趙慶華，路廣金，鄒紹林，張 沖，趙亞選，宣元元，季相山*

（1.山東省濟(jì)寧市微山縣畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東 濟(jì)寧 277600；

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 泰安；3.山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安）

進(jìn)入21 世紀(jì)以來，研究腸道微生物已經(jīng)逐漸成為全球生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)之一，人們逐漸認(rèn)識到腸道微生物是人類和動物非常重要的“功能性器官”，甚至還被稱為“第二大腦”，是一個信號中樞，可接收環(huán)境刺激信號（如食物）與遺傳和免疫信號進(jìn)行整合，繼而影響宿主的新陳代謝、免疫和感染應(yīng)答[1-3]。乳酸菌（Lactic acid bacterium）是腸道微生物的重要組成菌株，也是微生態(tài)制劑的重要組成菌株，包括種類較多，如戊糖片球菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌等。戊糖片球菌在2014 年被衛(wèi)生部納入可食用菌種名錄。近年來，戊糖片球菌的分離來源逐漸豐富，在哺乳動物、禽類和淡水蝦腸道中均證實(shí)存在[4-5]。研究表明，戊糖片球菌是肉雞腸道內(nèi)的原生微生物菌株，在肉雞日糧中添加1.0×109～1.0×1011CFU/g戊糖片球菌可以顯著提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化率、生長性能以及產(chǎn)肉性能，也可增強(qiáng)肉仔雞的免疫功能[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)室分離了一株戊糖片球菌PP-23，表現(xiàn)出良好的產(chǎn)乳酸性能和較好的培養(yǎng)性能[8]，但其在促進(jìn)肉雞生長和免疫方面的效果尚未可知。本試驗(yàn)旨在研究戊糖片球菌PP-23 對肉雞早期生長性能、免疫性能及腸道形態(tài)的影響，以評價其作為飼料添加劑的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌株戊糖片球菌PP-23 為實(shí)驗(yàn)室前期分離、保存的菌株。菌體細(xì)胞呈球狀，不延長，多個菌體連成一片，呈現(xiàn)短鏈球形（圖1），革蘭氏染色為陽性（圖2）。

圖1 菌落形態(tài)圖

圖2 菌株革蘭染色結(jié)果

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 挑選健康的1 日齡的體重相近的240 只肉仔雞，隨機(jī)分為5 組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)16 雞。分別為對照C0 組：投喂基礎(chǔ)日糧；T1 組：持續(xù)投喂基礎(chǔ)日糧＋1.0×107CFU/gPP-23；T2 組：投喂基礎(chǔ)日糧＋1.0×107CFU/gPP-23 2 周后，投喂1 周基礎(chǔ)日糧；T3組：持續(xù)投喂基礎(chǔ)日糧＋1.0×108CFU/gPP-23；T4 組：投喂基礎(chǔ)日糧＋1.0×108CFU/gPP-23 2 周后，投喂1 周基礎(chǔ)日糧。試驗(yàn)期為3 周。參照NRC《肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》配制AA 肉雞基礎(chǔ)試驗(yàn)日糧。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)前先將所用試驗(yàn)用具進(jìn)行清洗，雞舍整體消毒，通風(fēng)5~6 d，仔雞進(jìn)雞舍前將室內(nèi)溫度升至37 ℃；飼養(yǎng)過程中采用人工光照、半自動人工飲水系統(tǒng)，試驗(yàn)雞自由采食和飲水。

