戴雨婷，鄭若曦，王 鶴，陳 俊，陳振沅，吳廣文

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，福建 福州 350122；3.中醫(yī)骨傷及運動康復教育部重點實驗室，福建 福州 350122）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的退行性疾病，膝關(guān)節(jié)因其承載全身負重而最為多發(fā)［1-2］。膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）的形成與人口老齡化、肥胖、不良生活習慣、錯誤運動方式、職業(yè)、外傷史、家族史等因素密切相關(guān)，在女性中更為多見，且發(fā)病群體出現(xiàn)年輕化趨勢［3］。以軟骨基質(zhì)進行性丟失為典型表現(xiàn)的軟骨退變是KOA發(fā)病的關(guān)鍵，軟骨基質(zhì)主要由以Ⅱ型膠原（CollagenⅡ）為主的各種膠原蛋白和以聚集蛋白聚糖（Aggrecan）為主的蛋白多糖構(gòu)成［4-5］，因此有效調(diào)控CollagenⅡ與Aggrecan 的合成和分解代謝是延緩軟骨退變的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）不但調(diào)控癌癥等疾病的發(fā)生，而且在OA 相關(guān)細胞中的表達存在差異性，對延緩KOA 發(fā)病具有重要調(diào)節(jié)作用［6-7］；微小RNA（micro RNA，miRNA）可通過調(diào)控膠原蛋白表達影響軟骨細胞的衰老與修復，這被認為是有效治療OA 的新工具［8-9］。研究表明，LncRNA H19 通過調(diào)控miR-675 可促進參與合成軟骨細胞相關(guān)蛋白的分泌，從而減緩KOA 進程［10］。榮筋拈痛方是挖掘陳可冀院士《清宮配方集成》基礎上擬定而成，前期研究發(fā)現(xiàn)榮筋拈痛方可通過多靶點、多途徑對KOA 大鼠起到一定的治療作用［11］，但其是否可通過調(diào)控LncRNA H19/miR-675 治療KOA 尚不明確。本研究構(gòu)建KOA 模型，通過觀察榮筋拈痛方對軟骨組織中LncRNA H19/miR-675 及下游CollagenⅡ、Aggrecan 表達水平的影響，旨在探討榮筋拈痛方延緩大鼠KOA 軟骨退變的作用機制，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級8 周齡雄性SD 大鼠46 只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2007-0011。

1.2 實驗藥物 榮筋拈痛方顆粒劑由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號：2006001）；鹽酸氨基葡萄糖膠囊由香港澳美制藥公司生產(chǎn)（批號：4170135）。參照“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值”［12］計算，大鼠給藥量是成人的6 倍。按照大鼠灌胃量為10 mL/kg，將1 袋榮筋拈痛方顆粒劑溶解于0.9%生理鹽水后定容至100 mL；將1 粒鹽酸氨基葡萄糖膠囊溶解于0.9%生理鹽水后定容至100 mL。

1.3 實驗試劑 Trizol（美國Thermo Fisher 公司）；無水乙醇（美國Sigma 公司）；氯仿（西隴科學股份有限公司）；異丙醇（中國國藥集團化學試劑公司）；Mir-XTMmiRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeScriptTMRT mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ試劑盒（日本Takara 公司）；AceQqPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.4 實驗儀器 全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；NanoDrop 2000 超微量分光光度計（美國Thermo 公司）；PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；7500 Fast實時熒光定量基因擴增儀（美國ABI公司）。

2 方 法

2.1 分組與造模 46 只SD 大鼠適用性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為空白組（13 只）與造模組（33 只）?？瞻捉M進行假手術(shù)處理，將膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切開1 cm 左右的皮膚與肌肉后隨即縫合，不打開關(guān)節(jié)腔；造模組采用改良Hulth 法構(gòu)建大鼠KOA 模型［13］，同時連續(xù)3 d 肌內(nèi)注射20 萬U 青霉素防止感染。造模2周后，隨機選擇2組中各3只大鼠拍攝膝關(guān)節(jié)MRI，鑒定造模是否成功。造模成功后，隨機將造模組大鼠分為模型組、治療組和對照組，每組各10 只。

2.2 藥物干預 治療組按1.9 g/（kg·d）予榮筋拈痛方顆粒藥液灌胃，對照組按0.15 g/（kg·d）予鹽酸氨基葡萄糖膠囊藥液灌胃，空白組與模型組予等量0.9%生理鹽水灌胃。每日灌胃2次，連續(xù)灌胃12周，每周稱取1 次體質(zhì)量調(diào)整灌胃量。

2.3 取材 連續(xù)干預12 周后，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，打開膝關(guān)節(jié)腔，剝離膝關(guān)節(jié)周圍的肌肉、韌帶等組織，分離右側(cè)脛骨平臺后迅速投入液氮中，隨后放入-80 ℃冰箱保存。

