某些miRNA會(huì)提高腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而起到致癌性miRNA的作用；另外一些miRNA會(huì)抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲，并起抑癌性miRNA的作用[14]。而miR-191可發(fā)揮促癌作用，張琳琳等[15]臨床研究表明上皮性卵巢癌患者血漿miR-191表達(dá)水平明顯高于上皮卵巢良性腫瘤患者和健康體檢者。Hu等[16]研究表明，miR-191在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制miR-191表達(dá)可降低宮頸癌細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。臨床研究表明，胃癌患者血清中miR-191表達(dá)與正常人相比明顯上調(diào)，且miR-191高表達(dá)是化療不敏感的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miR-191高表達(dá)患者預(yù)后生存率較低[17]。本研究結(jié)果顯示，布比卡因低、高劑量組肝癌HepG2細(xì)胞中miR-191水平低于肝癌HepG2細(xì)胞組，布比卡因高劑量組肝癌HepG2細(xì)胞中miR-191水平低于布比卡因低劑量組。表明布比卡因可抑制肝癌HepG2細(xì)胞中miR-191表達(dá)，進(jìn)一步提示布比卡因?qū)Ω伟〩epG2細(xì)胞增殖、侵襲的抑制作用和對(duì)凋亡的促進(jìn)作用，可能與其抑制miR-191的表達(dá)有關(guān)。

KLF6是一種抑癌基因。有學(xué)者研究表明宮頸癌組織KLF6高表達(dá)者化療敏感性高，且預(yù)后更好，KLF6可作為患者預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)[18]。張倬等[19]研究顯示，食管癌細(xì)胞中KLF6 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，抑制miR-24-3p表達(dá)可上調(diào)KLF6 mRNA和蛋白表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)其凋亡。研究表明，抑制環(huán)狀RNA-SMAD7表達(dá)可使KLF6的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加，卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲受到明顯抑制[20]。相元翠等[21]研究表明，KLF6基因可通過(guò)磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以上研究均表明KLF6具有抑癌作用，可有效抑制癌細(xì)胞的發(fā)展。KLF6是miR-191的潛在靶標(biāo)，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證了miR-191和KLF6基因之間的相互作用[4]。本研究結(jié)果顯示：布比卡因低、高劑量組肝癌HepG2細(xì)胞中KLF6 mRNA和蛋白水平高于肝癌HepG2細(xì)胞組，布比卡因高劑量組肝癌HepG2細(xì)胞中KLF6 mRNA和蛋白水平高于布比卡因低劑量組。說(shuō)明布比卡因可促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞中KLF6的表達(dá)，而KLF6 mRNA和蛋白水平的升高可能與布比卡因抑制miR-191的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，布比卡因能明顯抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)其凋亡；其機(jī)制可能與布比卡因降低肝癌HepG2細(xì)胞miR-191的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)KLF6的表達(dá)有關(guān)。