張華，杜為，邱錄貴，張宇, 8 *

（1.協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司，天津 300384；2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071；3.天津市血液細(xì)胞治療技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；4.國家干細(xì)胞工程產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化基地，天津 300384；5.天津市臍帶血造血干細(xì)胞庫，天津 300384；6.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所 血液病醫(yī)院，天津 300020；7.實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020；8.中源協(xié)和細(xì)胞基因工程股份有限公司，天津 300384）

近年來，迅速發(fā)展的新型腫瘤免疫療法改變了臨床腫瘤治療的傳統(tǒng)模式。在免疫治療領(lǐng)域，單克隆抗體和工程化免疫細(xì)胞的研發(fā)和應(yīng)用取得了重大進(jìn)展。雖然用于血液惡性腫瘤自體治療的靶向腫瘤抗原的嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)已取得顯著效果，但CAR-T細(xì)胞治療仍然面臨許多挑戰(zhàn)，包括高成本、長時間的制造過程，副作用和自體應(yīng)用相關(guān)的問題。因此，人們逐漸將焦點(diǎn)轉(zhuǎn)向基于自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞的免疫療法。NK細(xì)胞于20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)，是一群不需要預(yù)先致敏即可產(chǎn)生細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子的先天淋巴細(xì)胞亞群，能夠介導(dǎo)體內(nèi)抗病毒和抗腫瘤反應(yīng)。不同于T細(xì)胞和B細(xì)胞通過抗原受體識別“非我”抗原產(chǎn)生適應(yīng)性免疫，NK細(xì)胞依賴于細(xì)胞表面的激活性和抑制性受體信號的整合，識別和攻擊丟失或下調(diào)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（major histocompatibility complex class I，MHC-Ⅰ）表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，稱為“缺失自我”識別機(jī)制[1]。重要的是，NK細(xì)胞可以通過多種機(jī)制殺傷靶細(xì)胞。另外，NK細(xì)胞還可以通過人免疫球蛋白G Fc段受體ⅢA（IgG Fc region receptorⅢA，F(xiàn)cγRⅢA，又稱CD16）介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）效應(yīng)[2]。在安全性方面，與T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞表面缺乏T細(xì)胞受體（T cell receptors，TCRs），不會引起移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）[3]。這一特點(diǎn)使得NK細(xì)胞療法不但可以自體輸注，而且可以實(shí)現(xiàn)異體過繼轉(zhuǎn)移治療。此外，NK細(xì)胞治療產(chǎn)品的細(xì)胞來源也豐富多樣，包括外周血（peripheral blood，PB）、臍帶血、NK-92細(xì)胞系、胎盤和干細(xì)胞等。目前，這些體外活化和擴(kuò)增的NK細(xì)胞治療的安全性和臨床有效性已在多個臨床研究中得到證明[4]。NK細(xì)胞為一個有吸引力的免疫治療產(chǎn)品，針對血液瘤或?qū)嶓w瘤的多個臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中[5]。隨著NK細(xì)胞一系列體外擴(kuò)增和基因修飾平臺的成熟，NK細(xì)胞有望成為一種“貨架型”的細(xì)胞治療產(chǎn)品，可以提前大量制備、存儲并按需用于多個患者。

雖然以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的癌癥免疫療法具有諸多優(yōu)勢，但NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用仍然面臨一系列挑戰(zhàn)。首先，盡管NK細(xì)胞臨床安全性已得到充分驗(yàn)證，但臨床治療效果仍然有限。其次，輸注后的NK細(xì)胞在體內(nèi)存活時間短、持久性差也進(jìn)一步限制了它的療效。因此，目前的研究主要集中在增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤活性的治療策略。本文總結(jié)了NK細(xì)胞生物學(xué)知識、NK細(xì)胞來源以及體外制備情況，旨在為提高NK細(xì)胞療效的過繼治療策略提供參考。

1 NK細(xì)胞生物學(xué)

1.1 NK細(xì)胞的定義、發(fā)育分化及體內(nèi)分布

NK細(xì)胞是Ⅰ型先天淋巴細(xì)胞（group 1 innate lymphoid cells，ILC1s）的主要亞群，與Ⅱ型先天淋巴細(xì)胞（group 2 innate lymphoid cells，ILC2s）B細(xì)胞和Ⅲ型先天淋巴細(xì)胞（group 3 innate lymphoid cells，ILC3s）T細(xì)胞來自于同一淋巴祖細(xì)胞。NK細(xì)胞是一群不需要預(yù)先致敏就可以攻擊病毒感染的和惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并分泌細(xì)胞因子干擾素γ（interferon gamma，IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等。

人NK細(xì)胞起源于骨髓中的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs），首先由CD34+HSC分化為普通淋巴祖細(xì)胞（common lymphoid progenitors，CLPs），進(jìn)一步分化為NK前體細(xì)胞（NK cell precursors，NKPs）[6]。NKPs上 CD122 的表達(dá)決定著NK細(xì)胞譜系的形成。CD56的出現(xiàn)標(biāo)志著NKPs向NK細(xì)胞分化的完成。根據(jù)CD56的表達(dá)水平，NK細(xì)胞又可以分為CD56bright期和CD56dim期兩個時期。CD56brightNK細(xì)胞是不完全成熟的，在獲得CD16的表達(dá)后可以分化成CD56dimNK細(xì)胞[7]。雖然兩個亞群都會產(chǎn)生細(xì)胞因子，但CD56dim亞群具有更強(qiáng)的細(xì)胞溶解活性[8]。在NK細(xì)胞發(fā)育成熟過程中，白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-7、干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）和FMS樣酪氨酸激酶3配體（FMS-like tyrosine kinase 3 ligand，F(xiàn)LT3L）是HSCs產(chǎn)生CD122+NKP的關(guān)鍵因子，而IL-5對于NK細(xì)胞譜系的形成和CD122+NKPs分化為成熟NK細(xì)胞至關(guān)重要[9]。此外，NK細(xì)胞的發(fā)育也受一系列的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子E4啟動子結(jié)合蛋白4（E4 promoter-binding protein 4，E4BP4）、胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)HMG盒蛋白（thymocyte selection-associated HMG box，TOX） 和 DNA 結(jié)合抑制劑 2（inhibitor of DNA binding 2，ID2）在NK細(xì)胞譜系中是必需的，而T細(xì)胞表達(dá)的T盒（T-box expressed in T cells，T-bet）、脫中胚蛋白（eomesodermin，Eomes）和鋅指E盒結(jié)合同源盒2（zinc finger E-box-binding homeobox 2，ZEB2）為NK細(xì)胞成熟所必需[9]。

