李紅旗，戢翰升,王小波

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院：1.病理科；2.神經(jīng)外科；3.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，湖北隨州 441300

腦膜瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤之一，占所有原發(fā)性腦腫瘤的37%以上[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，腦膜瘤在組織學(xué)上分為Ⅰ～Ⅲ級(jí)，其中Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)腦膜瘤具有侵襲性，為惡性腦膜瘤，80%的腦膜瘤為Ⅰ級(jí)，是良性腦膜瘤。然而，20%的Ⅰ級(jí)腦膜瘤在完全切除后會(huì)復(fù)發(fā)，這表明需要做進(jìn)一步的風(fēng)險(xiǎn)分層來指導(dǎo)良性腦膜瘤患者隨訪期間的管理[2]。GATA結(jié)合蛋白4(GATA4)是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)早期胚胎的心臟和腸道發(fā)育非常重要，具有組織特異性，GATA4基因敲除小鼠由于心臟和腸道缺陷在胚胎發(fā)育早期死亡。研究顯示GATA4表達(dá)異常與肺癌、胃癌和鼻咽癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，既可以充當(dāng)抑癌因子，又可以充當(dāng)促癌因子[3-5]。符方旭等[6]報(bào)道GATA4在惡性腦膜瘤中陽性表達(dá)增加，并與患者預(yù)后不良相關(guān)。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)也稱為核心結(jié)合因子1，已被證明是成骨細(xì)胞分化所需的主要轉(zhuǎn)錄因子，缺乏RUNX2的小鼠由于成骨細(xì)胞生成缺陷而無法進(jìn)行骨化[7]。研究表明RUNX2在乳腺癌、胃癌和胰腺癌等腫瘤中發(fā)揮促癌作用，能促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)化療藥物抵抗[8-10]。但目前GATA4和RUNX2在良性腦膜瘤中的表達(dá)情況和臨床價(jià)值尚不清楚，因此本研究分析了良性腦膜瘤GATA4和RUNX2的表達(dá)情況，對(duì)GATA4和RUNX2的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2013年1月至2017年1月本院收治的100例良性腦膜瘤患者納入研究，男39例、女性61例；年齡：≤40歲42例、>40歲58例；腫瘤部位：額部41例、蝶骨嵴30例、巖骨斜坡12例、其他17例；腫瘤最大徑：≤5 cm 55例、>5 cm 45例；組織類型：上皮型32例、纖維型29例、過渡型15例、其他21例，瘤周水腫：有52例、無48例，Ki-67指數(shù)：<4% 69例，≥4% 31例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者術(shù)前未進(jìn)行化療或放療；(2)患者為首次手術(shù)切除；(3)手術(shù)后經(jīng)病理切片明確診斷為WHO Ⅰ級(jí)良性腦膜瘤；(4)具備完整的臨床病理資料和隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重的器質(zhì)性或精神性疾??；(2)合并其他原發(fā)性腫瘤；(3)術(shù)后并發(fā)癥死亡者。研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過，納入研究的患者均對(duì)本研究知情同意。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；無水乙醇、異丙醇和氯仿購自天津風(fēng)船化工試劑有限公司；反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑購自日本Takara公司；GATA4和RUNX2的引物均由上海生工生物科技有限公司合成；槍頭和無RNA酶EP管購自美國Coring公司；PCR擴(kuò)增儀器購自美國Bio-Rad公司；7500 qPCR儀購自美國ABI公司。

1.3方法

1.3.1GATA4和RUNX2表達(dá)水平的檢測 采用Trizol法提取手術(shù)切除的良性腦膜瘤和瘤旁組織的總RNA，紫外分光光度法檢測RNA純度[吸光度(A)比值A(chǔ)260/A280=1.9～2.1符合要求]和濃度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用qPCR檢測組織中GATA4和RUNX2的表達(dá)水平。引物序列如下，GATA4 F：5′-CCCAATCTCGTAG ATATGTTTGAC-3′，R：5′-CCGTTCATCTTGTGGTAGAG-3′;RUNX F：5′-CCGGAATGCCTCTGCTGTTATGA-3′，R：5′-ACTGAGGCGGTCAGAGAACAAACT-3′；內(nèi)參β-actin F：5′- ACTGGTCTCAGTCAGTGTACAGC-3′，R：5′-ACAGGAA GTCCCTTGCCATC-3′。采用20 μL PCR體系：SYBR Green preMix 10 μL，上下游引物各2 μL，Rox Ⅱ 0.4 μL，cDNA 1 μL，蒸餾水6.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共循環(huán)40次。采用2-ΔΔCT計(jì)算GATA4、RUNX2的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2隨訪資料收集 對(duì)納入研究者進(jìn)行5年隨訪，對(duì)患者復(fù)發(fā)情況進(jìn)行記錄。

