周佩濤，程炳霖，孫一寧，吳德華，陳宇翰

1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科，廣東 廣州 510515；2南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510515

放療已成為原發(fā)性肝癌綜合治療模式中的重要組成部分［1,2］。然而，在給予肝癌根治性放療劑量的同時(shí)，也存在誘發(fā)放射性肝?。≧ILD）的風(fēng)險(xiǎn)［3,4］。作為肝癌放射治療的常見并發(fā)癥，RILD組織學(xué)早期表現(xiàn)主要是急性放射性肝炎，晚期表現(xiàn)主要是放射性肝纖維化，嚴(yán)重的RILD 可致患者肝功能衰竭死亡［5,6］。因此，降低RILD發(fā)生率和減輕RILD程度是臨床實(shí)踐中提高肝癌放療效果的關(guān)注點(diǎn)之一。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類無游離5’端或3’端，核酸分子間以共價(jià)鍵形成單鏈閉合環(huán)狀的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物［7］。許多研究已證實(shí)circRNA與腫瘤、內(nèi)分泌、老化等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8-10］。circRNA可通過多種方式發(fā)揮作用，諸如參與調(diào)控親本基因表達(dá)，調(diào)控轉(zhuǎn)錄本可變剪切，作為miRNA海綿吸附小RNA（miRNA），直接與RNA結(jié)合蛋白（RBP）結(jié)合或充當(dāng)RBP的支架，甚至還可翻譯蛋白質(zhì)等［11,12］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)輻射誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞（HSC）炎性表型促進(jìn)RILD 發(fā)?。?3］。另外，輻射誘導(dǎo)HSC 的circRNA RSF1（hsa_circ_0023706）表達(dá)上調(diào)，其通過吸附miR-146a-5p促進(jìn)HSC的炎性表型［14］。此外，課題組前期預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)circRSF1 與人抗原R（HuR）蛋白有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，而HuR 蛋白已被證實(shí)參與調(diào)控一些炎癥相關(guān)的mRNA的表達(dá)或翻譯進(jìn)而影響炎癥免疫應(yīng)答的發(fā)生［15］。但目前尚未見circRSF1結(jié)合RBP發(fā)揮功能的相關(guān)研究報(bào)道。本研究揭示circRSF1可通過結(jié)合HuR蛋白并阻遏HuR與IκBα結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)NF-κB激活，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)HSC炎性表型的調(diào)控，豐富了相關(guān)發(fā)病調(diào)控機(jī)制。后續(xù)研究將進(jìn)一步探討circRSF1結(jié)合HuR介導(dǎo)炎癥通路激活在小鼠RILD模型中的調(diào)控作用，以期為RILD防治靶點(diǎn)的開發(fā)提供更多的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與照射

人HSC株LX2（廣州吉妮歐生物科技有限公司）在含有10%（V/V）胎牛血清（Gibco）的Dulbecco's Modified Eagle's培養(yǎng)基（DMEM;ph7.4）中培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照如下參數(shù)進(jìn)行單次8 Gy照射：6-MV X射線，劑量率300 cGy/min，細(xì)胞培養(yǎng)板下方置一塊1.5 cm補(bǔ)償膜，機(jī)架角旋轉(zhuǎn)至180°，源皮距設(shè)置為100 cm，射野大小依據(jù)照射細(xì)胞板數(shù)而定，一般不超過40 cm×40 cm。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

circRSF1過表達(dá)質(zhì)粒、circRSF1 siRNA和陰性對(duì)照（廣州吉賽生物），HuR過表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照（上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司），HuR siRNA、miR-146a-5p 模擬物和相應(yīng)陰性對(duì)照（廣州銳博生物技術(shù)有限公司）。參照說明書，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別將質(zhì)粒（1 μg）、siRNA或miR-146a-5p 模擬物(終濃度50 nmol/L)轉(zhuǎn)染入24孔板中的細(xì)胞。HuR 的特異性siRNA 序列為CAACAAGUCCCACAAAUAAUU，circRSF1 siRNA設(shè)計(jì)的目標(biāo)序列為CACAAAGGAACAGAAAGAA。

1.3 qRT-PCR

使用TRIzol reagent（Invitrogen）從細(xì)胞中提取RNA，應(yīng)用Prime Script RT試劑盒（Takara Bio，Shiga）合成cDNA，然后使用SYBR?Premix Ex Taq?（Takara）試劑盒在實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)（QuantStudio 6 Flex）進(jìn)行qRTPCR 檢測(cè)。引物序列見表1。使用GAPDH 作為circRNA或mRNA的檢測(cè)內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算基因表達(dá)。

