劉 鑫，張夢佳，郝 晴，王艷雪，孫 晴*，馬敬國

（1.臨沂大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 臨沂 276000；2.山東省平邑縣畜牧發(fā)展促進中心，山東 平邑）

臨沂市某羊場根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查懷疑感染肺炎支原體，本實驗對送檢病料進行支原體的分離培養(yǎng)，并作形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光鑒定，確診為羊支原體肺炎。羊支原體肺炎是絲狀支原體感染引起的一種高度接觸性呼吸道傳染病，根據(jù)其臨床癥狀和病程可分為最急性、急性和慢性肺炎。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大以及養(yǎng)殖密度的提高，羊疫病的發(fā)生也越來越頻繁，嚴重威脅著羊群的健康生長，甚至給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟損失[1-2]。目前首選藥物常為抗生素類藥物，但此類藥物長期使用會產(chǎn)生耐藥性進而導(dǎo)致治療效果不佳[3]。在中醫(yī)臨床中針對羊支原體肺炎的治療主要是以清熱解毒、宣肺祛痰和消食理氣為主。研究成員對麻杏石甘湯[4]和清肺通絡(luò)方[5]進行辯證加減組方[6]，在此基礎(chǔ)上再結(jié)合現(xiàn)代科技制備成中藥噴霧劑，發(fā)揮藥效的同時方便給藥途徑。該研究對中藥噴霧劑的研制不僅適用于羊肺炎支原體感染，同時為其他動物和人肺炎支原體感染的防治提供新思路，為中藥新劑型的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 支原體基礎(chǔ)培養(yǎng)基、支原體瓊脂培養(yǎng)基，購自海博生物技術(shù)有限公司；滅菌馬血清、姬姆薩染液，購自美谷生物科技有限公司；細菌微量生化鑒定管、抗菌藥物藥敏試紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.2 中藥材 麻黃、杏仁（去皮尖）、甘草、石膏、連翹、黃芩、金銀花、桔梗均由中藥學(xué)實驗室提供。

1.1.3 樣本 患病羊咽拭子、血清、心、肺。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀 病羊臨床癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、食欲不振、精神萎靡、消瘦、生長發(fā)育緩慢。特征性剖檢變化是胸和胸膜發(fā)生漿液性與纖維素性炎癥，其中最急性型主要表現(xiàn)在體溫突然升高（達41 ℃ 以上），且采食基本廢絕，呼吸困難，每次呼吸都伴隨全身肌肉顫動，持續(xù)3 d 左右就會死亡；急性型也伴隨著體溫升高，同時還會不斷的咳嗽，并從濕咳轉(zhuǎn)變?yōu)楦煽龋殡S有漿液性鼻漏，治療不及時大多數(shù)情況下會在15~30 d 后死亡；慢性型的癥狀比較輕微，大多數(shù)病羊身體虛弱，營養(yǎng)不良，雖然死亡率并不高，但是有可能會因為繼發(fā)感染出現(xiàn)死亡（圖1）。

圖1 發(fā)病羊群的臨床癥狀

1.2.2 羊肺炎支原體的分離培養(yǎng) （1）取病料無菌接種支原體液體培養(yǎng)基，于37 ℃ 含有5 %CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，液體由紅變黃且渾濁為長菌現(xiàn)象。（2）將上述菌液1:10 稀釋，取1 ml 稀釋液涂布于支原體瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃含有5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。瑞氏姬姆薩染液染色顯微鏡觀察。

1.2.3 生化鑒定 選用生化鑒定管：葡萄糖、尿素、蕈糖、甘露糖、果糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、硝酸鹽，對分離的羊肺炎支原體進行生化試驗。

1.2.4 羊肺炎支原體對抗生素敏感性試驗 取100 μl 菌液于1 ml 生理鹽水中均勻涂布于支原體瓊脂培養(yǎng)基，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面，同培養(yǎng)基等距貼6 張藥敏紙片（四環(huán)素、環(huán)丙沙星、紅霉素、卡那霉素、左氧氟沙星、恩諾沙星），于37 ℃含有5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱中放置培養(yǎng)3～5 d，后測抑菌圈的直徑大小。

1.2.5 中藥噴霧劑的制備 （1）組方。根據(jù)麻杏石甘湯[4]和清肺通絡(luò)方[5]辯證加減方：麻黃9 g、杏仁（去皮尖）5 g、甘草 6.5 g、石膏9.5 g、連翹15 g、黃芩9.5 g、金銀花15 g、桔梗15 g。（2）中藥噴霧劑濃縮液的配制。稱取藥材1:8 純水浸泡2 h-水浴加熱回流2 h，留濾液-剩余藥渣1:6 繼續(xù)回流并濃縮，至藥材重量與濃縮藥液體積比為 0.6~2 g/ml-藥液 1:6 的 80 %（V/V）乙醇中，靜置沉淀1 h，濾過；濾液回收乙醇，濃縮濾液至藥材重量與濃縮藥液體積比為0.6~1.1 g/ml，即得濃縮液。（3）中藥濃縮液抑菌試驗。制備不同濃度藥液的藥敏紙片進行一次抑菌試驗，于相同條件下再進行兩組重復(fù)試驗。藥敏試紙的制備：用打孔機將定性濾紙制作成直徑為6 mm 的圓形濾紙，分裝到5 支干燥潔凈的小玻璃瓶內(nèi)，10 片/瓶，放入高壓蒸汽滅菌，再放入80 ℃ 干燥箱烘干備用。將濃縮液倍比稀釋（1:1、1:2、1:4、1:8、1:16 共五組藥液），各取1 ml 于無菌EP 管，每支中放入10 片圓形濾紙，浸泡24 h。篩選抑菌圈最大的濃度為最適濃度用于制備噴霧劑。（4）中藥制劑與抗生素藥物抑菌效果比較。1.2.4 試驗中選取敏感藥物四環(huán)素和環(huán)丙沙星和中藥試紙片敏感組進行藥敏實驗比較。（5）中藥噴霧劑的制備及質(zhì)量控制。①取最適濃縮液，加入99 % 的甘油1:10 稀釋，攪拌藥液至澄清狀態(tài)，加入對羥基苯甲酸乙酯作為防腐劑配制成合規(guī)藥液。灌封于滅菌的不透明金屬瓶內(nèi)，安裝手動泵既得。②噴霧劑的質(zhì)檢：外觀和裝量差異檢查；粒度檢查；每噴噴量檢查；微生物限度檢查，均應(yīng)符合藥品質(zhì)量標準。