1.2.3 測定指標(biāo)及方法 （1）生長性能：試驗(yàn)期間嚴(yán)格記錄日投料量、余料量、死淘數(shù)。試驗(yàn)結(jié)束后，AA 肉雞饑餓處理12 h 后稱重（FW），同時稱量各組剩余飼料量計(jì)算各試驗(yàn)組平均日采食量（ADFI）、日增重（ADG）、料重比（F/G）。（2）屠宰性能：試驗(yàn)肉雞飼養(yǎng)結(jié)束后禁食12 h，每個重復(fù)中隨機(jī)選取2 只肉雞稱重，靜脈放血處死后屠宰解剖進(jìn)行稱重。半凈膛重：屠體重去除胰腺、腸道、氣管、食道、嗉囊、脾臟、膽囊和生殖器官稱重。全凈膛重：半凈膛去除頭、心臟、肝臟、爪、腺胃、肌胃、腹脂、脛后稱重。屠宰率=屠體重/活重×100 %；半凈膛率=半凈膛重/活重×100 %；全凈膛率=全凈膛重/活重×100 %；取一側(cè)胸肌和一側(cè)腿肌稱重。胸肌率=胸肌重/全凈膛重×100 %；腿肌率=腿肌重/全凈膛重×100 %。肝臟、脾臟、胸腺和法氏囊稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)：免疫器官重量占雞體重的相對重量比值（g/kg）。（3）基因表達(dá)的測定：取脾臟及空腸保存于液氮中，提取總RNA 1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測后 -80 ℃保存?zhèn)溆?。總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進(jìn)行qRT-PCR 分析，體系組成：TB Green Premix Ex Taq 10 μl，Primer F（R）各0.4 μl，cDNA 2 μl，dd H2O 7.2 μl；反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性30 s，1 Cycle；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40 Cycles。所用引物見表1。使用2-??CT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析計(jì)算免疫相關(guān)基因的相對表達(dá)量。（4）腸道組織切片制作：每個重復(fù)隨機(jī)取2 只肉雞解剖，截取雞的十二指腸、空腸及回腸的中段各0.5 cm，1×PBS 溶液清洗后，放入3 倍體積的4 % PBS-PFA 多聚甲醛中，經(jīng)脫水、包埋、切片、HE 染色、中性樹脂封片后在顯微鏡下觀察腸道組織形態(tài)。

表1 熒光定量引物信息

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Graphpad prism8.0、IBM SPSS Statis-tics 21.0 軟件處理數(shù)據(jù)，利用SPSSStatistics 21（SPSS, Inc., Chicago, Illinois.）進(jìn)行turkey 檢驗(yàn)，分析各組間的差異。P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 戊糖片球菌PP-23 對AA 肉雞生長性能的影響與C0 組相比，T1 組FW 和ADG 均顯著提高，

F/G 顯著降低，ADFI 差異不顯著；T2、T3 和T4組各指標(biāo)均差異不顯著（表2）。

表2 日糧中添加不同濃度戊糖片球菌后對肉雞生長性能的影響

2.2 戊糖片球菌PP-23 對AA 肉雞屠宰性能的影響

由表3 可見，與C0 組相比，T1 組半凈膛率和全凈膛率、T3 組全凈膛率均顯著升高，T2、T4 組差異不顯著。所有試驗(yàn)組的腹脂率、胸肌率和腿肌率與對照組差異不顯著。

表3 日糧中添加不同濃度戊糖片球菌對肉雞屠宰指標(biāo)的影響 （%）

2.3 戊糖片球菌PP-23 對AA 肉雞免疫器官指數(shù)的影響

由表4 可見，與C0 組相比，T3 組法氏囊指數(shù)顯著升高，T1、T2、和T4 組差異不顯著。所有試驗(yàn)組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與對照組均差異不顯著。

表4 日糧中添加不同濃度戊糖片球菌對肉雞免疫器官指數(shù)的影響 （g/kg）

2.4 戊糖片球菌PP-23 對AA 肉雞脾臟和空腸免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖3 可知，與C0 組相比，除T4 組脾臟IL-1β基因與對照組差異不顯著，其他組基因表達(dá)水平均顯著下調(diào)。

圖3 添加不同濃度戊糖片球菌對肉雞空腸（a，b）和脾臟（c，d）免疫基因表達(dá)的影響

2.5 戊糖片球菌PP-23 對AA 肉雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表5、圖4 可見，與C0 組相比，T1 和T2 組肉雞中十二指腸和回腸的絨毛高度顯著提高，T1～T4 組空腸絨毛高度均顯著提高；T1、T2 組十二指腸的隱窩深度顯著升高，T3 組回腸的隱窩深度顯著降低；T1、T2 組十二指腸絨毛寬度顯著升高；各試驗(yàn)組空腸絨毛寬度顯著升高；T1、T2 組空腸和回腸絨隱比顯著提升；T4組十二指腸肌層厚度顯著提升，T1、T3 組空腸肌層厚度顯著降低。其他指標(biāo)與對照組差異不顯著。