PB中NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的5% ～ 15%，主要包含CD56brightCD16-和CD56dimCD16+兩個亞群，其中CD56dimCD16+亞群占總循環(huán)NK細(xì)胞的90% ～95%[8-10]。CD56dimCD16+細(xì)胞不但對易感靶細(xì)胞具有高度的裂解作用，而且可以通過CD16的表達(dá)介導(dǎo)ADCC效應(yīng)，同時，也可以分泌細(xì)胞因子。除此之外，NK細(xì)胞在其他大多數(shù)器官中也都存在。在淋巴結(jié)、扁桃體和腸道中的NK細(xì)胞在表型和功能上與PB中的NK細(xì)胞亞群不同，主要為細(xì)胞毒性較弱的CD56brightCD16-NK細(xì)胞，但是，骨髓、脾和肺中的NK細(xì)胞主要是細(xì)胞毒性較強(qiáng)的CD56dimCD16+NK細(xì)胞[11]。

1.2 NK細(xì)胞的激活和抑制受體

NK細(xì)胞的激活和抑制是由激活性和抑制性受體綜合調(diào)節(jié)，這些整合的受體信號決定了相鄰的細(xì)胞是否被殺傷。通常，人體中的健康細(xì)胞大多數(shù)表達(dá)MHC-Ⅰ，也被稱為Ⅰ類HLAs。MHC-Ⅰ結(jié)合NK細(xì)胞表面的抑制性殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptors，KIRs）以抑制NK細(xì)胞功能，減少對健康自身細(xì)胞的破壞。KIR基因具有多態(tài)性，不同基因在NK細(xì)胞上的隨機(jī)表達(dá)形成多樣化的KIRs庫，因此，特定的NK細(xì)胞克隆表面至少有一種KIR可以與自身Ⅰ類HLA相互作用形成免疫耐受，這也是NK細(xì)胞成熟至有功能細(xì)胞的過程，稱為“許可”[12-13]。反之，如果NK細(xì)胞不表達(dá)識別自身Ⅰ類HLA的任何一種KIR，則不具有功能活性[14]。然而，這種不具有功能活性的NK細(xì)胞在IL-2或IL-15等因子的刺激下也可以重新獲得功能[12]。除此之外，C型凝集素家族成員NKG2A與CD94形成二聚體后可與非典型的MHC-Ⅰ中的HLA-E結(jié)合，是NK細(xì)胞表達(dá)的另一個主要抑制性受體[15]。盡管這些受體代表了NK細(xì)胞激活的主要檢查點(diǎn)，仍然有一些對NK細(xì)胞毒性穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)起重要作用的受體，包括T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域（T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT）、PVR相關(guān)的Ig域（PVR-related Ig domain，PVRIG）、淋巴細(xì)胞3激活基因（lymphocyte-3 activation gene，LAG3）、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子（T cell immunoglobulin and mucin domain containing-3，TIM3）、程序性死亡分子-1（programmed death-1，PD-1）和CD96。事實(shí)上，阻斷以上這些抑制性受體與腫瘤上的配體的相互作用已成為NK細(xì)胞治療的有效策略。

除了下調(diào)MHC分子，腫瘤細(xì)胞也會過表達(dá)某些配體以激活NK細(xì)胞受體。NK細(xì)胞上這些激活受體主要包括自然毒性受體（nature cytotoxicity receptors，NCRs）NKp30/NKp44/NKp46、CD16 和NKG2D等。CD16是NK細(xì)胞表面表達(dá)的最有效的激活受體。預(yù)先經(jīng)過IgG抗體處理的靶細(xì)胞可以通過抗體的Fc區(qū)與CD16分子連接，從而激活NK細(xì)胞，執(zhí)行殺傷功能，這一機(jī)制被稱為抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用“ADCC”效應(yīng)[2]。NKp30、NKp44和NKp46通過識別并直接結(jié)合到腫瘤或壓力脅迫細(xì)胞的配體上，從而誘導(dǎo)NK細(xì)胞激活，啟動細(xì)胞殺傷和細(xì)胞因子分泌。腫瘤和病毒感染細(xì)胞上的MICA、MICB和ULBP家族配體與NKG2D結(jié)合可激活NK細(xì)胞的活性[16]。目前，這些激活受體作為治療靶點(diǎn)被廣泛研究，這對于NK細(xì)胞功能的提升具有重要意義。

1.3 NK細(xì)胞的功能及作用機(jī)制

NK細(xì)胞的功能包括脫顆粒、細(xì)胞因子釋放和細(xì)胞毒性，受激活受體和抑制受體信號的整合控制。在機(jī)體中，NK細(xì)胞可以通過“缺失自我”的機(jī)制殺傷靶細(xì)胞。通常情況下，表達(dá)MHC-Ⅰ的正常健康細(xì)胞與NK細(xì)胞抑制受體形成“免疫耐受”，而低表達(dá)或不表達(dá)MHC-Ⅰ的細(xì)胞則被NK細(xì)胞識別并裂解[1]。NK細(xì)胞不但可以通過胞吐作用釋放穿孔素和顆粒酶等毒性顆粒直接裂解靶細(xì)胞，通過活化NK細(xì)胞表達(dá)FASL/TRAIL，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可以通過合成和分泌IFN-γ、TNF-α和趨化因子等招募其他免疫細(xì)胞產(chǎn)生二次免疫反應(yīng)[17-18]。NK細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷的另外一個關(guān)鍵機(jī)制是ADCC。ADCC可觸發(fā)NK細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng)來殺傷抗體包被的靶細(xì)胞，對這一機(jī)制的利用臨床上主要體現(xiàn)在NK細(xì)胞與腫瘤特異性治療單克隆抗體的聯(lián)用。

