李晶晶，楊 子，崔 騰，周國羊，王祎宸，左蘆根，張小鳳

克羅恩病(Crohn′s disease,CD)是一種以腸道慢性復(fù)發(fā)性炎癥為主要病理改變的炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)[1]。近年來CD在我國的發(fā)病率不斷攀升，已然成為消化系統(tǒng)常見的難治性疾病[2]。藥物治療是CD的主要治療方式，然而遺憾的是當(dāng)前用于臨床治療的藥物多存在藥效不佳、藥物抵抗、藥物不耐受或不良反應(yīng)較大等不足，因此尋找新的、更為有效的抗腸炎藥物是當(dāng)前CD研究領(lǐng)域亟需解決的問題[3]。長春胺(vincamine，VC)是一種從夾竹桃植物長春花中所提取出的一種天然小分子化合物(分子式：C21H26N2O3；分子量：354.443)，被報(bào)道具有拮抗炎癥、細(xì)胞保護(hù)等多種生物學(xué)功能[4-5]，但其是否能夠影響CD腸炎尚不明確。本研究擬以2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎作為CD模型，觀察VC干預(yù)對(duì)CD樣結(jié)腸炎的作用效果，并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等方式探索VC可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組、干預(yù)和取檢 將24只雄性Wild-type(WT)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(WT組)、模型組(TNBS組)和VC干預(yù)組(VC組)，每組8只。TNBS組和VC組小鼠接受TNBS(Sigma，USA)造模處理，小鼠麻醉(1% 戊巴比妥鈉)后，肛門涂抹石蠟油，置入軟質(zhì)肛管并注入0.1 mL的2.5% TNBS乙醇溶液，頭低足高45°傾斜體位15 min后復(fù)位[6]。造模當(dāng)天，將VC(Topscience,China)于1% 吐溫80中溶解，并以40 mg·kg-1·d-1的量對(duì)VC組小鼠進(jìn)行灌胃處理[7]，TNBS組和WT組接受等量的1% 吐溫80灌胃。連續(xù)干預(yù)一周后采用脫頸法處死小鼠，留取小鼠結(jié)腸組織分別-80 ℃凍存和福爾馬林固定。每日記錄小鼠腹瀉、稀便等腸炎癥狀；實(shí)驗(yàn)前和取檢前稱量小鼠體質(zhì)量；于取檢時(shí)測(cè)量各組小鼠的結(jié)腸長度。

1.2 小鼠腸炎的臨床癥狀、病理組織學(xué)和炎癥介質(zhì)水平評(píng)估 小鼠腸炎癥狀采用腸炎疾病活動(dòng)度(disease activity index，DAI)量表進(jìn)行評(píng)估，評(píng)分范圍為0～5分，分值高代表腸炎癥狀重[8]。小鼠腸炎病理組織學(xué)評(píng)估依據(jù)蘇木精/伊紅(HE)染色結(jié)果，參照Spencer推薦的腸炎組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，評(píng)分范圍為0～4分，分?jǐn)?shù)越高代表腸炎越重[9]。另取冰凍結(jié)腸組織，充分研磨后，依據(jù)產(chǎn)品說明書采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)結(jié)腸黏膜炎癥因子水平，包括：腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)。

1.3 Western blotting檢測(cè)結(jié)腸組織中p-p65、p65及TLR4蛋白表達(dá)情況 小鼠結(jié)腸組織于稱重后置于RIPA裂解液中充分研磨震蕩，并使用高速離心機(jī)分離上清。經(jīng)BCA法檢測(cè)目標(biāo)蛋白濃度后，依次進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉、孵育一抗(anti-TLR4，anti-p-p65，anti-p65，anti-β-actin)及二抗；再經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，凝膠成像儀顯影，最后使用ImageJ軟件分析目的條帶的灰度值并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。Western blotting檢測(cè)所用抗體均購買于美國Abcam公司。

1.4 預(yù)測(cè)VC治療CD的潛在靶點(diǎn) 將從PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得VC SMILE式，輸入SuperPred數(shù)據(jù)庫(https：//prediction.charite.de/subpages/target_predicton.php)中，得到VC的潛在作用靶點(diǎn)，并通過Uniprot網(wǎng)站(https：//www.uniprot.org/)進(jìn)行基因名稱轉(zhuǎn)換。利用DisGeNet數(shù)據(jù)庫(https：//www.disgenet.org/)檢索與CD相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。將篩選得到的VC潛在作用靶點(diǎn)及CD相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1 在線工具(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，繪制韋恩圖，并得到二者交集靶點(diǎn)基因。

1.5 構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https：//cn.string-db.org/)構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，選擇“Multiple proteins”，物種設(shè)為“Homo sapiens”，獲取蛋白與蛋白之間的互作信息，并將文件導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。

1.6 GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋及通路分析，選定物種為智人(homo spaiens)，并將GO分析篩選出的生物過程、分子功能、細(xì)胞成分以及KEGG富集的通路進(jìn)行可視化處理。