2 結(jié) 果

2.1良性腦膜瘤中GATA4和RUNX2的表達(dá)水平 良性腦膜瘤及瘤旁組織中GATA4的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.53±0.46、0.77±0.14，RUNX2的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.76±0.51、0.82±0.16。與瘤旁組織相比，良性腦膜瘤組織中GATA4、RUNX2的表達(dá)水平均明顯增加(t=9.21、10.73，P<0.05)。

2.2良性腦膜瘤組織中GATA4和RUNX2表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示：良性腦膜瘤組織中GATA4和RUNX2的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.218，P=0.029)。

2.3GATA4、RUNX2表達(dá)水平與良性腦膜瘤患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 GATA4、RUNX2在良性腦膜瘤組織中的表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤部位、組織類型和腫瘤分期無關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤最大徑、有無瘤周水腫及Ki-67指數(shù)有關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 GATA4和RUNX2在良性腦膜瘤組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.4良性腦膜瘤組織中GATA4、RUNX2表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪資料顯示：納入研究的100例患者中，復(fù)發(fā)15例，5年復(fù)發(fā)率為15.00%(15/100)。GATA4高表達(dá)組和GATA4低表達(dá)組的5年復(fù)發(fā)率分別為26.67%(12/45)和5.45%(3/55)。GATA4高表達(dá)組的5年復(fù)發(fā)率顯著高于GATA4低表達(dá)組(χ2=4.645，P=0.0311)；RUNX2高表達(dá)組和RUNX2低表達(dá)組5年復(fù)發(fā)率分別為35.13%(13/37)和3.17%(2/63)，RUNX2高表達(dá)組的5年復(fù)發(fā)率顯著高于RUNX2低表達(dá)組(χ2=18.50，P<0.001)。見圖1。

注：A為GATA4表達(dá)水平對(duì)良性腦膜瘤患者預(yù)后的影響；B為RUNX2表達(dá)水平對(duì)良性腦膜瘤患者預(yù)后的影響。

2.5單因素和多因素Cox回歸分析良性腦膜瘤患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素 單因素和多因素Cox回歸分析顯示：GATA4高表達(dá)、RUNX2高表達(dá)、腫瘤最大徑>5 cm、有瘤周水腫和Ki67指數(shù)≥4%是良性腦膜瘤患者復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表2。

表2 Cox回歸分析影響良性腦膜瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

3 討 論

腦膜瘤的處理方式選擇包括觀察、手術(shù)切除和放射治療。研究顯示，即使是良性腦膜瘤也可能復(fù)發(fā)，其長期隨訪中的復(fù)發(fā)率高達(dá)47%，對(duì)于復(fù)發(fā)的患者經(jīng)常需要額外的手術(shù)治療或補(bǔ)救性地進(jìn)行放射治療，預(yù)后不良[2]。因此，預(yù)測良性腦膜瘤復(fù)發(fā)的能力是良性腦膜瘤臨床管理的關(guān)鍵組成部分。有研究表明一些差異性的分子表達(dá)與腦膜瘤的復(fù)發(fā)和進(jìn)展有關(guān)，例如端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)啟動(dòng)子突變、DNA甲基化或組蛋白H3K27me3缺失等[11]，提示研究腦膜瘤進(jìn)展中發(fā)生改變的分子可能對(duì)監(jiān)測良性腦膜瘤復(fù)發(fā)具有重要價(jià)值。