2.4 Real-time PCR 法檢測LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ、Aggrecan 基因表達水平

2.4.1 總RNA 提取 將各組右側(cè)脛骨平臺樣本從-80 ℃冰箱取出，收集軟骨組織并加入液氮研磨，采用Trizol 試劑盒提取各組總RNA，并于分光光度計檢測總RNA 濃度。

2.4.2 miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄與檢測 配置miRNA 逆轉(zhuǎn)錄體系10 μL：mRQ Enzyme Mix 1.25 μL，mRQ Buffer（2×） 5 μL，1 μg 總RNA 與DEPC 水共3.75 μL。反應條件：37 ℃ 1 h，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA 為模板，配置Real-time PCR 反應體系。① U6 反應體系：Mix（2×） 5 μL，ROX（50×）0.2 μL，U6-F 0.4 μL，U6-R 0.4 μL，cDNA 2 μL，DEPC水2 μL。② miR-675反應體系：Mix（2×） 5 μL，ROX（50×） 0.2 μL，miR-675 引物0.4 μL，mRQ3” Primer 0.4 μL，cDNA 2 μL，DEPC 水2 μL。擴增反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火34 s，共40 個循環(huán)，最后95 ℃ 15 s，60 ℃延伸1 min。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析miR-675 相對表達水平，引物序列見表1。

2.4.3 LncRNA/mRNA的逆轉(zhuǎn)錄與檢測 配置mRNA逆轉(zhuǎn)錄體系20 μL。① gDNA去除：gDNA Eraser 1 μL，gDNA Eraser Buffer （5×） 2 μL，1 μg總RNA與DEPC水共7 μL，離心后室溫靜置5 min。② Prime Script RT Enzyme MixⅠ1 μL，Prime Script Buffer （5×） 4 μL，RT Primer Mix 1 μL，DEPC 水4 μL。反應條件：37 ℃15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，配置Real-time PCR 反應體系：Mix（2×） 10 μL，ROX（50×） 0.4 μL，各指標正向引物（F）與反向引物（R）各0.4 μL，cDNA 1 μL，DEPC 水7.8 μL。擴增反應條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火34 s，共40 個循環(huán)，最后95 ℃ 15 s，60 ℃延伸1 min。以β-actin 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析LncRNA H19、CollagenⅡ、Aggrecan 基因相對表達水平。引物序列見表1。

表1 PCR 相關(guān)擴增引物序列

2.5 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料符合正態(tài)分布采用（±s）表示。當滿足正態(tài)分布時，運用單因素方差分析，若方差齊則運用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較，若方差不齊則運用Games-Howell 檢驗進行組間兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 實驗動物飼養(yǎng)情況 治療組有2 只大鼠在灌胃過程中可能因肺栓塞死亡。

3.2 膝關(guān)節(jié)MRI 結(jié)果 空白組大鼠膝關(guān)節(jié)整體結(jié)構(gòu)完整且無腫脹，內(nèi)外側(cè)半月板形態(tài)完好，關(guān)節(jié)腔間隙正常無積液，脛骨平臺與股骨髁軟骨的表面平整。造模組大鼠膝關(guān)節(jié)整體結(jié)構(gòu)不完整，腫脹明顯，內(nèi)側(cè)半月板缺失，關(guān)節(jié)腔間隙變寬且有積液累積，脛骨平臺與股骨髁軟骨的表面不平整，局部缺如，伴有結(jié)締組織增生與骨贅形成，以上結(jié)果表明大鼠KOA 模型建立成功。見圖1。

圖1 大鼠膝關(guān)節(jié)MRI 影像圖

3.3 4 組 大 鼠 軟 骨 組 織LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ和Aggrecan 基因表達水平比較 與空白組比較，模型組軟骨組織LncRNA H19、miR-675、Collagen Ⅱ和Aggrecan 基因水平均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，治療組和對照組軟骨組織LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ和Aggrecan 基因水平均明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 4 組大鼠軟骨組織LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ和Aggrecan 基因水平比較

4 討 論

KOA 臨床常表現(xiàn)為疼痛、腫脹、僵硬、關(guān)節(jié)屈伸不利、活動受限等，嚴重者會致畸、致殘，給患者和社會帶來嚴重的經(jīng)濟損失與生活負擔［14］。流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，40、60、80 歲以上人群患病率分別為38%、50%、80%［15-16］。局部使用非甾體類抗炎藥為目前KOA 的一線治療方法。與口服相比，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射配合糖皮質(zhì)激素治療是臨床常用的選擇，療效顯著且副作用?。?7］。但是非甾體類抗炎藥的廣泛使用存在患有心肌梗死的弊端，除此之外還存在胃腸道出血的毒副作用，具有一定程度的死亡率，嚴重危害患者的生命安全。手術(shù)治療因其較高的手術(shù)置換費用、術(shù)后并發(fā)癥、康復時間長等缺點不被晚期患者所采納［18-20］。因此，KOA 的防治已然成為公共健康的重大課題，研發(fā)療效明確，毒副作用少，能夠緩解甚至阻斷KOA 發(fā)展的新藥具有重大意義。