1.7 分子對(duì)接模擬驗(yàn)證 在PDB 數(shù)據(jù)庫中下載靶點(diǎn)蛋白及3D 結(jié)構(gòu)pdb 格式文件，在PubChem 數(shù)據(jù)庫中下載VC 2D 結(jié)構(gòu)sdf 格式，通過Open Babel GUI軟件轉(zhuǎn)換得到VC的pdb 格式文件。采用AutoDock 4.2.6軟件進(jìn)行VC與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接并計(jì)算其結(jié)合能。利用PyMOL軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量改變、DAI評(píng)分和結(jié)腸長度比較 VC干預(yù)后，VC組小鼠體質(zhì)量下降幅度高于TNBS組(P<0.05)，但仍低于WT組(P<0.05)；VC組小鼠DAI評(píng)分低于TNBS組(P<0.05)；VC組小鼠結(jié)腸長度長于TNBS組(P<0.05)，但仍短于WT組(P<0.05)(見表1)。

表1 小鼠體質(zhì)量改變、DAI評(píng)分和結(jié)腸長度比較

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織學(xué)炎癥評(píng)分比較 HE染色結(jié)果顯示，WT小鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，TNBS組小鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤和聚集，而VC組小鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)僅見少量的炎癥細(xì)胞浸潤。同時(shí)，VC組小鼠結(jié)腸組織學(xué)炎癥評(píng)分低于TNBS組(P<0.05)(見圖1、表2)。

表2 小鼠結(jié)腸組織學(xué)炎癥評(píng)分比較

2.3 各組小鼠結(jié)腸黏膜炎癥介質(zhì)水平比較 ELISA結(jié)果顯示，VC組小鼠結(jié)腸黏膜炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平低于TNBS組(P<0.05)，但仍高于WT組(P<0.05)(見表3)。

表3 小鼠腸黏膜炎癥介質(zhì)水平比較

2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)VC作用靶點(diǎn)和PPI網(wǎng)絡(luò)分析 通過SuperPred數(shù)據(jù)庫共獲得VC 110個(gè)作用靶點(diǎn)。通過DisGeNet數(shù)據(jù)庫檢索到CD相關(guān)疾病靶點(diǎn)1 382個(gè)，將兩者取交集后共獲得VC治療CD的潛在作用靶點(diǎn)31個(gè)(見圖2A)。將上述31個(gè)交集靶點(diǎn)錄入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，并得到蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，共涉及到31個(gè)節(jié)點(diǎn)，70條邊。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，Degree值是評(píng)價(jià)網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)貢獻(xiàn)程度的重要參數(shù)，根據(jù)其數(shù)值大小篩選出排名靠前的關(guān)鍵靶點(diǎn)，數(shù)值越大，提示靶點(diǎn)的貢獻(xiàn)度越高。根據(jù)Degree值篩選出拓?fù)鋮?shù)排名前10的靶蛋白，其中TLR4、CHUK、STAT3、PTGS2、NFKB1、HIF1A 之間的相互作用關(guān)系最為密切(見圖2B、表4)。

2.5 GO和KEGG富集分析 對(duì)31個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示VC治療CD主要涉及82個(gè)生物過程條目、18個(gè)細(xì)胞組分條目和19個(gè)生物分子條目。其中生物過程條目主要涉及炎癥反應(yīng)等；分子功能條目主要涉及酶結(jié)合等；細(xì)胞組分條目則集中于細(xì)胞膜、細(xì)胞表面等(見圖3A、B、C)。KEGG通路富集分析得到82條可能相關(guān)的通路，選擇前20條進(jìn)行可視化處理(見圖3D)。其中NF-κB通路與炎癥反應(yīng)進(jìn)程最為相關(guān)，且TLR4為VC作用于CD的關(guān)鍵靶點(diǎn)，因此我們推測(cè)VC可能通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路改善TNBS小鼠CD樣結(jié)腸炎。

表4 VC治療CD的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息表

2.6 分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證VC作用靶點(diǎn) 選取NF-κB信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)TLR4、PTGS2、NFKB1分別與VC進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證(見圖4)。采用結(jié)合能評(píng)價(jià)小分子藥物和大分子蛋白的結(jié)合情況：若結(jié)合能小于0 kcal/mol，表明VC能與該蛋白可進(jìn)行自發(fā)結(jié)合；結(jié)合能絕對(duì)值越大，表明發(fā)生結(jié)合作用的可能性越大。分子對(duì)接結(jié)果顯示，VC與以上3個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于0 kcal/mol(見表5)，證明VC與TLR4、PTGS2、NFKB1具有較強(qiáng)的結(jié)合力。以上結(jié)果提示VC可能通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮改善TNBS小鼠CD樣結(jié)腸炎作用。

表5 分子對(duì)接結(jié)果

2.7 在體驗(yàn)證VC對(duì)TNBS模型小鼠TLR4/NF-κB信號(hào)的調(diào)控作用 Western blotting分析顯示，VC組小鼠結(jié)腸黏膜組織中TLR4和p-p65水平較TNBS組降低(P<0.05)，但仍高于WT組(P<0.05)(見圖5、表6)。

