蘆春雪，盧麗婷，李希冉，殷淑潔，馮 靜，劉 歡，馬兆謙，周百靈，任 景，沈叢叢，黃平平，于 雪

（德州學(xué)院生物物理研究院/山東省生物物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 德州 253023）

卵母細(xì)胞和精子質(zhì)量是決定受精成功的兩個(gè)主要因素，而胚胎發(fā)育和著床有著復(fù)雜的生物學(xué)途徑調(diào)控，還取決于子宮內(nèi)膜的容受性，涉及許多分子的調(diào)控（如mRNA、ncRNA 和蛋白質(zhì)）[1]。在雌性配子發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞經(jīng)歷了從胚胎時(shí)期原始卵母細(xì)胞的形成到減數(shù)分裂啟動(dòng)以及排卵的復(fù)雜過程。在胚胎階段，卵母細(xì)胞被包裹在一個(gè)卵巢體細(xì)胞和顆粒前細(xì)胞組成的體系中，然后成長(zhǎng)為原始卵泡池。原始卵泡池是包括人類在內(nèi)的大多數(shù)哺乳動(dòng)物的胚胎期產(chǎn)物，代表了雌性的卵巢儲(chǔ)備。而受精后胚胎的質(zhì)量主要取決于優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇，這一過程受到相關(guān)抑制素的調(diào)控，研究表明，抑制素在排卵期表達(dá)較低，當(dāng)卵泡排卵或閉鎖后，抑制素表達(dá)又升高[2]。因此，研究抑制素及其在生殖生理方面的調(diào)控機(jī)制有利于提高種豬繁育能力[3]，增加生豬產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，使得生豬產(chǎn)業(yè)效益最大化。能從最根本上解決生豬養(yǎng)殖產(chǎn)量問題，化解繁殖問題對(duì)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的影響。

抑制素（Inhibin，INH）是性腺分泌的一種糖蛋白激素，具有抑制垂體促卵泡素合成和分泌的作用。由抑制素α 亞基（INHA）、抑制素βA亞基（INHBA）、抑制素βB 亞基（INHBB）組成。筆者前期針對(duì)抑制素的INHA、INHBA 兩個(gè)亞基進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，證實(shí)兩者均在卵泡發(fā)育和產(chǎn)仔數(shù)方面有重要作用[4]，但是針對(duì)INH的研究大部分集中在轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控存在較大空白，而lncRNAs 涉及轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄中以及轉(zhuǎn)錄后多層次調(diào)控，將有助于填補(bǔ)這一空白。研究證實(shí)lncRNA 可能通過組蛋白修飾和染色

質(zhì)重塑等方式，在雌性生殖過程中發(fā)揮作用[5-6]。文獻(xiàn)顯示，卵母細(xì)胞成熟、精子形成、受精過程和胚胎發(fā)育等生殖過程，均受到卵丘細(xì)胞和精子細(xì)胞中的多種lncRNA 的調(diào)控?；诖吮狙芯繑M利用生物信息學(xué)方法，在NON CODE 數(shù)據(jù)庫中通過INHBA 的序列推導(dǎo)功能關(guān)聯(lián)，綜合分析篩選INHBA 相關(guān)lncRNAs，再經(jīng)分子生物學(xué)方法在細(xì)胞水平進(jìn)行功能驗(yàn)證，以期豐富豬顆粒細(xì)胞增殖凋亡及生殖激素自/旁分泌的lncRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，加深對(duì)豬卵泡發(fā)育的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，在挖掘、利用繁殖相關(guān)分子標(biāo)志物等方面都具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選擇發(fā)情間期和發(fā)情期的杜長(zhǎng)大三元雜交健康母豬的卵巢為實(shí)驗(yàn)材料，卵巢采自山東夏津縣新希望六和種豬場(chǎng)，采集后首先進(jìn)行酒精消毒，PBS 緩沖液清洗后，冰上保存，1~2 h 內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。再用PBS 緩沖液重復(fù)清洗2 次，選擇明亮的大卵泡，采用10 ml 針管抽吸卵泡液，于超凈臺(tái)內(nèi)打入15 ml 離心管中，加PBS 混勻，1 200 r/min 離心 3 min，棄上清，重復(fù)洗滌1次，將卵巢顆粒細(xì)胞平鋪于60 mm 培養(yǎng)皿中，加2 ml 完全培養(yǎng)基（Hyclone DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+15 % 胎牛血清FBS+2 % 青鏈霉素），首先用培養(yǎng)液吹打培養(yǎng)基，然后晃動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞分散開來，最后放置于37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 候選lncRNAs 的篩選 NCBI 在線數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/）檢索INHBA 基因，通過ORF 獲取其3’UTR 序列，根據(jù)lncRNA 對(duì)靶基因海綿屏蔽效應(yīng)（ceRNA）的作用機(jī)理，利用NONCODE 數(shù)據(jù)庫（http://www.noncode.org/）的BLAST 工具，匹配出與INHBA 3’UTR 序列互補(bǔ)配對(duì)的lncRNA。

1.2.2 候選lncRNAs 與INHBA 基因靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)候選lncRNAs 是根據(jù)INHBA 基因的3’UTR 序列互補(bǔ)預(yù)測(cè)得來的，lncRNA 和目的基因之間存在高度同源，為了進(jìn)一步確定兩者之間確實(shí)存在相互作用，通過在線軟件 IntaRNA（http://rna.informatik.uni-freiburg.de/IntaRNA/Input.jsp ） 對(duì)INHBA 上的靶位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞RNA 提取及檢測(cè) 參照天根RNA Easy Fast 動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA 提取試劑盒說明書提取 RNA。吸取 1 μl RNA 洗脫液滴加在Nanodrop 2 000 核酸濃度測(cè)定儀樣品采集孔，進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)。

