劉迪迪，陸 莉，楊燕青，王鳳超

NLRP3炎癥小體是一個多聚蛋白復(fù)合物，由NLRP3、ASC和Pro-caspase-1蛋白組成，可識別病原微生物和多種危險信號[1-2]。其活化后介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18的成熟與分泌，在抗感染免疫和多種人類炎性相關(guān)疾病，如痛風(fēng)、2型糖尿病、阿爾茨海默病等中發(fā)揮重要作用[3-4]。目前，NLRP3炎癥小體相關(guān)炎性疾病的治療策略主要針對NLRP3炎癥小體活化后的產(chǎn)物如IL-1β，但此方法無法治療NLRP3炎癥小體活化后IL-18分泌和細(xì)胞焦亡導(dǎo)致的疾病，且易影響細(xì)胞其他生理功能，存在較多弊端[5]。靶向抑制NLRP3炎癥小體活化成為治療相關(guān)炎性疾病的新策略，多種NLRP3炎癥小體抑制劑表現(xiàn)出良好效果[6-9]，但還難以應(yīng)用于臨床。桑黃酮是具有抗炎抗氧化中草藥桑枝中的主要活性成分，已被證實(shí)在神經(jīng)炎癥上有明顯抑制作用[10-11]，但其能否抑制NLRP3炎癥小體活化并緩解相關(guān)炎性疾病有待證明。本文旨在探究桑黃酮對NLRP3炎癥小體活化及其相關(guān)炎性疾病的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及細(xì)胞系 SPF級C57BL/6(B6)雄性小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。造模時體質(zhì)量22～24 g，鼠齡7～10周，在無特定病原體(SPF)條件下飼養(yǎng)。人急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞系，受贈于蚌埠醫(yī)學(xué)院汪洪濤教授課題組。本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(審批號：倫動科批字[2020]第057號)。

1.2 藥品及主要試劑 桑黃酮(Mul，上海陶素生化公司，貨號：TQ0161)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)(中國novoprotein公司，貨號：CB34)、PMA(SIGMA公司，貨號：79346)、脂多糖(LPS)(Invivogen公司，貨號：tlrl-eklps)、尼日利亞菌素(Nigericin ，SIGMA公司，貨號：N7143)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(SIGMA公司，貨號：A2383)、紅細(xì)胞裂解液(碧云天公司，貨號：C3702)、PBS(Servicebio公司，貨號：G0002)、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號：C11965500BT)、RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號：C11875500BT)、ELISA試劑盒[小鼠IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF-α)、人IL-1β ELISA kit，購自R&D公司]、Western blotting抗體[抗小鼠Caspase-1(p20)，購自AdipoGen公司；抗人Caspase-1(p20)，購自CST公司；β-actin抗體，為Abmart公司產(chǎn)品；山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG，購自Jackson IR公司]。

1.3 儀器 Thermo3543 CO2培養(yǎng)箱(美國ThermoFisher)；Western blotting電泳轉(zhuǎn)膜槽(美國BIO-RAD)；ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國BIO-RAD)；SCI100MiniH恒溫金屬浴(中國SCILOGEX)；CH20 BIMF200倒置顯微成像儀(日本OLYMPUS)；MultiskanSky多功能酶標(biāo)儀(美國ThermoFisher)；5810R大容量低溫離心機(jī)(德國eppendorf)；D3024R控溫離心機(jī)(中國SCILOGEX)。

1.4 方法

1.4.1 藥物及試劑的配制 桑黃酮25 mg，溶于DMSO，配制為50 mmol/L貯存液，分裝凍存于-80 ℃冰箱，動物實(shí)驗(yàn)時用PBS稀釋桑黃酮貯存液，按照25 mg/kg體質(zhì)量的劑量，每只鼠腹腔注射0.2 mL。單鈉尿酸鹽(MSU)制備：每1.68 g粉末溶于500 mL的0.01 mol/L NaOH溶液中，加熱至70 ℃溶解，0.22 μm濾器過濾后室溫下使MSU晶體重新析出。再用無水乙醇洗晶體并高壓滅菌后烘干，無菌PBS重懸晶體至50 μg/μL，并用超聲儀震蕩過夜，顯微鏡下觀察MSU晶體大小并確認(rèn)其可以進(jìn)入細(xì)胞，分裝凍存于-20 ℃冰箱。LPS：溶于無菌PBS，配置為5 mg/mL貯存液，分裝凍存于-80 ℃冰箱，動物實(shí)驗(yàn)時用PBS稀釋，按照20 mg/kg體質(zhì)量的劑量，每只鼠腹腔注射0.3 mL。

1.4.2 細(xì)胞刺激前分化 麻醉下處死小鼠取小鼠后腿，無菌分離腿骨骨髓細(xì)胞。加入M-CSF(50 ng/mL)，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱分化5～7 d。培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁細(xì)胞即為實(shí)驗(yàn)所需骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDM)。人THP-1細(xì)胞，加入PMA(400 ng/mL)培養(yǎng)過夜，使得原始THP-1細(xì)胞分化為可實(shí)驗(yàn)用巨噬細(xì)胞。