表6 小鼠結(jié)腸黏膜p-p65和TLR4蛋白水平比較

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)天然植物化合物VC可顯著改善TNBS模型小鼠的腸道炎癥癥狀、組織學(xué)損傷并抑制腸黏膜促炎介質(zhì)水平，這可能與其調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)有關(guān)。

我們以TNBS模型小鼠為研究對(duì)象，其具有與人類CD相似的腸炎癥狀[10]。隨著腸炎進(jìn)展，體質(zhì)量減輕，DAI評(píng)分增加及結(jié)腸縮短是CD模型小鼠基本的臨床表現(xiàn)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，VC干預(yù)同時(shí)緩解了TNBS模型小鼠體質(zhì)量減輕，DAI評(píng)分增加以及結(jié)腸縮短等臨床癥狀，提示VC具有保護(hù)TNBS模型小鼠腸道炎癥的潛力。同時(shí)，HE染色發(fā)現(xiàn)，VC顯著抑制了TNBS模型小鼠結(jié)腸黏膜組織中炎癥細(xì)胞的浸潤和聚集；且基于HE染色對(duì)各組小鼠結(jié)腸進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，VC組小鼠呈現(xiàn)比TNBS組更低的炎癥評(píng)分。此外，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，TNBS模型小鼠結(jié)腸黏組織中促炎介質(zhì)水平(TNF-α、IL-1β、IL-6)經(jīng)VC作用后得到了顯著降低。因此，我們的研究分別從腸炎臨床癥狀、組織病理學(xué)及分子水平三個(gè)層面共同證實(shí)了VC在體干預(yù)對(duì)TNBS模型小鼠的CD樣腸道炎癥具有保護(hù)作用。新近研究[5]表明，VC不僅可保護(hù)人類角膜上皮細(xì)胞免受脂多糖(LPS)的炎性損傷，還對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷具有緩解作用[7]，而我們的研究不僅進(jìn)一步證實(shí)了VC的抗炎作用，同時(shí)拓展了其疾病應(yīng)用領(lǐng)域。

接下來，我們嘗試探討VC緩解CD樣腸炎的可能分子機(jī)制。通過SuperPred和DisGeNet數(shù)據(jù)庫篩選得到VC治療CD的潛在作用靶點(diǎn)31個(gè)，并對(duì)其進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果表明VC主要參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控過程，且提示TLR4/NF-κB通路可能在VC治療CD腸炎過程中扮演重要角色；此外，分子對(duì)接顯示VC與TLR4、PTGS2及NFKB1均具有較穩(wěn)定的結(jié)合力。以上結(jié)果證明VC對(duì)TLR4/NF-κB通路具有潛在的調(diào)控作用。既往研究[12-13]表明，TLR4/NF-κB是調(diào)控炎癥的關(guān)鍵信號(hào)通路，且與CD腸炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，我們采用Western blotting技術(shù)對(duì)各組小鼠結(jié)腸黏膜中TLR4和p-p65的水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示VC干預(yù)可顯著抑制TNBS模型小鼠結(jié)腸黏膜組織中TLR4和p-p65的水平。以上結(jié)果提示，VC可能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)發(fā)揮緩解TNBS模型小鼠CD樣結(jié)腸炎作用。相關(guān)研究顯示，VC還可通過調(diào)控其他條信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)保護(hù)作用。例如，在腎缺血/再灌注損傷模型中，VC可通過抑制MAPK和凋亡信號(hào)通路緩解泮托拉唑誘導(dǎo)的腎組織損傷[4]；在三苯氧胺誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，VC可通過抑制JNK/ERK通路發(fā)揮抑制小鼠肝臟組織的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[14]。我們的研究進(jìn)一步豐富了VC發(fā)揮生物學(xué)功能的可能分子機(jī)制。

盡管手術(shù)可切除病變腸管，但無法治愈CD，因此藥物治療對(duì)緩解CD進(jìn)步進(jìn)展至關(guān)重要[15]。當(dāng)前以TNF-α單抗為代表的CD治療藥物盡管取得了一定的療效，但均存在不同程度的局限性，因此探尋更為安全有效的CD治療藥物是當(dāng)前亟需解決的難題[16]。近年來，天然植物提取物的藥用價(jià)值受到學(xué)術(shù)界關(guān)注，其應(yīng)用于炎癥性疾病的治療成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[17-18]。VC作為一種天然的小分子化合物[4]，我們基于其強(qiáng)大的抗炎和細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，進(jìn)一步證明了VC對(duì)CD樣腸炎具有保護(hù)作用，提示其具有潛在的藥物開發(fā)及應(yīng)用價(jià)值，有望為CD治療藥物的選擇提供新的參考。

本研究還存在不足之處：一方面，鑒于VC的生物學(xué)功能尚未得到完全揭示，本研究僅證明了VC對(duì)CD樣腸炎具有保護(hù)作用，但具體的功能學(xué)途徑仍有待進(jìn)一步探究。另一方面，TLR4/NF-κB通路只能在一定程度上解釋VC緩解CD樣腸炎的可能機(jī)制，但不能排除其他信號(hào)通路的可能。

綜上，VC可能通過抑制TLR4/NF-κB通路發(fā)揮緩解TNBS小鼠CD樣腸道炎癥的作用。