1.2.6 藥效試驗 將制備的噴霧劑交由養(yǎng)殖場工作人員，由養(yǎng)殖人員對患病羊進行噴鼻，2 次/d，每次5 噴，連續(xù)給藥10 d，每天觀察治療效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

肺炎支原體于固體培養(yǎng)基中肉眼可見，菌落大小如針尖，細小光滑，圓形（圖2A），將培養(yǎng)基倒置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌落為球形、邊緣鈍圓，無中間臍，成熟菌落變?yōu)榈S色乃至棕黃色（圖2B），因革蘭氏染色著色不佳，選用瑞氏姬姆薩染色后油鏡下多為淡紫色且多呈桿狀、分支絲狀（圖2C），與報道描述一致。

圖2 形態(tài)學(xué)觀察

2.2 生化鑒定

生化鑒定結(jié)果顯示，分離的肺炎支原體分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解尿素的生物學(xué)特性（表1）。

表1 生化鑒定結(jié)果

2.3 藥物對羊肺炎支原體的抑制試驗

2.3.1 羊支原體對抗生素敏感性試驗結(jié)果 本藥敏試驗選用臨床常用藥物的藥敏試紙片，結(jié)果表明，四環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、恩諾沙星藥物對羊肺炎支原體的抑制作用較強，而紅霉素?zé)o效（圖3，表2）。

表2 羊支原體對抗生素藥敏試驗結(jié)果

2.3.2 不同濃度中藥濃縮液抑菌試驗結(jié)果 通過三次平行試驗，對比五組不同濃度的中藥濃縮液的抑菌圈直徑大小。結(jié)果顯示藥液三組1:4 稀釋對羊肺炎支原體有最大抑制作用（圖3，表3）。

表3 不同濃度藥物濃縮液抑菌試驗結(jié)果

圖3 不同濃度中藥濃縮液三次平行藥敏試驗結(jié)果（A、B、C）

2.3.3 中藥制劑與抗生素藥敏試驗比較 根據(jù)2.3.1 和2.3.2 實驗結(jié)果篩選對肺炎支原體敏感抗生素四環(huán)素、環(huán)丙沙星與中藥濃縮液（1:4）作對照試驗，結(jié)果顯示所制中藥濃縮液抑菌效果穩(wěn)定，且與臨床用于治療支原體肺炎的抗生素效果相當(dāng)（圖4）。

圖4 中藥和抗生素藥敏試驗結(jié)果

2.4 藥效試驗

連續(xù)給藥10 d 后，患病羊群體溫恢復(fù)正常值，咳嗽癥狀明顯減輕，漿液性鼻汁癥狀緩解，食欲、精神恢復(fù)，毛色較發(fā)病時有光澤。

3 討論與結(jié)論

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是治療羊支原體肺炎的首選藥物，但是抗生素的耐藥性現(xiàn)象日益突出，國內(nèi)也開發(fā)出了一系列中草藥制劑用于畜類的治療，但治療多采取口服、肌肉注射等途徑給藥，口服給藥劑量大，因中藥靶點并非西藥那么明確，極易產(chǎn)生首過效應(yīng)，藥物在胃腸道易被破壞；肌肉注射藥物生物利用度低，影響藥效，口服給藥或注射均較難起效。噴霧劑本身具有獨特的劑型優(yōu)勢，可避免首過效應(yīng)，并具有制備簡單、起效快、劑量小、使用安全方便的特點，隨著制劑新技術(shù)的發(fā)展和質(zhì)量控制水平的提高，中藥噴霧劑可充分發(fā)揮傳統(tǒng)中醫(yī)藥的特色，促進中藥的二次開發(fā)，創(chuàng)造更大的社會效益和經(jīng)濟效益[7-8]。

在本試驗中制備的中藥噴霧劑直接作用于羊的呼吸道黏膜，藥物分布均勻，起效快，適用于呼吸系統(tǒng)疾病，極大方便給藥。因病料樣本較少實驗結(jié)果不夠全面，實驗室制備樣本數(shù)量及規(guī)格對于羊群大規(guī)模治療存在局限性，但新中藥組方制成的噴霧劑對羊肺炎支原體有較為良好的抑制作用，后續(xù)可以嘗試擴大生產(chǎn)規(guī)模并應(yīng)用到其他患病動物，為動物感染肺炎支原體的治療提供技術(shù)支撐，減少養(yǎng)殖業(yè)的的經(jīng)濟損失。