2 制備臨床級NK細(xì)胞

2.1 NK細(xì)胞的來源

NK細(xì)胞產(chǎn)品開發(fā)過程中面臨的首要挑戰(zhàn)是獲得足量的可用于臨床治療的細(xì)胞，而NK細(xì)胞起始材料的選擇可以在一定程度上解決這個問題。目前用于制造臨床級NK細(xì)胞產(chǎn)品的細(xì)胞來源包括NK細(xì)胞系、外周血NK細(xì)胞（peripheral blood NK cell，PB-NK）、臍帶血NK細(xì)胞（umbilical cord blood NK cell，UC-NK）、干細(xì)胞來源NK細(xì)胞和胎盤來源NK細(xì)胞（見表1）。

表1 NK細(xì)胞來源的總結(jié)和比較Table 1 Comparison of different sources of NK cells

2.1.1 NK細(xì)胞系NK細(xì)胞系具有無限增殖能力，是被用于臨床試驗(yàn)較早的NK細(xì)胞。目前，已經(jīng)建立的NK細(xì)胞系包括NK-92、YT、NKL、SNK-6、KHYG-1、NK-YS、NKG和IMC-1等。其中，NK-92細(xì)胞系表現(xiàn)出易于擴(kuò)增培養(yǎng)以及輸注后對白血病細(xì)胞具有持續(xù)的細(xì)胞毒性的優(yōu)點(diǎn)。NK-92也是美國FDA批準(zhǔn)用于Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)的唯一細(xì)胞系。NK-92細(xì)胞系來源于快速進(jìn)展的非霍奇金淋巴瘤患者，可以通過添加IL-2在良好生產(chǎn)規(guī)范（good manufacturing practice，GMP）條件下大量擴(kuò)增，同時可以低溫保存且解凍后細(xì)胞功能恢復(fù)良好[19-20]。但是，NK-92不表達(dá)CD16受體，無法進(jìn)行ADCC應(yīng)答[21]。此外，由于此細(xì)胞系來源于腫瘤患者，需要在輸注前輻照以消除惡性轉(zhuǎn)化和伴隨的染色體異常風(fēng)險(xiǎn)，這降低了NK-92細(xì)胞體內(nèi)增殖活性和持久性。

2.1.2 外周血來源NK細(xì)胞在PB中的NK細(xì)胞僅占淋巴細(xì)胞的5% ～ 15%，主要為CD3-CD56dimNK細(xì)胞亞群，可以相對容易地從患者本身或健康供體中分離出來，是NK細(xì)胞療法臨床前研究應(yīng)用最多的細(xì)胞來源。然而，癌癥患者的自體NK細(xì)胞不但會被自身MHC所沉默，而且NK細(xì)胞功能往往受到疾病或治療的損害。因此，異基因PB-NK通常是免疫治療的首選，但是為了防止GVHD的發(fā)生需要嚴(yán)格控制T淋巴細(xì)胞的含量。此外，PB-NK細(xì)胞功能活性較強(qiáng)，也是過繼CAR-NK細(xì)胞生產(chǎn)極好的種子細(xì)胞來源。但是，PB-NK細(xì)胞在低溫保存后細(xì)胞毒性降低，雖然這種功能損失可以通過細(xì)胞因子激活和擴(kuò)增得到部分恢復(fù)，但這也使得PB-NK細(xì)胞不是“現(xiàn)貨”治療的最佳選擇。

2.1.3 臍帶血來源NK細(xì)胞與PB-NK細(xì)胞不同，UC中的NK細(xì)胞僅占TNCs的5%，卻為過繼免疫治療提供了獨(dú)特的同種異體反應(yīng)優(yōu)勢，提高了NK細(xì)胞廣泛應(yīng)用于臨床的潛能。盡管在臍帶血中幼稚性NK細(xì)胞比例較高，但大多數(shù)UC-NK經(jīng)過細(xì)胞因子刺激擴(kuò)增后能夠分化為功能成熟的NK細(xì)胞。值得關(guān)注的是，越來越多研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向采用UC-NK細(xì)胞來產(chǎn)生臨床前或臨床試驗(yàn)的NK/CAR-NK細(xì)胞。例如，MD安德森癌癥研究中心進(jìn)行的首個人體Ⅰ/Ⅱ期臨床研究證明，UC來源的CAR-NK細(xì)胞治療復(fù)發(fā)和難治性CD19+B細(xì)胞淋巴瘤有效性及安全性均較為滿意[5]。然而，獲得足夠的用于臨床的NK細(xì)胞仍然是一個挑戰(zhàn)。盡管有一些擴(kuò)增平臺利用一份臍帶血可制備出上百劑的NK細(xì)胞，但是進(jìn)行大規(guī)模NK細(xì)胞擴(kuò)增的產(chǎn)量仍然受限。

2.1.4 干細(xì)胞來源NK細(xì)胞目前，研究中用于NK細(xì)胞生產(chǎn)的干細(xì)胞主要包括CD34+HSC、人胚胎干 細(xì) 胞（human embryo stem cells，hESCs） 和 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）。早期的研究已經(jīng)表明，由CD34+HSC可以分化為成熟的NK細(xì)胞。Glycostem公司的oNKord?即是臍帶血CD34+HSC分化而來。事實(shí)上，hESCs或hiPSCs產(chǎn)生成熟的NK細(xì)胞過程中一個很重要的節(jié)點(diǎn)是產(chǎn)生CD34+細(xì)胞。近幾年的大量研究已經(jīng)證實(shí)，由hESCs或hiPSCs產(chǎn)生NK細(xì)胞具有可行性。不同于PB-NK和UC-NK細(xì)胞在數(shù)量、體外增殖、異質(zhì)性及凍融敏感的局限性，干細(xì)胞來源尤其是hiPSC來源的NK細(xì)胞是從主細(xì)胞庫經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化擴(kuò)增而來，可以產(chǎn)生大量均質(zhì)化、質(zhì)量可控且能夠長期冷凍保存的NK/CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品。因此，干細(xì)胞衍生的NK/CAR-NK細(xì)胞是開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化的治療產(chǎn)品的一個有吸引力的替代方案。鑒于hiPSC-NK產(chǎn)品的治療潛力，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)了Fate Therapeutics公司hiPSC-NK產(chǎn)品FT500的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT03841110），而FT500也是美國FDA批準(zhǔn)的首個iPSC衍生細(xì)胞產(chǎn)品的臨床研究，主要用于治療晚期實(shí)體腫瘤。

