劉 雪，張折折，羅寶靈，陳貴海，梁 冰

衰老相關(guān)性空間學(xué)習(xí)和記憶能力減退是常見的生物學(xué)現(xiàn)象，且易受到許多因素的加速，但發(fā)病機制尚不完全明確?，F(xiàn)已證明海馬介導(dǎo)空間學(xué)習(xí)和記憶，且容易受衰老的影響[1]。海馬突觸可塑性的改變是衰老相關(guān)性學(xué)習(xí)記憶減退的基礎(chǔ)[2]。研究[3]表明神經(jīng)營養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是突觸可塑性的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與了記憶的形成，而BDNF基因的表達(dá)會隨著年齡的增長而下降，進(jìn)而涉及老年期認(rèn)知損害[4]。證據(jù)[5-6]表明胚胎期的不良因素暴露如炎癥、鉛、營養(yǎng)不良可加速年齡相關(guān)性認(rèn)知損害。我們前期的研究[7]表明，母鼠孕晚期暴露脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥會加重子代小鼠中老年期學(xué)習(xí)和記憶損害。然而，胚胎期炎癥暴露是否影響中年期海馬BDNF基因表達(dá)尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與處理方法 SPF級2月齡CD-1系小白鼠，雌鼠20只，雄鼠10只，購于北京維通利華責(zé)任有限公司。所有小鼠均在標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件下飼養(yǎng)[室溫為(23±1)℃，濕度為55%±5%，明暗周期為12 h，可隨意飲食和水]。適應(yīng)2周后，將雌雄鼠以2∶1的比例合籠，次日清晨檢查到陰栓者為受孕第0天。在母鼠懷孕第15～17天腹腔注射LPS(50 μg/kg)或等量的0.9%氯化鈉溶液，在出生后第21天，將子鼠與母鼠分開，每籠3～4只同性別子鼠飼養(yǎng)。對應(yīng)子鼠分別為CON組和LPS組，每組40只，雌雄各半，分別飼養(yǎng)至3月齡、15月齡時，完成行為學(xué)實驗，隨后每組隨機抽取6只進(jìn)行Western blotting和實時定量PCR實驗。其中有任何運動障礙、脫毛或可見腫瘤的動物在實驗前都被排除在外。所有實驗遵從安徽醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會要求(No.LLSC20160165)。

1.2 行為學(xué)測試 采用Morris水迷宮實驗檢測小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能，該行為學(xué)測試在直徑150 cm、深度30 cm的黑色圓形不銹鋼水池中進(jìn)行，池中充滿水(25 ℃)，水深25 cm，分為四個等量的象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，圓柱形逃生平臺(直徑10 cm)隱藏在第一象限中心的水下1 cm處，水迷宮周圍有一層不透明的白色窗簾，在距水面1 m的位置懸掛3個不同的黑色標(biāo)志物，來幫助小鼠獲取位置信息。該實驗分為兩個階段：定位航行期(學(xué)習(xí)期)和空間探索期(記憶期)。將小鼠從不同象限且面向側(cè)壁入水，允許其自由游動60 s，若找到逃生平臺，則允許該小鼠在平臺上停留30 s，然后開始下一次實驗。未能在60 s內(nèi)找到平臺的小鼠從水池中被救出，并在下一次實驗開始前在平臺上放置30 s。每天4次，每次間隔15 min，連續(xù)7 d。待第7天學(xué)習(xí)期結(jié)束后，開始進(jìn)行記憶期實驗，撤去平臺，將小鼠從平臺相反的象限開始，自由探索60 s。Any-maze軟件記錄小鼠找到平臺的游泳路程(代表學(xué)習(xí)能力)以及小鼠在靶象限(平臺所在象限)內(nèi)的游泳路程占總路程的百分比(代表記憶能力)。