表1 用于qRT-PCR的引物Tab.1 Primers for qRT-PCR

1.4 Western blot

使用含有苯甲基磺酰氟（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）的RIPA裂解液在冰上裂解提取蛋白。將蛋白質(zhì)萃取物轉(zhuǎn)移至10%～15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore）。經(jīng)過5%脫脂奶粉封閉1 h后，使用相應(yīng)一抗在4 ℃孵育過夜。本研究中使用的抗體包括anti-HuR（#12582）、anti-IκBα（#4814）、anti-nuclear factor-κB（NF-κB）p65（#8242）、anti-phospho-NF-κB p65（Ser536；#3033）和anti-GAPDH（#2118）均購(gòu)自Cell Signaling Technology。然后用辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗（Cell Signaling Technology）在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（BLT GelView 6000 Pro，廣州博鷺騰生物科技有限公司）對(duì)蛋白印跡進(jìn)行可視化。所有蛋白條帶以GAPDH作為檢測(cè)內(nèi)參。

1.5 RNApull down

利用Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down 試劑盒（Pierce Biotechnology）進(jìn)行RNA pull down 檢測(cè)。參照說明書，將與circRSF1互補(bǔ)的生物素化RNA探針或陰性對(duì)照探針與鏈霉親和素包被的磁珠在26 ℃下孵育30 min，生成包被的磁珠。將30 μL細(xì)胞裂解液用于制備RNA-蛋白結(jié)合反應(yīng)的混合物，部分細(xì)胞裂解液作為input。然后將混合物與探針包被的磁珠在4 ℃孵育30 min。將RNA 結(jié)合蛋白復(fù)合物洗脫后，采用Western blot分析下拉物中的蛋白。

1.6 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）

采用Magna RIP 試劑盒（Millipore）進(jìn)行RIP 檢測(cè)。參照說明書，將磁珠與5 μg抗兔IgG（Millipore）或5 μg抗HuR（#12582，Cell Signaling Technology）抗體混合，然后將細(xì)胞裂解液和RIP免疫沉淀緩沖液與磁珠-抗體復(fù)合物在4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。經(jīng)過蛋白酶Κ處理后，從免疫沉淀復(fù)合物中洗脫RNA，進(jìn)一步純化后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的差異比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HuR表達(dá)下調(diào)促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的HSC炎性表型

給予LX2細(xì)胞不同劑量X線照射后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，8 Gy誘導(dǎo)circRSF1表達(dá)上調(diào)最為顯著（P＜0.05，圖1A）。通過circRNA 研究網(wǎng)站CircInteractome (https://circinteractome.irp.nia.nih.gov/)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，circRSF1與HuR蛋白有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。相比非照射組，予8 Gy X線照射后LX2細(xì)胞的HuR表達(dá)無明顯改變（圖1B）。為明確HuR表達(dá)水平在輻射背景下對(duì)HSC功能的影響，本研究分別對(duì)LX2細(xì)胞敲低或過表達(dá)HuR后進(jìn)行照射。轉(zhuǎn)染HuR siRNA可顯著下調(diào)HuR和IκBα的表達(dá)，促進(jìn)NF-κB p65磷酸化和促炎因子（IL1-β、IL-6、TNF-α）生成（P＜0.05，圖1C）。相反，予LX2細(xì)胞過表達(dá)HuR后可上調(diào)HuR和IκBα的表達(dá)，抑制NF-κB p65磷酸化和促炎因子（IL1-β、IL-6、TNF-α）生成（P＜0.05，圖1D）。此外，過表達(dá)或敲低HuR對(duì)LX2細(xì)胞的circRSF1和活化指標(biāo)α-SMA的表達(dá)均無明顯影響（圖1C、D）。

圖1 改變HuR的表達(dá)對(duì)受照的HSC炎性表型和NF-κB激活的影響Fig.1 Effect of modifying the expression of HuR on inflammatory phenotype and NF-κB activation in irradiated HSCs.A:Expression of circRSF1 in LX2 cells with X ray irradiation at different doses(Gy).B:Expression of HuR in LX2 cells with or without irradiation.C:Effect of HuR knockdown on inflammatory phenotype and NF-κB activation in irradiated LX2 cells.D:Effect of HuR overexpression on inflammatory phenotype and NF-κB activation in irradiated LX2 cells.*P＜0.05 vs NIR or negative control (NC).NIR: Nonirradiation;si-NC:siRNAnegative control;OE-NC:Negative control overexpressing plasmid.