2.1.5 胎盤來源NK細(xì)胞胎盤具有的獨(dú)特免疫生物學(xué)特性使其成為同種異體移植種子細(xì)胞的優(yōu)質(zhì)來源。胎盤來源的NK細(xì)胞主要包括胎盤NK細(xì)胞（placenta-derived natural killer cells，pNKs） 和胎盤CD34+HSC分化的NK細(xì)胞。pNKs一般是指從供者配型和足月的胎盤組織中分離制備的一群CD56+CD3-NK細(xì)胞。胎盤CD34+HSC與上述干細(xì)胞來源的NK細(xì)胞類似，可以在細(xì)胞因子誘導(dǎo)刺激下分化為成熟NK細(xì)胞。前期研究表明，體外擴(kuò)增的pNKs與增加的NKG2D、NKp44和NKp46激活受體表達(dá)一致，表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的抗腫瘤活性[22]。與PB-NK細(xì)胞相比，pNKs表現(xiàn)出獨(dú)特的微RNA（microRNA，miRNA）表達(dá)譜、免疫表型和更強(qiáng)的體外抗腫瘤能力[22]。CYNK-001是Celularity公司的一款胎盤造血干細(xì)胞來源的“即用型”NK細(xì)胞療法，需冷凍保存，具有同種異體、未經(jīng)基因編輯修飾的特點(diǎn)。CYNK-001已獲得FDA授予治療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的孤兒藥資格，以及治療多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）和急性髓系淋巴瘤（acute myeloid lymphoma，AML）的快速通道資格。目前，該產(chǎn)品正用于治療多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）（NCT04309084）、AML（NCT04310592）、GBM（NCT04489420）以及新型冠狀病毒感染（corona virus disease 2019，COVID-19）（NCT04365101）的多種適應(yīng)證臨床研究中。

2.2 NK細(xì)胞擴(kuò)增平臺

NK細(xì)胞過繼免疫療法是一種很有前景的癌癥治療方法，但存在的挑戰(zhàn)也限制了其可用性及臨床有效性。其中，主要的困難是缺乏臨床級的生產(chǎn)平臺來支持高活性NK細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增。目前NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法包括基于飼養(yǎng)細(xì)胞、基于質(zhì)膜顆粒及無飼養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)增方法。

2.2.1 基于飼養(yǎng)細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，可以為NK細(xì)胞提供微環(huán)境并促進(jìn)細(xì)胞增殖和活化。用自體細(xì)胞或滅活的飼養(yǎng)細(xì)胞體外共培養(yǎng)NK細(xì)胞是NK細(xì)胞擴(kuò)增和活化的極好策略。目前，改造的K562是NK細(xì)胞擴(kuò)增應(yīng)用最廣泛的飼養(yǎng)細(xì)胞。與表達(dá)膜結(jié)合IL-15 (membrane bound IL-15，mb15)和 4-1BB配 體 (4-1BB ligand，41BBL)的 K562細(xì)胞(K562-mb15-41BBL)共培養(yǎng)2周左右可使NK細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)百倍，但擴(kuò)增出的NK細(xì)胞是端粒酶縮短且衰老的細(xì)胞[23]。此外，ADAM17的蛋白切割活性可使IL-15激活的NK細(xì)胞失去CD16分子，削弱NK細(xì)胞的ADCC效應(yīng)[24]。相比之下，K562細(xì)胞表達(dá)膜結(jié)合IL-21 (membrane bound IL-21，mb21)而不是mb15，顯著促進(jìn)了NK細(xì)胞的擴(kuò)增，而不會引起NK細(xì)胞的衰老[23]。K562-mb21-41BBL使NK細(xì)胞在3周內(nèi)平均擴(kuò)增48 000倍且細(xì)胞純度高于85%[23]。雖然以上2種飼養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞均已被應(yīng)用于臨床試驗(yàn)研究中，但K562腫瘤細(xì)胞系的使用仍然存在臨床安全性風(fēng)險(xiǎn)。因此，輻照的外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）、Epstein-Barr病毒淋巴母細(xì)胞系（Epstein-Barr virus-transferred lymphoblastoid cell lines，EBV-LCLs）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）也常作為飼養(yǎng)細(xì)胞被用于NK細(xì)胞的擴(kuò)增。

2.2.2 基于質(zhì)膜顆粒腫瘤細(xì)胞系的膜顆?？梢杂行娲[瘤細(xì)胞系用于NK細(xì)胞擴(kuò)增。目前，應(yīng)用的質(zhì)膜顆粒主要來源于K562-mb15-41BBL和K562-mb21-41BBL細(xì)胞，是在無菌條件下經(jīng)裂解液和液氮裂解，梯度離心和蔗糖密度梯度離心純化得到[25]。與K562-mb15-41BBL質(zhì)膜顆粒（PM15顆粒）相比，K562-mb21-41BBL質(zhì)膜顆粒（PM21顆粒）的NK細(xì)胞擴(kuò)增效率和細(xì)胞純度均較高[26]。此外，PM21顆粒刺激的NK細(xì)胞在28 d內(nèi)呈指數(shù)增長，而PM15顆粒刺激的NK細(xì)胞在培養(yǎng)第22天就因衰老而停止增長[26]。相較于基于飼養(yǎng)細(xì)胞的方法，基于質(zhì)膜顆粒的方法除了具有與飼養(yǎng)細(xì)胞相當(dāng)?shù)脑鲋衬芰?，它們還可以提前制備和儲存，并作為“現(xiàn)成的試劑”使用，大大簡化了NK細(xì)胞的制備過程。此外，最終的NK細(xì)胞產(chǎn)品也不存在飼養(yǎng)細(xì)胞殘留及體內(nèi)增殖的問題，降低了飼養(yǎng)細(xì)胞可能導(dǎo)致的臨床安全風(fēng)險(xiǎn)，更適合過繼NK細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)。