KOA 歸屬于中醫(yī)學“骨痹”范疇，骨痹實則為“虛證”“痿證”，治療的關(guān)鍵為扶正祛邪［21］。榮筋拈痛方由牛膝、當歸、獨活、羌活、防風、甘草組成，具有補肝腎、壯筋骨、祛風濕、止痹痛之功效。牛膝、當歸君臣相伍，補肝腎、壯筋骨，又兼活血，寓“治風先治血，血行風自滅”之意；獨活治下，羌活治上，與防風共行祛風、除濕、止痛之效，三者皆為佐藥；甘草緩急止痛，調(diào)和諸藥為使藥。榮筋拈痛方標本兼顧，對痹證日久、肝腎俱虛的膝骨關(guān)節(jié)炎具有治療作用［22］。前期研究可知，榮筋拈痛方具有抗炎鎮(zhèn)痛的效果，臨床可有效緩解KOA 癥狀［23］。其有效成分可通過促進膠原蛋白與蛋白多糖的合成參與軟骨基質(zhì)的合成，降低基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，參與軟骨基質(zhì)的分解，進一步利用促進軟骨細胞增殖、延緩軟骨細胞退變、抑制軟骨細胞凋亡的方式改變軟骨結(jié)構(gòu)［24-25］。除此之外，榮筋拈痛方可抑制炎癥因子分泌，對滑膜炎癥也具有一定的緩解作用［26］。

與少量的蛋白質(zhì)編碼基因不同，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）占人類基因組的大部分，研究發(fā)現(xiàn)其可參與調(diào)控細胞增殖、分化、代謝等全過程，是轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾的關(guān)鍵因子［27］。ncRNAs包括miRNA、LncRNA 和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）等［28］。miRNA 是一類長約20～22 個核苷酸的單鏈小RNA 分子。其在多種病理生理過程中起關(guān)鍵作用，一方面可直接結(jié)合靶基因mRNA 并使其降解，另一方面可抑制mRNA 的翻譯以調(diào)控基因表達［29］。研究發(fā)現(xiàn)在膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)的滑液中存在miRNA，且其表達穩(wěn)定，可根據(jù)滑液中不同miRNA的表達水平差異區(qū)分KOA 患者與正常人［30］。LncRNA 的長度＞200 nt，曾被認為不具有生物學功能，但目前發(fā)現(xiàn)其可通過參與修飾染色質(zhì)、激活或干擾轉(zhuǎn)錄、核內(nèi)運輸?shù)冗^程調(diào)控基因表達［31］。LncRNA 可通過多種途徑參與緩解KOA，如LncRNA通過調(diào)控MMP 和ADAMTS 影響軟骨機制的合成與分解代謝，LncRNA 參與調(diào)控軟骨細胞的增殖與凋亡，LncRNA 通過NF-κB 與MAPK 途徑參與調(diào)控炎癥反應，LncRNA 參與調(diào)控滑膜關(guān)節(jié)血管生成，LncRNA 通過調(diào)控自噬影響軟骨變性等［32］。通過基因調(diào)控網(wǎng)絡的深入研究，發(fā)現(xiàn)許多疾病中LncRNA和miRNA 之間存在相互作用和相互調(diào)控。LncRNA H19 最早是由Tilghman 實驗室發(fā)現(xiàn)的，其在小鼠胎兒肝臟中高表達，出生后下調(diào)，在控制細胞壽 命 過 程 中 扮 演 重 要 角 色［33］。LncRNA H19 是miRNA 前體轉(zhuǎn)錄物，miR-675 是其第1 個外顯子區(qū)域加工產(chǎn)生的衍生物，LncRNA 可以通過成為具有調(diào)控功能的miRNA 的前體發(fā)揮作用［34］。

CollagenⅡ?qū)浌切迯团c再生起到了重要作用，研究者往往通過增加CollagenⅡ的表達或者抑制其降解的角度來延緩KOA 的進展［35］。當Aggrecan 合成受到抑制時，關(guān)節(jié)軟骨會因失去滋養(yǎng)而出現(xiàn)軟骨基質(zhì)的損傷，最終發(fā)生骨關(guān)節(jié)退行性病變［36］。miR-675 對關(guān)節(jié)軟骨合成代謝起促進作用，能有效延緩KOA 進展［37］。研究表明沉默LncRNA H19 或者miR-675 時，CollagenⅡ表達水平顯著下調(diào)，過表達時則與之相反，但是否介導Aggrecan 的表達未曾報道［38-39］?？梢?，LncRNA H19/miR-675 表達水平的變化與軟骨基質(zhì)合成代謝密切相關(guān)［10，40］。

本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組中LncRNA H19、miR-675 及其調(diào)控的CollagenⅡ、Aggrecan 基因表達水平降低；經(jīng)過榮筋拈痛方與鹽酸氨基葡萄糖治療后，LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ、Aggrecan 基因表達水平升高，提示榮筋拈痛方可能通過上調(diào)LncRNA H19/miR-675 促進CollagenⅡ、Aggrecan 表達，從而延緩大鼠軟骨退變，起到治療KOA 的作用。