1.4.3 NLRP3炎癥小體刺激 已分化的BMDM或THP-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。加入LPS(100 ng/mL)預(yù)刺激3 h，加入桑黃酮30 min后，分別加入不同的NLRP3炎癥小體激動劑刺激相應(yīng)時間(Nigericin、ATP刺激約30 min，MSU刺激約3 h)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清至EP管中待用，向12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入細(xì)胞裂解液，裂解5 min，轉(zhuǎn)入EP管中待用。

1.4.4 Western blotting 細(xì)胞上清需利用甲醇和氯仿抽提蛋白，最后加入上樣緩沖液裂解；細(xì)胞直接用上樣緩沖液裂解。裂解液金屬浴101 ℃煮10 min，后經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉1 h，一抗caspase-1(p20)(1∶1 000稀釋)，4 ℃搖床過夜，PBST洗3次，相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h，PBST洗3次，加底物顯色，并用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光拍照。

1.4.5 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6以及小鼠腹腔液及血清中IL-1β及TNF-α表達(dá)水平 按試劑盒說明書在96孔ELISA板中進(jìn)行，PBS稀釋包被抗體(1∶200稀釋)室溫過夜孵育，PBST洗3次，10%血清封閉1 h，PBST洗3次，加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品室溫孵育2 h，PBST洗3次，檢測抗體(1∶100稀釋)孵育1 h，PBST洗3次，HRP(1∶50稀釋)孵育30 min，PBST洗5次，加入底物顯色，10%硫酸終止，酶標(biāo)儀在450 nm讀數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中細(xì)胞因子濃度。

1.4.6 模型制備與給藥 SPF級C57BL/6小鼠飼養(yǎng)至7～10周，小鼠體質(zhì)量約22～24 g，稱量體質(zhì)量。(1)隨機(jī)分為安慰劑組(PBS組)(3只)、感染性休克組(LPS組)(6只)、桑黃酮干預(yù)組(LPS+Mul組)(6只)，桑黃酮干預(yù)組提前1 h腹腔注射桑黃酮溶液0.2 mL，劑量50 mg/kg體質(zhì)量，再對LPS組和LPS+Mul組同時腹腔注射LPS(20 mg/kg)溶液0.3 mL。LPS注射4 h后，眼球取血，分離血清，頸椎脫臼處死小鼠并收集灌洗液。(2)隨機(jī)分為安慰劑組(PBS組)(5只)、感染性休克組(LPS組)(10只)、桑黃酮干預(yù)組(LPS+Mul組)(10只)，桑黃酮干預(yù)組腹腔注射桑黃酮溶液0.2 mL(50 mg/kg)，1 h后，感染性休克組和桑黃酮干預(yù)組同時腹腔注射0.3 mL LPS(20 mg/kg)。觀察并記錄小鼠生存時間。

1.4.7 小鼠腹腔灌洗液收集 處死小鼠，剪開小鼠腹部外皮，用1 mL胰島素注射針注射1 mL無菌PBS入小鼠腹腔，用手指對小鼠腹部進(jìn)行2 min按摩，用25 G針頭配合1 mL注射器管，吸出腹腔液，離心，上清用于ELISA檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)和生存曲線分析(Log-Rank檢驗(yàn))。

2 結(jié)果

2.1 桑黃酮抑制尼日利亞菌素誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化 Western blotting及ELISA結(jié)果顯示，桑黃酮可劑量依賴地抑制尼日利亞菌素誘導(dǎo)的Caspase-1(p20)表達(dá)及IL-1β的分泌(P<0.01)(見圖1、表1)，但非炎癥小體相關(guān)的細(xì)胞因子TNF-α和IL-6分泌差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表1 桑黃酮對Nigericin刺激的BMDM細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響

表2 桑黃酮對Nigericin刺激的BMDM細(xì)胞TNF-α和IL-6表達(dá)的影響

2.2 桑黃酮抑制多種刺激劑誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化 除Nigericin外，多種病原菌和危險信號均可引起NLRP3炎癥小體活化如MSU、ATP等。結(jié)果顯示桑黃酮明顯抑制Nigericin、ATP及MSU三種經(jīng)典的NLRP3炎癥小體激動劑所誘導(dǎo)的Caspase-1(p20)表達(dá)及IL-1β分泌(P<0.01)(見圖2、表3)。

表3 桑黃酮對多種刺激劑活化的BMDM細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響

2.3 桑黃酮抑制人THP-1細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活化 為了明確桑黃酮在人THP-1細(xì)胞中是否同樣抑制NLRP3炎癥小體的活化，利用Nigericin刺激分化后的人THP-1細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示桑黃酮可以劑量依賴性地抑制Caspase-1(p20)表達(dá)及IL-1β分泌(P<0.01)(見圖3、表4)。