2.2.3 無飼養(yǎng)細(xì)胞的NK細(xì)胞擴(kuò)增雖然以飼養(yǎng)細(xì)胞為基礎(chǔ)的擴(kuò)增系統(tǒng)具有良好的體外NK細(xì)胞擴(kuò)增特性，無飼養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)增方法更符合GMP的流程，并可能更容易獲得治療藥品的許可。目前，被用來激活和擴(kuò)增NK細(xì)胞的主要細(xì)胞因子包括IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。細(xì)胞因子的組合直接影響NK細(xì)胞的成熟、增殖、存活，NK細(xì)胞亞群的分布、激活，以及細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒性功能。IL-2和IL-15是研究最廣泛的NK細(xì)胞激活劑，兩者都可以增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)，在體外聯(lián)用時，對NK細(xì)胞的刺激具有疊加作用；當(dāng)IL-2和IL-12聯(lián)合使用時，IL-2和IL-12在體外協(xié)同增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性；IL-15/IL-18/IL-27介導(dǎo)的NK細(xì)胞激活，與IL-2、IL-15和IL-15/IL-18單獨(dú)或者組合相比，NK細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性和IFN-γ分泌效果更好[27]。此外，NK細(xì)胞與IL-12、IL-15和IL-18的聯(lián)合，可產(chǎn)生細(xì)胞因子誘導(dǎo)的記憶樣（cytokine induced memory-like，CIMK）NK細(xì)胞[28]。CIMK NK細(xì)胞是一種長壽命的NK細(xì)胞，當(dāng)被再次激活時表現(xiàn)出增強(qiáng)的功能，產(chǎn)生更多的 IFN-γ[29]。

2.3 NK細(xì)胞規(guī)模化擴(kuò)增系統(tǒng)

傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)袋培養(yǎng)的NK細(xì)胞數(shù)量已無法滿足NK細(xì)胞過繼免疫治療的臨床應(yīng)用需求。另外，傳統(tǒng)的NK細(xì)胞擴(kuò)增操作過程需要頻繁的補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基、細(xì)胞因子和生長因子等NK細(xì)胞生長所需營養(yǎng)物質(zhì)，無疑增加了細(xì)胞污染的風(fēng)險(xiǎn)。G-Rex和生物反應(yīng)器的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了在封閉的系統(tǒng)中大規(guī)模擴(kuò)增NK細(xì)胞的需求，以XuriTMW25（GE Healthcare）為代表的波浪式生物反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)0.3 ～25 L體系高密度NK細(xì)胞的擴(kuò)增，其上游設(shè)備C-Pro全自動封閉式細(xì)胞處理設(shè)備可進(jìn)行單個核細(xì)胞的分離和清洗，而其下游設(shè)備SefiaTMS-2000細(xì)胞處理儀可將最終擴(kuò)增的NK細(xì)胞進(jìn)行濃縮、洗滌及分裝，最后經(jīng)過程序降溫設(shè)備實(shí)現(xiàn)“現(xiàn)貨型”臨床級NK細(xì)胞產(chǎn)品的全封閉制備流程。此外，國內(nèi)外越來越多的NK細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)入市場，推進(jìn)了NK細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化制備和NK細(xì)胞免疫治療產(chǎn)品上市的進(jìn)程。

3 NK細(xì)胞治療的創(chuàng)新策略

隨著近期CAR-NK和細(xì)胞因子刺激NK細(xì)胞療法的成功，基于NK細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移療法已經(jīng)成熟。目前國內(nèi)外大部分的NK/CAR-NK細(xì)胞療法尚處于Ⅰ期或Ⅱ期臨床研究，早期研究結(jié)果顯示出良好的抗腫瘤活性和體內(nèi)安全性?；贜K細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移療法具有諸多優(yōu)勢，但也面臨著挑戰(zhàn)。其中最重要的挑戰(zhàn)之一就是NK細(xì)胞體內(nèi)存活時間短、功能活性差。為此，大量的研究以此為研究目標(biāo)進(jìn)行探索，也開發(fā)出一系列解決策略（見圖1）。

圖1 NK細(xì)胞免疫療法的策略Figure 1 Different strategies for NK cell immunotherapy

3.1 IL-15信號途徑

IL-15是免疫突觸中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的發(fā)育和存活。在NK細(xì)胞體外擴(kuò)增中，IL-15也成為影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的重要因子。因此，研究者開發(fā)出各種各樣激活I(lǐng)L-15信號通路的方法來提高NK細(xì)胞的功能。Imamura等[30]研究表明，在人PB-NK細(xì)胞中只需表達(dá)一種膜結(jié)合形式的IL-15而不需要添加其他細(xì)胞因子就能夠提高NK細(xì)胞在體外和體內(nèi)的存活和增殖能力，進(jìn)而增強(qiáng)對惡性血液瘤和實(shí)體瘤的殺傷活性。一種由重組IL-15（recombinant IL-15，rIL-15）或IL-15超級激動劑N-803和IL-15Rα融合而成的復(fù)合體可以在腫瘤免疫抑制微環(huán)境中維持NK細(xì)胞的增殖和持久性[31]。此外，IL-15信號調(diào)節(jié)因子也成為一個增強(qiáng)NK細(xì)胞功能的靶點(diǎn)。因子誘 導(dǎo)SH2蛋 白（cytokine-inducible SH2-containing protein，CIS）是NK細(xì)胞IL-15信號傳導(dǎo)的抑制劑。NK細(xì)胞響應(yīng)IL-15信號表達(dá)CIS，而編碼CIS的基因CISH的缺失，能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞對IL-15的反應(yīng)，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞的生存、增殖和效應(yīng)功能[32-33]。用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)敲除iPSC細(xì)胞中的CISH基因，此iPSC細(xì)胞衍生的NK細(xì)胞的體內(nèi)持久性和抗腫瘤活性得到了有效提高[34]。類似的研究也表明，在PB-NK和UC-NK細(xì)胞中敲除CISH也可以提高其抗腫瘤活性[35]。

體外細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞輸入體內(nèi)后會導(dǎo)致其持久性下降，因此，NK細(xì)胞治療臨床研究常用的方案是將NK細(xì)胞與IL-15共同輸注以維持NK細(xì)胞的體內(nèi)存活和增殖，但是這也導(dǎo)致了惡化的免疫反應(yīng)等安全性問題。通過基因工程修飾NK細(xì)胞，使IL-15信號途徑持續(xù)激活，能夠維持NK細(xì)胞的體內(nèi)持久性和殺傷效力。然而，輸注的NK細(xì)胞在體內(nèi)長期存活也可能具有潛在的安全性問題，需要長期的藥物代謝臨床研究來證實(shí)。