GATA4家族屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族，其在細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用。其中GATA4以高度動(dòng)態(tài)的方式與共有序列結(jié)合，可以在器官發(fā)生過程中調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)，被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵控制器。GATA4(V238G)的錯(cuò)義突變導(dǎo)致小鼠肺結(jié)構(gòu)異常和死胎，但是在人類肺癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了GATA4啟動(dòng)子的高頻甲基化，GATA4經(jīng)表觀遺傳修飾后沉默，有抑癌作用[12]。ZHOU等[5]報(bào)道GATA4在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，表明GATA4在腫瘤的惡性進(jìn)展中具有功能多樣性，在不同的腫瘤中可能發(fā)揮相反的作用。研究報(bào)道，GATA4在腦膜瘤組織中的陽性表達(dá)率增加，并且在WHO分級(jí)較高及顱外轉(zhuǎn)移的腦膜瘤組織中陽性表達(dá)率更高，并且是惡性腦膜瘤患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因子[6]。大多數(shù)腦膜瘤是良性的，GATA4對(duì)良性腦膜瘤的預(yù)后判斷是否具有指導(dǎo)價(jià)值還不清楚。本文研究結(jié)果顯示，腦膜瘤組織中GATA4的表達(dá)水平顯著高于瘤旁組織(P<0.05)。同時(shí)，在腫瘤最大徑>0.5 cm、有瘤周水腫及Ki-67指數(shù)≥4%的良性腦膜瘤患者中GATA4的表達(dá)水平較高(P<0.05)。ZHOU等[5]報(bào)道GATA4在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào)，并通過調(diào)節(jié)Slug信號(hào)通路促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移能力。SU等[13]報(bào)道在胰腺癌中WDR3與GATA4相互作用激活Hippo信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。Slug及Hippo信號(hào)通路在正常發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)在腫瘤中也處于激活狀態(tài)，均促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展，因此筆者推測在良性腦膜瘤中GATA4可能通過調(diào)控Slug或Hippo等信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)，但是本課題組尚未對(duì)此進(jìn)行研究，仍需后續(xù)在細(xì)胞水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及探討。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)GATA4高表達(dá)的良性腦膜瘤患者復(fù)發(fā)率較高，是患者復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明GATA4可作為良性腦膜瘤預(yù)后判斷的參考指標(biāo)。

有研究顯示，GATA4和RUNX2共定位，并且GATA4通過在RUNX2啟動(dòng)子和增強(qiáng)子處維持染色質(zhì)開放，上調(diào)RUNX2表達(dá)水平，從而調(diào)控成人骨的形成[14]。RUNX2在乳腺癌和胃癌等多種腫瘤的疾病進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。RUNX2在胃癌早期高表達(dá)，并與患者臨床病理特征相關(guān)，RUNX2是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]。然而，RUNX2在良性腦膜瘤中的作用尚未闡明。本文研究結(jié)果顯示：腦膜瘤組織中RUNX2的表達(dá)水平顯著高于瘤旁組織(P<0.05)，提示RUNX2參與了腦膜瘤的發(fā)生、發(fā)展，可能與RUNX2的磷酸化水平增高相關(guān)，有研究報(bào)道RUNX2磷酸化后其活性增加促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲[8]。本研究結(jié)果中，RUNX2在腫瘤最大徑>0.5 cm、有瘤周水腫及Ki-67指數(shù)≥4%的良性腦膜瘤患者中的表達(dá)水平較高(P<0.05)，與RUNX2在胃癌中的研究具有一致性，在胃癌中RUNX2通過調(diào)節(jié)yes1相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(YAP1)發(fā)揮促癌作用[9]。YAP1作為Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵基因，在腦膜瘤的相關(guān)研究中被報(bào)道為促癌基因[15]，而GATA4也調(diào)控Hippo信號(hào)通路[13]，因此GATA4可能通過結(jié)合并調(diào)控RUNX2的表達(dá)，激活Hippo信號(hào)通路促進(jìn)良性腦膜瘤的進(jìn)展。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示良性腦膜瘤組織中GATA4和RUNX2的表達(dá)呈正相關(guān)，也能輔助證實(shí)該結(jié)論，但是具體的作用機(jī)制還需后續(xù)進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RUNX2高表達(dá)的良性腦膜瘤患者復(fù)發(fā)率較高，并且RUNX2高表達(dá)是良性腦膜瘤患者復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明檢測RUNX2的表達(dá)水平有助于良性腦膜瘤患者的隨訪管理。此外，本研究還顯示腫瘤最大徑>0.5 cm、有瘤周水腫及Ki-67指數(shù)≥4%均是良性腦膜瘤患者復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與BICZOK等[16]的研究具有一致性。

綜上所述，GATA4和RUNX2均在良性腦膜瘤中表達(dá)上調(diào)，并在腫瘤最大徑>0.5 cm、有瘤周水腫及Ki-67指數(shù)≥4%的患者中表達(dá)水平更高，兩者都是良性腦膜瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。