表4 桑黃酮對Nigericin刺激的THP-1細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響

2.4 桑黃酮緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠感染性休克 在小鼠感染性休克模型中進(jìn)一步驗(yàn)證桑黃酮在動物水平上的作用，ELISA檢測小鼠血清及腹腔灌洗液IL-1β及TNF-α表達(dá)水平，結(jié)果表明，與LPS組相比，LPS+Mul組小鼠血清及腹腔灌洗液中IL-1β分泌明顯降低(P<0.01)，而TNF-α的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表5)。除此之外，觀察LPS注射后84 h內(nèi)小鼠生存狀態(tài)，并繪制生存曲線，結(jié)果顯示LPS組小鼠14 h開始死亡，36 h小鼠死亡率達(dá)80%。而LPS+Mul組小鼠64 h開始死亡，72 h小鼠死亡率為40%(P<0.01)(見圖4)。

表5 桑黃酮對感染性休克小鼠血清及腹腔灌洗液IL-1β及TNF-α的影響

3 討論

桑枝為?？粕僦参锷５母稍锬壑?，主治風(fēng)濕痹痛，水腫腳氣，另有報道桑枝還具有抗炎、抗氧化及抑菌抗病毒等功效[12-14]。桑黃酮作為桑枝的主要活性成分，現(xiàn)有研究主要集中在神經(jīng)炎癥、脂質(zhì)代謝等方面，有研究[15]發(fā)現(xiàn)其通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路抑制神經(jīng)炎癥帕金森綜合征；另有研究[16]發(fā)現(xiàn)桑黃酮可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶來降低肥胖的發(fā)生率。帕金森綜合征和肥胖的發(fā)生發(fā)展與NLRP3炎癥小體的異?；罨芮邢嚓P(guān)[17-18]。目前，桑黃酮對NLRP3炎癥小體作用尚不清楚，因此，探究其是否通過調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體發(fā)揮抗炎作用對明確桑黃酮的抗炎機(jī)制具有重要意義。

NLRP3炎癥小體在炎性疾病中發(fā)揮重要作用，使其成為治療相關(guān)疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。近年來，越來越多的小分子化合物被報道可以抑制NLRP3炎癥小體活化，多種中草藥成分被證實(shí)對抑制NLRP3炎癥小體活化具有良好效果[19-21]，但還難以應(yīng)用于臨床。尋找可靠的NLRP3炎癥小體抑制劑成為新的研究方向[22]。因此，本研究主要探究中草藥抗炎成分桑黃酮的抗炎作用是否通過抑制NLRP3炎癥小體活化來實(shí)現(xiàn)。我們首先在體外探究桑黃酮是否抑制NLRP3炎癥小體活化，結(jié)果顯示，桑黃酮在鼠BMDM細(xì)胞中抑制Caspase-1表達(dá)及IL-1β分泌，但對primming信號介導(dǎo)的TNF-α和IL-6的產(chǎn)生沒有影響，證實(shí)了桑黃酮以劑量依賴性地方式抑制Nigericin誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化。同時，除Nigericin外，NLRP3炎癥小體還可被內(nèi)源性DAMPs及多種病原菌激活[23]。本研究也發(fā)現(xiàn)桑黃酮可以抑制其他NLRP3炎癥小體刺激劑(如MSU和ATP)誘導(dǎo)的炎癥小體活化，表明桑黃酮抑制NLRP3炎癥小體具有廣譜性。以上結(jié)果證實(shí)了桑黃酮可抑制鼠BMDM細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活化。接下來筆者探討桑黃酮在人THP-1細(xì)胞中是否抑制NLRP3炎癥小體活化，結(jié)果顯示，桑黃酮顯著抑制Caspase-1表達(dá)及IL-1β分泌，證實(shí)了桑黃酮在人THP-1細(xì)胞中同樣可以抑制NLRP3炎癥小體活化。

NLRP3炎癥小體的異?；罨瘯?dǎo)致大量炎性因子釋放，誘導(dǎo)多種炎癥性疾病發(fā)生，如肝纖維化[24]、炎癥性腸病[25]及感染性休克[26]等。嚴(yán)重的感染性休克是內(nèi)、外科重癥監(jiān)護(hù)病房中最常見的死亡原因，也是臨床上亟待解決的問題之一[27]。我們構(gòu)建了最常見的感染性休克模型——小鼠腹腔注射LPS，研究結(jié)果顯示，桑黃酮可以明顯抑制感染性休克小鼠血清和腹腔灌洗液中NLRP3炎癥小體依賴的IL-1β的產(chǎn)生，但對NF-κB信號通路介導(dǎo)的TNF-α無影響。表明桑黃酮通過抑制NLRP3炎癥小體活化緩解小鼠急性炎癥。此外，觀察LPS腹腔注射84 h內(nèi)小鼠生存狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，LPS造模組小鼠14 h后開始死亡，而桑黃酮治療組小鼠64 h開始死亡，桑黃酮顯著延長了感染性休克小鼠的生存時間。這些結(jié)果表明桑黃酮通過抑制NLRP3炎癥小體激活，在體內(nèi)減輕了LPS誘導(dǎo)的感染性休克。

綜上所述，桑黃酮不僅可以抑制體外鼠BMDM和人THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化，還可以阻抑體內(nèi)NLRP3炎癥小體激活，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。明確桑黃酮對NLRP3炎癥小體相關(guān)疾病的治療作用，對開發(fā)其藥用價值及推進(jìn)臨床應(yīng)用具有重要意義。