3.2 CD16A介導(dǎo)的ADCC途徑

由人NK細(xì)胞上的CD16A受體介導(dǎo)的ADCC是NK細(xì)胞一種重要的效應(yīng)機(jī)制。激活的NK細(xì)胞表面CD16A會被ADAM17蛋白酶切割并從膜上脫落，導(dǎo)致NK細(xì)胞失去ADCC的能力，這也是NK細(xì)胞毒性喪失的一個原因[36]。為了解決這個問題，Jing等[37]將突變的CD16A受體（CD16A/S197P）轉(zhuǎn)入iPSC，阻止了定點(diǎn)突變的CD16A受體被ADAM17切割。為了獲得更好的效果，結(jié)合CRISPR/Cas9編輯技術(shù)敲除ADAM17基因的研究也在進(jìn)行中。NantKwest公司的高親和力變體（high affinity NK，haNK）來源于專有的NK-92主細(xì)胞庫，經(jīng)基因工程改造表達(dá)CD16A受體的haNK可促進(jìn)癌細(xì)胞有效清除[21]。haNK與ImmunityBio公司的IL-15超級激動劑復(fù)合物N-803聯(lián)合療法在難治性/轉(zhuǎn)移性默克爾細(xì)胞癌患者的Ⅱ期臨床試驗(yàn)的總體緩解率為29%，且具有良好的耐受性和安全性（NCT03853317）（見表2）。非切割和高親和性雙重修飾CD16A（hnCD16）的人iPSC-NK細(xì)胞能夠更有效地靶向更多的腫瘤類型[38]。Fate Therapeutics公司的FT516 hnCD16-iNK細(xì)胞功能成熟，對多種腫瘤靶點(diǎn)表現(xiàn)出增強(qiáng)的ADCC效應(yīng)。人B細(xì)胞淋巴瘤體內(nèi)研究表明，使用hnCD16-iNK細(xì)胞聯(lián)合抗CD20單克隆抗體治療可以顯著促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤的消退[38]（見表2）。已獲得FDA批準(zhǔn)的FT538在FT516 CD16A修飾基礎(chǔ)上增加IL-15受體融合蛋白以增強(qiáng)體內(nèi)存活和持久性，同時敲除CD38以消除抗CD38抗體介導(dǎo)的NK細(xì)胞自相殘殺[39]（見表2）。目前，F(xiàn)T538處于多中心、多劑量的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，用于治療復(fù)發(fā)/難治性急性髓系淋巴瘤和MM患者（NCT04714372）（見表2）。

表2 處于臨床試驗(yàn)階段的NK細(xì)胞產(chǎn)品Table 2 NK cell products under clinical trial

鑒于CD16A脫落是NK從靶細(xì)胞脫離并進(jìn)行下一個靶細(xì)胞殺傷的調(diào)節(jié)機(jī)制，通過對CD16A的改造以阻斷其在NK細(xì)胞表面脫落的策略雖然可以極大地提高NK細(xì)胞的毒性，但是卻降低了NK細(xì)胞在有限生命內(nèi)的殺傷效率[40-41]。因此，在臨床應(yīng)用時可能需要輸注更多的NK細(xì)胞數(shù)量。此外，NK細(xì)胞持續(xù)作用于靶細(xì)胞也可分泌大量細(xì)胞因子，可能會引起細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)等副作用。增加CD16A受體表達(dá)或提高脫落后CD16A受體的再利用的策略或許可以成為增強(qiáng)NK細(xì)胞ADCC效應(yīng)更有效的替代方法。

3.3 CAR-NK細(xì)胞

截至2022年11月，Kymriah、Yescarta、Tecartus、Breyanzi、奕凱達(dá)、倍諾達(dá)、Abecma和CARVYKTI共8款CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品獲批上市，徹底革新了癌癥免疫治療領(lǐng)域。同樣的，CAR的加載也成為增強(qiáng)NK細(xì)胞功能的另一條重要途徑。截至2022年7月，Clinical Trials.gov.網(wǎng)站顯示已有超過20個臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行CAR-NK治療各種血液瘤和實(shí)體瘤的研究。一項(xiàng)應(yīng)用臍帶血CAR-NK細(xì)胞治療復(fù)發(fā)或難治性CD19+非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，11例患者中有7例患者獲得完全緩解而沒有出現(xiàn)CRS或ICANS[5]。Nkarta Therapeutics最近公布的NKX101（靶向NKG2D）和NKX019（靶向CD19）治療血液瘤的最新臨床數(shù)據(jù)顯示，NKX101輸注高劑量CAR-NK治療AML呈現(xiàn)良好應(yīng)答，5例受試者中3例完全緩解，其中2例是微小殘留病灶陰性（NCT04623944；Nkarta Therapeutic公布的臨床數(shù)據(jù)）（見表2）。NKX019的6例可評估患者中的5例達(dá)到客觀緩解，3例完全緩解（NCT05020678；Nkarta Therapeutic公布的臨床數(shù)據(jù)）。兩項(xiàng)試驗(yàn)中均未發(fā)現(xiàn)劑量限制毒性以及與CAR-T療法副作用相似的不良事件（Nkarta Therapeutic公布的臨床數(shù)據(jù)）。

2021年11月11日，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心審批通過了由國健呈諾生物科技（北京）有限公司研發(fā)的、針對晚期上皮性卵巢癌治療的靶向間皮素（mesothelin，MSLN）嵌合抗原受體NK細(xì)胞（CAR-NK）注射液的臨床試驗(yàn)申請（見表2）。該產(chǎn)品是由國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心正式審批通過的國內(nèi)首例“現(xiàn)貨型”異體來源的CARNK產(chǎn)品，標(biāo)志著中國免疫細(xì)胞藥物治療實(shí)體瘤研究邁入新的里程碑。