2.2 circRSF1過表達(dá)阻遏HuR與IκBα結(jié)合

為探討circRSF1是否通過HuR調(diào)控IκBα表達(dá)，本研究分別將circRSF1過表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染入LX2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)或敲低circRSF1對(duì)HuR表達(dá)均無影響（圖2A）。RNA pull down 和Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)circRSF1能與HuR蛋白結(jié)合，且circRSF1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了HuR蛋白與circRSF1結(jié)合（圖2B）。RIP和qRTPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HuR蛋白能與circRSF1結(jié)合，且circRSF1 表達(dá)上調(diào)，結(jié)合在HuR 蛋白的circRSF1 明顯增多，而結(jié)合在HuR 蛋白的IκBα mRNA 明顯減少（P＜0.05，圖2C）。將circRSF1 過表達(dá)質(zhì)粒和或miR-146a-5p 模擬物轉(zhuǎn)染入LX2 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)circRSF1 和或miR-146a-5p 表達(dá)上調(diào)對(duì)HuR 蛋白表達(dá)無影響，circRSF1過表達(dá)可抑制IκBα的表達(dá)，而miR-146a-5p則無此效應(yīng)（圖2D）。

圖2 circRSF1與HuR結(jié)合的驗(yàn)證Fig.2 Verification of the binding between circRSF1 and HuR.A: Effect of knockdown or overexpression of circRSF1 on HuR expression.B:Interaction between HuR protein and circRSF1 detected by RNA pull-down assay.C:Interaction of HuR protein with circRSF1 and IκBα detected by RIP assay.D: Effect of overexpression of circRSF1 and/or miR-146a-5p on expressions of HuR and IκBα.*P＜0.05 vs corresponding negative control.si-circNC:Negative control siRNA for circRSF1;si-circRSF1:Specific siRNAagainst circRSF1;pLCDH:pLCDH-ciR vector.

2.3 抑制circRSF1表達(dá)對(duì)HSC的抑炎效應(yīng)可被HuR敲低逆轉(zhuǎn)

將circRSF1 siRNA聯(lián)合HuR siRNA共轉(zhuǎn)染HSC后予照射，結(jié)果顯示敲低circRSF1 抑制HSC 生成IL1-β、IL-6、TNF-α，而予聯(lián)合敲低HuR則可上調(diào)HSC的促炎因子（P＜0.05，圖3A）。敲低circRSF1導(dǎo)致IκBα表達(dá)上調(diào)和NF-κB p65磷酸化減少，予聯(lián)合敲低HuR后則可下調(diào)IκBα表達(dá)和促進(jìn)NF-κB p65磷酸化（P＜0.05，圖3B）。

圖3 聯(lián)合敲低circRSF1與HuR的表達(dá)對(duì)受照的HSC炎性表型和NF-κB激活的影響Fig.3 Effect of knockdown of circRSF1 and HuR on inflammatory phenotype(A)and NF-κB activation(B)in irradiated HSCs.*P＜0.05 vs corresponding negative control.#P＜0.05 vs si-circRSF1 group.

2.4 上調(diào)circRSF1表達(dá)對(duì)HSC的促炎效應(yīng)可被HuR過表達(dá)逆轉(zhuǎn)

將circRSF1過表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合HuR過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HSC后予照射，結(jié)果顯示circRSF1過表達(dá)促進(jìn)HSC生成IL1-β、IL-6、TNF-α，而予聯(lián)合過表達(dá)HuR則可抑制HSC的促炎因子生成（圖4A）。circRSF1過表達(dá)抑制IκBα表達(dá)和促進(jìn)NF-κB p65磷酸化，而予聯(lián)合過表達(dá)HuR后則可上調(diào)IκBα表達(dá)和抑制NF-κB p65磷酸化（P＜0.05，圖4B）。

圖4 聯(lián)合過表達(dá)circRSF1與HuR對(duì)受照的HSC炎性表型和NF-κB激活的影響Fig.4 Effect of overexpression of circRSF1 and HuR on inflammatory phenotype (A) and NF-κB activation(B)in irradiated HSCs.*P＜0.05 vs corresponding negative control.#P＜0.05 vs circRSF1 group.