1.3 組織制備 Morris水迷宮任務(wù)完成后第15天，將小鼠頸椎脫臼處死迅速取腦，冰上取海馬組織后放置-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.4 Western blotting分析 將海馬組織解凍后，將其充分研磨，加入適當(dāng)?shù)腞IPA細(xì)胞裂解液，高速離心，裂解組織，收集上清液。往上清液中按1∶4比例加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液。水浴(100 ℃)加熱10 min，使組織充分變性，待樣品冷卻至室溫后，直接加到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，濃縮膠100 V，時間為30 min；分離膠電壓100 V，時間為60 min。恒流轉(zhuǎn)模后，繼續(xù)漂洗5 min，加入Western 封閉液，室溫條件下封閉2 h，加入一抗兔抗-BDNF(1∶1 000,ab108319，美國Abcam公司),4 ℃孵育過夜后使用PBST洗滌。加入二抗羊抗兔IgG (1∶20 000，Zsbio，ZB2301)，室溫孵育2 h后繼續(xù)PBST洗滌，隨后用發(fā)光試劑盒來檢測蛋白。使用Image J 軟件對蛋白條帶的結(jié)果進(jìn)行分析，計算BDNF的相對表達(dá)量。

1.5 實時定量PCR 稱取海馬組織50 mg，剪碎，液態(tài)研磨，加入1 mL TRIzol進(jìn)行裂解，提取RNA組織，并檢測其純度。將RNA經(jīng)RT反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，取cDNA作為熒光定量的模板。反應(yīng)體系如下,5 μL 2× SYBR Green Mixture、1 μL Forward primer(10 μmol/L)、1 μL Reverse primer (10 μmol/L)、1 μL cDNA、2 μL RNase Free water。反應(yīng)條件如下,Hold(預(yù)變性)：95 ℃、60 s、單循環(huán)；PCR反應(yīng)：95 ℃、20 s，60 ℃、60 s，共40循環(huán)。本次實驗所使用的計算方法為2-△△Ct。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS25進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有資料均符合正態(tài)分布。Morris水迷宮成績用重復(fù)測定方差分析及雙因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計。其中，組間數(shù)據(jù)分析采用LSD檢驗。海馬BDNF基因表達(dá)水平與Morris水迷宮結(jié)果之間的相關(guān)性用Pearson 相關(guān)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)期 CON組小鼠游泳路程隨時間的增加而逐漸降低[F(6，216) = 35.968，P<0.01]。15月齡比3月齡CON組游泳路程明顯延長[F(1，36)=10.949，P<0.01]，但性別及性別與年齡的交互效應(yīng)均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖1A)。在3月和15月齡，LPS的處理效應(yīng)均顯著[F(1，36)=6.016，P<0.01；F(1，36)=9.925，P<0.01]，即在兩個年齡段，LPS組的游泳路程均明顯長于CON組，但性別及性別與處理的交互效應(yīng)均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖1B、C)。

2.2 記憶期 15月齡CON組小鼠靶象限游泳路程百分比明顯低于3月齡CON組[F(1，36) =16.950，P< 0.01]，但兩個年齡段性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在3月齡和15月齡，LPS組均比CON組小鼠靶象限游泳路程百分比均明顯降低[F(1，36)=8.139，P<0.01；F(1，36) =17.480，P<0.01]，各組性別效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖1D)。

2.3 海馬BDNF基因表達(dá)水平 各組免疫印跡條帶圖見圖2A。在CON組中，15月齡較3月齡小鼠海馬BDNF蛋白和mRNA相對含量均明顯降低[F(1，20) = 203.300，P<0.01；F(1，20)=86.430，P<0.01]，但性別效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在3月齡和15月齡，LPS組較CON組小鼠海馬BDNF蛋白[F(1，23)=233.764，P<0.01；F(1，23)=706.340，P<0.01]和mRNA[F(1，23)=335.422，P<0.01；F(1，23)=93.868，P<0.01]相對含量均顯著降低，各組性別效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖2B、C)。

2.4 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力與海馬BDNF基因表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson分析表明，15月齡CON組和LPS組小鼠海馬BDNF蛋白水平與平均游泳路程呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.649，P<0.05；r=-0.871，P<0.01)，與靶象限游泳路程百分比呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.780，P<0.01；r=0.840，P<0.01)；小鼠海馬BDNF mRNA相對含量與平均游泳路程呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.891，P<0.01；r=-0.582，P<0.05)，與靶象限游泳路程百分比呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.883，P<0.01；r=0.712，P<0.01)。3月齡海馬BDNF蛋白和 mRNA相對含量與平均游泳路程和靶象限游泳路程百分比均無明顯相關(guān)關(guān)系(P>0.05)(見表2)。

表2 海馬BDNF基因表達(dá)水平與Morris水迷宮成績的相關(guān)性(r)