CAR-NK是通過基因工程手段修飾使其表達(dá)CAR，將識別靶細(xì)胞表面抗原的抗體與激活免疫細(xì)胞所需要的信號分子連接，可以突破抑制性受體的限制而激活NK細(xì)胞，以此增強(qiáng)NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的特異性殺傷。然而，基于CAR方法的檢測能力僅限于表面蛋白質(zhì)。雖然可以通過改造NK細(xì)胞表達(dá)TCR來檢測細(xì)胞內(nèi)抗原，但是NK細(xì)胞沒有配備T細(xì)胞中的完整信號機(jī)制，從而潛在地降低了通過合成TCR來有效激活NK細(xì)胞的能力。此外，傳統(tǒng)上為T細(xì)胞設(shè)計(jì)的CAR多被用于CAR-NK細(xì)胞的產(chǎn)生。由于T細(xì)胞和NK細(xì)胞激活及作用機(jī)制方面的巨大差異，產(chǎn)生的CAR-NK細(xì)胞可能并未達(dá)到最好的臨床療效，因此，針對NK細(xì)胞的特異性CAR結(jié)構(gòu)尤其是激活或共激活信號分子的選擇值得進(jìn)一步研究。

3.4 免疫檢查點(diǎn)抑制劑

腫瘤細(xì)胞利用NK細(xì)胞抑制受體進(jìn)行免疫逃逸的免疫檢查點(diǎn)抑制已被證明是一種有效的治療方法。NK細(xì)胞表面KIR類的抑制性受體可與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合，抑制NK細(xì)胞活化。KIR抑制性受體的這一特點(diǎn)使其成為NK細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)抑制劑的首選靶標(biāo)。IPH2101是針對KIR2DL1/2/3 NK細(xì)胞抑制受體的IgG4單克隆抗體，可作為單一療法或與其他藥物聯(lián)合使用。在前期研究中，IPH2101已用于各種惡性血液瘤或?qū)嶓w腫瘤的臨床評估[42]。然而，IPH2101治療MM的單一療法效果并不明顯[42]。臨床前研究表明，IPH2101與來那度胺聯(lián)用可增強(qiáng)NK細(xì)胞的功能而不發(fā)生自身免疫[43]。總的來說，盡管IPH2101不能作為單一的藥物用于腫瘤治療，但組合療法仍值得進(jìn)一步研究。

NKG2A/CD94是C型凝集素家族的異二聚體抑制性受體，它可識別非經(jīng)典MHC-Ⅰ分子HLA-E作為配體[15]。HLA-E在肺、胰腺、胃、結(jié)腸和肝等多種器官腫瘤中表達(dá)，與NKG2A結(jié)合可抑制NK細(xì)胞的效應(yīng)功能[44]。IPH2201是NKG2A的一種免疫檢查點(diǎn)抑制抗體。IPH2201在體外顯示出增強(qiáng)NK細(xì)胞功能的良好效果，且在一些腫瘤患者體內(nèi)試驗(yàn)中觀察到良好的耐受性[45]。與IPH2101類似，IPH2201的單一療法效果依然有限。

除了MHC-Ⅰ相關(guān)的抑制受體，還有其他一些受體涉及NK細(xì)胞的抑制性免疫檢查點(diǎn)，包括經(jīng)典的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4） 和 PD-1受體以及TIGIT、淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyteactivation gene 3，LAG-3）和T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3（T cell immunoglobulin domain and mucindomain-3，TIM-3）。在T細(xì)胞中，針對PD-1或CTLA-4的免疫檢查點(diǎn)阻斷克服了T細(xì)胞的衰竭，重建了T細(xì)胞的抗腫瘤能力[46]。盡管PD-1阻斷對NK細(xì)胞的直接影響不如對T細(xì)胞明顯，但臨床前研究表明，它可以增強(qiáng)ADCC介導(dǎo)的抗腫瘤功能[47]。目前，雖然CTLA-4阻斷的研究通常是在T細(xì)胞的背景下，但也有一些研究表明NK細(xì)胞可以增強(qiáng)CTLA-4單抗治療黑色素瘤的效果[48]。TIGIT、LAG-3和TIM-3在NK細(xì)胞中的研究較少。靶向TIGIT、LAG-3和TIM-3的阻斷抗體已在T細(xì)胞中得到研究，有待進(jìn)一步在NK細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。

因?yàn)镹K細(xì)胞的功能反應(yīng)是由激活受體和抑制受體信號的整合決定，用抑制劑阻斷抑制信號能夠顯著增強(qiáng)腫瘤患者NK細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)。然而，在使用KIR和NKG2A抗體阻斷療法時應(yīng)謹(jǐn)慎，因?yàn)橛锌赡軙茐腘K細(xì)胞的功能反應(yīng)性[42]。另外，長期使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑進(jìn)行治療可能無效，需要短期或多次注射以增強(qiáng)NK細(xì)胞的反應(yīng)。此外，T細(xì)胞也表達(dá)CTLA-4、PD-1、TIGIT、LAG-3和TIM-3等受體，臨床試驗(yàn)中很難區(qū)分抑制劑是否是作用于NK細(xì)胞產(chǎn)生的療效。

3.5 NK細(xì)胞銜接器

為了加強(qiáng)NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用并促進(jìn)NK細(xì)胞持續(xù)的抗腫瘤效應(yīng)，研究者們開發(fā)出了一種被稱為NKCEs的新型多功能抗體。NKCEs可以將NK細(xì)胞引導(dǎo)到腫瘤部位，通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的目標(biāo)抗原同時觸發(fā)NK細(xì)胞上的激活受體來引發(fā)強(qiáng)烈的抗腫瘤反應(yīng)。NKCEs的開發(fā)策略包括雙特異性或三特異性設(shè)計(jì)，靶向腫瘤上的一種或多種抗原，或通過交聯(lián)細(xì)胞因子部分，促進(jìn)NK細(xì)胞增殖和存活，旨在增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤作用。各個研究平臺已針對NK細(xì)胞表面表達(dá)的CD16A、NKG2D和NKp46等激活受體開發(fā)出不同的NKCEs，以增強(qiáng)NK細(xì)胞的臨床效果。