圖4 各組AA 肉雞空腸、回腸、十二指腸形態(tài)

表5 添加不同濃度戊糖片球菌PP-23 對肉雞腸道形態(tài)的影響 （μm）

3 討論

畜禽的日增重和耗料增重比是反映益生菌制劑有效性和經(jīng)濟(jì)性的重要指標(biāo)[9]。乳酸菌是雞腸道中的原生菌群，飼料中加入適量的乳酸菌會對動物產(chǎn)生有益的影響[10]。據(jù)宋小燕等[11]、ShoKryazdan 等[12]的研究，在日糧中添加乳酸菌，肉雞的平均日增重明顯升高，料重比明顯降低。戊糖片球菌是乳酸菌的一種，具有促進(jìn)機(jī)體吸收營養(yǎng)物質(zhì)的作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明在肉雞日糧中添加戊糖片球菌PP-23 可以顯著提高肉仔雞的平均日增重，降低料重比。有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌對肉雞屠宰性能影響極小或無[13]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飼料中添加戊糖片球菌PP-23，結(jié)果顯示各屠宰指標(biāo)均有上升趨勢但無顯著性差異，這與李菊等[13]的研究相一致。

IL-1β屬于白細(xì)胞介素，是一種促炎性的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用，IFN-γ是淋巴細(xì)胞分泌的具有免疫調(diào)控作用的一種糖蛋白。Ateya 等[14]在受大腸桿菌感染的肉雞的日糧中添加益生菌、酸化劑和共生菌可以降低回腸IL-1β的表達(dá)；Han[15]在肉雞日糧中補(bǔ)充戊糖片球菌，發(fā)現(xiàn)其回腸中IL-1β表達(dá)的下調(diào)。本試驗(yàn)研究也表明PP-23 能使肉雞空腸中IL-1β的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），各試驗(yàn)組空腸中IFN-γ的表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05）。說明戊糖片球菌可以通過調(diào)節(jié)IL-1β和IFN-γ的表達(dá)調(diào)節(jié)動物免疫力。脾臟、胸腺和法氏囊是家禽的主要免疫器官，其免疫器官重量的增長可以直接用于評價肉雞的免疫狀況[16]。大量研究表明乳酸菌能夠促進(jìn)免疫器官的生長，提高免疫器官指數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞日糧中添加乳酸菌制劑可以提高雞的脾臟、法氏囊和胸腺指數(shù)[17-18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明在肉雞飼料中添加戊糖片球菌PP-23，可以提高脾臟、胸腺和法氏囊指數(shù)，提高機(jī)體免疫力。

腸道絨毛高度、隱窩深度和絨/隱比是衡量腸道吸收能力的重要指標(biāo)。絨毛的高度與腸道吸收營養(yǎng)的能力成正比，絨毛越高吸收能力強(qiáng)，相反則吸收能力差。研究發(fā)現(xiàn)益生菌可以調(diào)控腸道微生物菌群，進(jìn)而影響腸道屏障的功能和發(fā)育，從而提高肉雞小腸的絨毛高度[19]。王磊等[20]在基礎(chǔ)日糧中添加2×106CFU/kg 的復(fù)合益生菌（乳酸菌+枯草芽孢桿菌），肉雞回腸的隱窩深度和絨毛高度都顯著提高；史洪濤[21]在817 肉雞日糧中添加乳酸菌，結(jié)果顯示能夠明顯的提高817 肉雞小腸的絨毛高度、降低隱窩深度，從而使絨/隱比升高。本實(shí)驗(yàn)研究表明在AA 肉雞飼料中添加戊糖片球菌PP-23 可提高腸道絨毛高度、隱窩深度和絨/隱比。這些指標(biāo)的增加表明腸道可更好地吸收營養(yǎng)物質(zhì)[22]，從而提高肉雞的生長性能。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在AA 肉雞日糧中添加戊糖片球菌PP-23 可顯著提升肉雞的生長速度，并能增強(qiáng)肉雞的免疫性能，適宜添加濃度為1.0×107CFU/g，最佳飼喂方式是持續(xù)飼喂。