1.2.4 RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 反應(yīng)液需要在冰上配置，在無RNA 酶的PCR 管中加入以下成分混勻：5X Evo M-MLVRT Master Mix，2 μl；Total RNA*1< 500 ng，RNase free water up to 10 μl，反應(yīng)程序設(shè)置：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 sec，4 ℃。

1.2.5 RT-qPCR （1）定量引物的設(shè)計(jì)。應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫NCBI 的Primer Blast 軟件針對(duì)候選lncRNAs 及內(nèi)參基因β-actin 的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，送青島生工生物科技有限公司合成，其引物序列如表1 所示。（2）熒光定量PCR 的反應(yīng)體系（25 μl）如表2。按照上述體系混勻后加入96 孔板（注意避光），上機(jī)檢測(cè)。（3）熒光定量PCR的擴(kuò)增條件：熒光定量PCR 采用羅氏 Light-Cycler 96 System 進(jìn)行，反應(yīng)條件如表3 所示。利用2-△△Ct方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平，β-actin 為內(nèi)參基因。

表1 引物序列

表2 RT-qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系

表3 三步法PCR 反應(yīng)程序

2 結(jié)果與分析

2.1 候選lncRNAs 的篩選

在NONCODE 數(shù)據(jù)庫中利用BLAST 功能，如表4 所示，得到與INHBA 匹配度評(píng)分較高的5 條lncRNAs，因lncRNA 片段過大不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展，特別是全長(zhǎng)的擴(kuò)增，因此筆者最終選擇了NONSUST018655.1 和NONSUST030736.1兩條lncRNAs 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分析。

表4 lncRNA 基因篩選結(jié)果得分

2.2 候選lncRNAs 對(duì)INHBA 作用靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

通過在線軟件IntaRNA 對(duì)候選lncRNAs 在INHBA 基因上的作用靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，筆者得知NONSUST018655.1 的1105-1326 bp 與INHBA 基因的882-1102 bp 區(qū)間存在直接調(diào)控作用；NONS UST030736.的599-818 bp 與INHBA 基因的881-1 099 bp 區(qū)間存在直接調(diào)控作用。

2.3 豬顆粒細(xì)胞培養(yǎng)

取發(fā)情期和發(fā)情間期豬卵巢，消化培養(yǎng)豬顆粒細(xì)胞，可看到消化所得細(xì)胞密度適中，完全具有擴(kuò)增能力。原代培養(yǎng) 3d 的豬顆粒細(xì)胞（PGCs）形態(tài)，可見貼壁伸展發(fā)育的形態(tài)。傳4代后細(xì)胞狀態(tài)，可見細(xì)胞形態(tài)正常，仍然可以維持增殖，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。

2.4 候選lncRNAs 在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)分析

利用RT-qPCR 方法進(jìn)行檢測(cè)候選lncRNAs在發(fā)情間期和發(fā)情期卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)水平，結(jié)果如圖1 所示，NONSUST018655.1 和NONS UST 030736.1 在發(fā)情期卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)水平顯著上升，提示這兩個(gè)lncRNAs 可能對(duì)INH 存在調(diào)控功能，可以作為后續(xù)功能試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖1 候選lncRNAs 在發(fā)情間期和發(fā)情期卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)水平

3 討論與結(jié)論

lncRNA 的預(yù)測(cè)方法有很多[7]，包括通過序列預(yù)測(cè)其功能，其中已知lncRNA 轉(zhuǎn)錄本信息來自于Ensembl 數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫中標(biāo)記“antisense”和“l(fā)incRNA”被認(rèn)為是已知的或者潛在已知的lncRNA 轉(zhuǎn)錄本；有通過在UCSC 數(shù)據(jù)庫對(duì)基因上下游進(jìn)行搜索，還有通過在NONCODE 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列BLAST（3’-UTR 結(jié)合）來分析預(yù)測(cè)，這也是本研究采用的預(yù)測(cè)方式。另外，lncRNA的調(diào)控機(jī)制也有多種，在不同的生理環(huán)境下都會(huì)有不同的作用機(jī)制。部分 lncRNA 可以作為miRNA 的海綿，通過海綿效應(yīng)來吸附miRNA，進(jìn)而對(duì)生理活動(dòng)有所影響，最終影響生物表型的變化[8]，比如在HCC（原發(fā)性肝癌當(dāng)中最常見的一種肝細(xì)胞癌）中自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制中，結(jié)合熒光素酶測(cè)定的結(jié)果表明miR-181a-5p 被CCAT1 通過海綿效應(yīng)吸附調(diào)節(jié)自噬，進(jìn)而增加ATG7 的表達(dá)[9]。有的lncRNA 可以通過直接和多層次生物分子，比如蛋白質(zhì)分子、核酸分子等物質(zhì)結(jié)合，以此來調(diào)控lncRNA 對(duì)目標(biāo)基因的作用，最后參與目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄等生理活動(dòng)來調(diào)控生物表型[10]。本研究結(jié)果顯示 NONSUST018655.1 和 NONSUST 030736.1 表達(dá)量在發(fā)情間期表達(dá)水平較低，而發(fā)情期卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)水平顯著上升，這一表達(dá)規(guī)律與INH 表達(dá)規(guī)律呈負(fù)相關(guān)，且本身與INHBA 又有作用位點(diǎn)，因此提示這兩個(gè)候選lncRNAs 極有可能對(duì)INH 存在結(jié)合調(diào)控功能。但對(duì)于NONSUST018655.1 和NONSUST0 30736.1的信息十分有限，有待后續(xù)其他功能性驗(yàn)證，才能進(jìn)一步明確其調(diào)控機(jī)制。