3 討論

circRNA可以與不同的RNA結(jié)合蛋白結(jié)合形成特定的復(fù)合物，隨后影響相關(guān)蛋白的作用模式［16-18］。本研究通過預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)circRSF1與HuR蛋白有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。HuR，又稱類胚胎致死性異常視覺蛋白1，該蛋白可特異性地結(jié)合靶mRNA 3'非翻譯區(qū)(3'UTR)中的AU富集元件，通過提高靶mRNA的穩(wěn)定性和或翻譯效率而上調(diào)靶基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平［19］。相反，circRNA則可通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HuR導(dǎo)致HuR靶mRNA的穩(wěn)定性下降和表達(dá)下調(diào)，例如，circDLC1 可與HuR 結(jié)合，減少HuR 與MMP1 mRNA 的相互作用，從而抑制MMP1 mRNA的表達(dá)，最終抑制肝癌進(jìn)展［20］。本研究也發(fā)現(xiàn)circRSF1與HuR結(jié)合后減少HuR與IκBα mRNA的結(jié)合，導(dǎo)致IκBα mRNA 表達(dá)下調(diào)。部分circRNA 結(jié)合HuR后并不影響靶mRNA的表達(dá)，但可下調(diào)靶mRNA的翻譯效率導(dǎo)致靶蛋白生成減少。據(jù)報(bào)道，circ-PABPN1 與HuR 的結(jié)合能阻止HuR 與PABPN1、Atg16l1 mRNA的結(jié)合并減少這些mRNA的翻譯［21,22］。另有研究顯示，circPPM1F 與HuR 的競(jìng)爭(zhēng)性相互作用導(dǎo)致PPM1F的翻譯受阻，從而減輕PPM1F對(duì)NF-κB途徑的抑制作用［23］。結(jié)合本研究結(jié)果和既往報(bào)道表明，circRNA能夠作為HuR蛋白的“海綿”，阻遏HuR與其靶基因的結(jié)合進(jìn)而影響靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展。另外，與本研究結(jié)果不同的是，也有部分研究報(bào)道circRNA可以作為HuR的蛋白支架，協(xié)助HuR調(diào)控靶基因的表達(dá)［24］。如，circTICRR通過結(jié)合HuR蛋白進(jìn)而穩(wěn)定GLUD1 mRNA并升高GLUD1蛋白的水平，促進(jìn)宮頸癌增殖［25］。circEIF3H可作為HuR的支架來調(diào)節(jié)HSPD1，RBM8A和G3BP1的mRNA穩(wěn)定性，促進(jìn)三陰性乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移［26］。另有研究報(bào)道circStag1 與HuR相互作用并促進(jìn)HuR易位到細(xì)胞質(zhì)中，高細(xì)胞質(zhì)水平的HuR通過穩(wěn)定和增強(qiáng)β-連環(huán)蛋白表達(dá)，導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的激活，從而刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化［27］。我們推測(cè)circRNA與HuR蛋白的互作方式可能與不同的疾病背景有關(guān)，在不同條件下，circRNA可充當(dāng)RBP“海綿”或支架發(fā)揮不同的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，在輻射背景下，沉默HuR的表達(dá)可促進(jìn)HSC生成炎性因子。相關(guān)研究已證實(shí)，HuR蛋白通過調(diào)控炎癥通路相關(guān)調(diào)節(jié)因子的mRNA的穩(wěn)定性和或翻譯進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)的發(fā)生。如，HuR 通過提高NΚRF mRNA的穩(wěn)定性并上調(diào)NΚRF的表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路，減少退行性髓核細(xì)胞中的炎癥和胞外基質(zhì)降解［28］。再有，HuR的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)GILZ的翻譯，進(jìn)而抑制NF-κB活化，導(dǎo)致炎癥因子生成減少［29］。另一項(xiàng)研究顯示HuR 能特異性結(jié)合IκBα mRNA 的3'UTR調(diào)控IκBα表達(dá)；HuR過表達(dá)或敲低可分別上調(diào)或下調(diào)IκBα蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響NF-κB的表達(dá)［30］。本研究發(fā)現(xiàn)circRSF1與HuR結(jié)合后使HuR與IκBα mRNA的結(jié)合減少，導(dǎo)致IκBα蛋白表達(dá)下調(diào)進(jìn)而促進(jìn)NF-κB活化，增加促炎因子生成，此效應(yīng)可被HuR過表達(dá)逆轉(zhuǎn)，表明circRSF1通過阻遏HuR的功能發(fā)揮從而促進(jìn)炎癥通路激活。

綜上所述，HuR增強(qiáng)IκBα表達(dá)并抑制NF-κB通路激活，減輕HSC受照后的炎性表型，而circRSF1通過結(jié)合HuR降低IκBα表達(dá)，促進(jìn)HSC受照后的炎性表型。本研究在前期闡明circRSF1能夠作為miRNA海綿的基礎(chǔ)上進(jìn)一步揭示circRSF1能夠結(jié)合RBP發(fā)揮調(diào)控功能，豐富了circRNA在RILD發(fā)病過程中的調(diào)控機(jī)制。然而，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)無法模擬體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境，因而后續(xù)研究需要在動(dòng)物體內(nèi)和臨床實(shí)踐中進(jìn)一步驗(yàn)證。體外實(shí)驗(yàn)初步探索的機(jī)制和靶點(diǎn)為后續(xù)開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了研究方向和轉(zhuǎn)化目的。如何實(shí)現(xiàn)HSC的靶向給藥以及防止核酸類藥物的體內(nèi)降解等問題均是我們后續(xù)開展在體研究和臨床轉(zhuǎn)化的重要關(guān)注點(diǎn)。