目前，靶向NK細(xì)胞CD16A的NKCEs研究較多且進(jìn)展最快。其中，以Affimed公司開發(fā)的AFM13為代表，這款CD16A雙特異性抗體的靶點(diǎn)是B和T細(xì)胞淋巴瘤的表面抗原CD30[49]。AFM13正處于治療多種實(shí)體瘤和惡性血液瘤的Ⅰ期或Ⅱ期臨床研究中（NCT02321592、NCT03192202、NCT01221571、NCT04101331、NCT02665650和NCT04074746）（見表2）。除了單一療法，AFM13與MD安德森癌癥中心提供的臍帶血來源的NK細(xì)胞聯(lián)用治療霍奇金和非霍奇金淋巴瘤患者的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，13例接受Ⅱ期推薦劑量治療的患者達(dá)到100%的客觀緩解率，且接受兩輪治療后完全緩解率達(dá)到62%（AACR公布的結(jié)果）（見表2）。與AFM13類似的AFM24是另一種靶向表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的雙特異性藥物，目前正處于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌的Ⅰ/Ⅱ期臨床試（NCT04259450）（見表2）。對于三特異性平臺，GT Biopharma公司通過對BiKE雙特異抗體平臺升級改造建立的TriKE平臺，引入了IL-15融合蛋白，賦予NK細(xì)胞靶向性的同時，增強(qiáng)了NK細(xì)胞的腫瘤殺傷作用[50]。目前，該平臺GTB-3550（CD16AIL-15/CD33）已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段（NCT03214666）（見表2）。

NK細(xì)胞的另一種激活受體NKG2D也可以在感染和腫瘤發(fā)生時激活NK細(xì)胞的殺傷活性。目前已經(jīng)有多個公司布局靶向NKG2D的NKCEs研究。Dragonfly Therapeutics公司核心技術(shù)平臺為TriNKET，其中在此平臺開發(fā)的DF1001（NKG2DHER2）與其他藥物聯(lián)用治療實(shí)體腫瘤已處于Ⅰ/Ⅱ期臨床研究階段（NCT04143711）。Dragonfly的另一個三特異性抗體DF7001的靶點(diǎn)是5T4，這是一種在癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)的蛋白質(zhì)，支持與多種癌癥預(yù)后不良相關(guān)的腫瘤生長。另外，Xencor公司利用其XmAb平臺同樣構(gòu)建了靶向NKG2D的雙特異性抗體，其B7-H3-NKG2D處于臨床前研究階段。

基于NKp46的雙特異性抗體的開發(fā)尚處于早期研究階段。國際上主要是Cytovia（CYT-303和CYT308） 和 Innate Pharma（IPH6101 和 IPH21）2個公司在開發(fā)相應(yīng)的抗體。IPH6101已獲得美國FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。同時，Innate Pharma在NKCE3的基礎(chǔ)上融合了IL-2v構(gòu)建的NKCE4平臺，能夠更好地激活并維持NK細(xì)胞的增殖。

NKCEs是通過靶向腫瘤上的一個或多個抗原或通過交叉連接細(xì)胞因子來增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤效果的策略[51]。相對于CAR-NK細(xì)胞的CAR加載，NKCEs無需基因編輯而能夠達(dá)到類似CAR的功能，因此制備工藝相對簡單且成本較低。此外，由于NKCEs只有在腫瘤細(xì)胞存在時才會被激活，所以臨床應(yīng)用的安全性較高且非特異性細(xì)胞因子釋放的風(fēng)險(xiǎn)較低。然而，NKCEs療法下的長期刺激可能導(dǎo)致NK細(xì)胞衰竭。通過設(shè)計(jì)間斷注射NKCEs的臨床方案避免NK細(xì)胞的持續(xù)激活或許可以解決這個問題。

4 結(jié)語與展望

隨著人們對免疫細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)知識體系的不斷完善，細(xì)胞免疫療法的時代已經(jīng)到來。相較于CAR-T細(xì)胞自體療法的種種局限性，基于NK細(xì)胞療法的優(yōu)勢日益凸顯。NK細(xì)胞的來源豐富，無論是基于飼養(yǎng)細(xì)胞的NK細(xì)胞擴(kuò)增方法，還是基于細(xì)胞因子的方法均能獲得大量的高活性的NK細(xì)胞。hPSC-NK細(xì)胞制備技術(shù)的成熟以及規(guī)?；瘮U(kuò)增平臺的建立也使得規(guī)?；苽滟|(zhì)量均一的GMP級NK細(xì)胞免疫治療產(chǎn)品成為可能。然而，NK細(xì)胞擴(kuò)增的過程涉及到癌癥免疫療法的劑量、安全性、有效性和成本，這些研究是過繼治療臨床規(guī)模應(yīng)用的基礎(chǔ)。

日益發(fā)展的基因編輯技術(shù)提供了優(yōu)化NK細(xì)胞治療的可能，通過引入CAR、靶向激活受體和敲除抑制性分子等修飾可增強(qiáng)NK細(xì)胞治療效果。然而，PB-NK、UC-NK和胎盤源NK等天然NK細(xì)胞的基因工程存在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)困難、細(xì)胞編輯效率低、編輯后細(xì)胞存活率低等一系列問題。雖然iPSC衍生的NK細(xì)胞可能從根本上解決基因編輯的問題，但其衍生的NK細(xì)胞與體內(nèi)發(fā)育的NK細(xì)胞生物學(xué)的差異、臨床有效性和安全性仍然需要長期臨床研究驗(yàn)證。隨著過繼細(xì)胞免疫療法的發(fā)展，目的基因的遞送技術(shù)也取得重大突破。目前，除了廣泛使用的慢病毒或者γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒載體遞送方式，睡美人和PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、CRISPR/Cas9、mRNA和納米載體等非病毒載體技術(shù)也是克服基因轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙的新型解決方案。雖然NK細(xì)胞在治療惡性血液病方面取得良好的臨床療效，但對于實(shí)體瘤的治療效果有限，基于編輯的策略抑制腫瘤免疫微環(huán)境、增強(qiáng)NK細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的活性也是治療實(shí)體瘤的有效策略。大量的臨床前和臨床研究已表明基于NK細(xì)胞、細(xì)胞因子拮抗劑、免疫檢查點(diǎn)抑制劑、單克隆抗體以及雙特異性或多特異性抗體的單一療法臨床效果有限。因此，結(jié)合兩種或兩種以上的聯(lián)合療法可能是基于NK細(xì)胞免疫療法發(fā)展的必然趨勢?？傊?，基于NK細(xì)胞的免疫療法已經(jīng)成為一種成熟的、不斷發(fā)展的癌癥免疫療法，在治療多種癌癥方面有著巨大的潛力。