3 討論

衰老是伴隨認(rèn)知能力下降的正常生理過程，是老年相關(guān)疾病如阿爾茨海默病發(fā)展的主要危險因素[8]。雖然在闡明與年齡相關(guān)的神經(jīng)病理學(xué)和影響認(rèn)知下降的因素之間的復(fù)雜關(guān)系方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的具體機制目前并不明確。根據(jù)成人疾病的胎兒起源假說[9]，大腦發(fā)育的關(guān)鍵窗口期易受應(yīng)激的影響，并可能導(dǎo)致永久性的不良后果。其中，孕產(chǎn)婦感染是常見的應(yīng)激源，可對胎兒的發(fā)育產(chǎn)生潛在的危害。動物研究[10]表明，母體感染可引起胎兒全身炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為胎兒或?qū)m內(nèi)環(huán)境中促炎癥細(xì)胞因子的升高，進(jìn)而影響胎兒的認(rèn)知功能。研究[7]發(fā)現(xiàn)，在孕期給予母鼠腹腔注射小劑量LPS，雖然不會導(dǎo)致胎兒的早產(chǎn)和死亡，且可正常發(fā)育，但中老年期會出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶功能的提前減退。本研究中，15月齡CON組比3月齡CON組學(xué)習(xí)期游泳路程延長(P<0.01)，記憶期靶象限游泳路程百分比降低(P<0.01)，且兩個年齡段的炎癥暴露組比對照組成績均差。這些結(jié)果提示青年期和中老年期LPS組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退。然而，我們關(guān)于青年期的結(jié)果似乎與已出現(xiàn)的證據(jù)[11]矛盾，這可能與本研究樣本量大于已有的研究而使統(tǒng)計學(xué)把握度增加所致。

研究[12]表明，認(rèn)知功能障礙與神經(jīng)元的突觸可塑性受損有關(guān)。BDNF作為調(diào)節(jié)突觸可塑性和記憶形成的主要驅(qū)動因子，與酪氨酸激酶受體B結(jié)合，在認(rèn)知形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13-15]。本課題組及其他小組的研究表明，BDNF通過介導(dǎo)海馬長時程增強作用來參與學(xué)習(xí)與記憶的過程[16-17]，而上調(diào)海馬BDNF mRNA轉(zhuǎn)錄水平可改善大鼠的記憶障礙[18]。此外，端腦受損BDNF突變小鼠表現(xiàn)出顯著的空間學(xué)習(xí)缺陷[19]。人類退行性疾病中，包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病的認(rèn)知功能障礙可部分歸因于BDNF蛋白及mRNA轉(zhuǎn)錄水平的減少[20]。BDNF的表達(dá)水平易受產(chǎn)前和產(chǎn)后應(yīng)激的影響。例如母子分離可導(dǎo)致大鼠成年后海馬BDNF表達(dá)水平的降低，其影響主要局限于成熟形式的BDNF[21]。而在本研究中，胚胎期炎癥暴露可使成年小鼠海馬BDNF表達(dá)水平下降。另一項研究[22]顯示，在母鼠懷孕期間給予溫和性刺激可導(dǎo)致Lewis雄性大鼠成年期BDNF蛋白水平降低和mRNA轉(zhuǎn)錄的增加。這種差異可能是由不同品系的嚙齒類動物和實驗操作導(dǎo)致的。Pearson相關(guān)分析顯示，15月齡CON組和LPS組小鼠海馬BDNF表達(dá)水平與學(xué)習(xí)期游泳路程呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與記憶期靶象限游泳路程百分比呈正相關(guān)關(guān)系。因此我們推測海馬BDNF表達(dá)水平降低可能與年齡相關(guān)性空間學(xué)習(xí)記憶減退有關(guān)。

綜上，胚胎期炎癥暴露可導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能減退及海馬BDNF基因表達(dá)水平降低。本研究的不足之處在于未采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)過表達(dá)或敲除BDNF，觀察小鼠在青年期和中老年期認(rèn)知功能改變情況。且到目前為止，我們?nèi)圆磺宄﨎DNF基因表達(dá)情況對胚胎期炎癥暴露引起的認(rèn)知功能障礙的貢獻(xiàn)程度。未來的研究將對BDNF基因參與認(rèn)知功能調(diào)控的具體機制作進(jìn)一步探索。