谷曉雨，李會(huì)，張佩，劉軒嘉，李博文，劉超怡

蒲公英為菊科植物，又名婆婆丁、黃花地丁及黃花三七等，其化學(xué)成分主要有黃酮類、植物甾醇類、香豆素類、倍半萜類及揮發(fā)油類等[1]。蒲公英苦甘寒，歸肝胃二經(jīng)，具有清熱解毒、散結(jié)及利尿活血等功效[2]。多篇研究報(bào)道蒲公英對(duì)細(xì)菌、真菌及病毒有不同程度的抑菌作用[3-5]。金銀花自古被譽(yù)為清熱解毒的良藥，其性味甘寒而不傷胃，芳香透達(dá)又可祛邪，既可宣風(fēng)散熱，還可清熱解毒，用于治療身熱、發(fā)疹、發(fā)斑及咽喉腫痛等各種熱性病[6]。多篇報(bào)道顯示金銀花具有廣譜抗菌作用。蒲公英和金銀花為廣泛使用的中藥，其水提劑與顆粒劑的抑菌效果差異尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在比較蒲公英、金銀花水提劑與顆粒劑的抑菌效果，觀察兩者聯(lián)用的抑菌效果，為藥物使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)藥品：蒲公英全草、蒲公英根、金銀花均購(gòu)自河南省張仲景大藥房股份有限公司。蒲公英顆粒劑由江西和明藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z36021952，規(guī)格：每袋裝10 g，相當(dāng)于6.5 g飲片；金銀花由江西和明藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20063606，規(guī)格：每袋裝10 g，相當(dāng)于3.5 g飲片。(2)實(shí)驗(yàn)菌株：標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌 ATCC25922、白色念珠菌ATCC10231、蠟樣芽孢桿菌ATCC14579均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏管理中心；金黃色葡萄球菌ATCC29213購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。(3)實(shí)驗(yàn)試劑：M-H(A) 瓊脂、M-H(B)肉湯購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；0.9%NaCl注射液購(gòu)自山東齊都藥業(yè)有限公司。(4)實(shí)驗(yàn)儀器及耗材：SW-CJ-1FD超凈臺(tái)，購(gòu)自上海錦昱科學(xué)儀器有限公司；SC-329CA海爾冰箱；BGZ-246干燥箱、BXM-30R立式高壓滅菌器，購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DRAGON移液槍；DHP-9162數(shù)顯電熱恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；GH-500BC隔水保溫箱，購(gòu)自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；FA2004N分析天平，購(gòu)自上海箐海儀器有限公司；H·SWX-600BS恒溫水浴箱，購(gòu)自上海圣科儀器設(shè)備有限公司；YRE-2010Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購(gòu)自鞏義市予華儀器設(shè)備有限公司；TYZD-1微量振蕩器，購(gòu)自上海左樂(lè)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備：(1)不同濃度中藥水提劑的制備：稱取蒲公英根、蒲公英全草、金銀花各75 g、100 g、150 g，分別置于砂鍋中加入適量蒸餾水浸泡30 min，大火煮沸后改用文火煎煮1 h，趁熱用無(wú)菌紗布將其過(guò)濾至燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮后放涼至室溫，用50 ml容量瓶定容后，分別得到濃度為150%、200%、300%的中藥煎劑溶液，將其放置于無(wú)菌小玻璃瓶中，高壓滅菌后，即得1.5 g/ml、2 g/ml、3 g/ml的蒲公英根、蒲公英全草、金銀花的水提劑，冷卻后4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?2)不同濃度中藥顆粒劑的制備：按照商品化蒲公英、金銀花顆粒劑中藥物含量說(shuō)明，分別稱取相當(dāng)于原中藥飲片75 g、100 g、150 g的蒲公英、金銀花顆粒劑，將其分別放置于燒杯中加入蒸餾水溶解，用50 ml容量瓶定容后放置于無(wú)菌小輸液瓶中，分別得到濃度為150%、200%、300%的中藥顆粒水溶液，高壓滅菌后，即得1.5 g/ml、2 g/ml、3 g/ml的蒲公英顆粒劑、金銀花顆粒劑的水溶液，冷卻后4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液制備：冷凍保存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及蠟樣芽孢桿菌無(wú)菌操作，劃線接種于M-H(A)平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h。取單菌落接種至 M-H(B)肉湯，37 ℃ 震蕩培養(yǎng)24 h，校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)希蒙睇}水稀釋成1.5×105CFU/ml的菌懸液備用。

1.2.3 藥物敏感試驗(yàn)：采用瓊脂打孔法對(duì)上述藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。(1)接種：用移液槍分別取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及白色念珠菌的稀釋菌懸液100 μl置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再向培養(yǎng)皿中加入冷卻至55 ℃的 M-H(A)培養(yǎng)基25 ml，混合均勻冷卻后即得相應(yīng)的帶菌平板。用無(wú)菌棉簽蘸取蠟樣芽孢桿菌菌懸液均勻涂布M-H (A)培養(yǎng)基上。(2)加藥：用打孔器在平板均等位置上打4個(gè)孔，3個(gè)孔用于加入不同稀釋度的藥物100 μl，第4孔加入生理鹽水100 μl做陰性對(duì)照。(3)孵育觀察：所有平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育16～18 h，游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。抑菌結(jié)果觀察指標(biāo)：抑菌圈直徑>20 mm為高度敏感，11～20 mm為中度敏感，7～10 mm為低度敏感[7]。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定：采用微量稀釋法檢測(cè)蒲公英全草、金銀花顆粒劑和水提劑的MIC。在96孔板橫向1-11小孔內(nèi)各加入M-H(B)肉湯100 μl，縱向1號(hào)孔內(nèi)分別加入1.5 g/ml的蒲公英全草顆粒劑100 μl、蒲公英全草水提劑100 μl、金銀花顆粒劑100 μl、金銀花水提劑100 μl；分別將藥物對(duì)倍稀釋至9號(hào)孔，則1-9號(hào)孔的藥液濃度分別為750 mg/ml、375 mg/ml、187.50 mg/ml、93.75 mg/ml、46.88 mg/ml、23.44 mg/ml、11.72 mg/ml、5.86 mg/ml、2.93 mg/ml；用移液槍取1.5×105CFU/ml的菌懸液100 μl分別加入1-10號(hào)孔內(nèi)，則10號(hào)孔為無(wú)藥物只有菌液的陽(yáng)性對(duì)照，11號(hào)孔為只有空白肉湯的陰性對(duì)照，12號(hào)孔為只加藥液100 μl的陰性對(duì)照。每種藥物做3個(gè)重復(fù)，接種完成后，微量振蕩器上振蕩1 min使其混勻，置37 ℃培養(yǎng)16～20 h?？變?nèi)清晰不出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為該抗菌藥物對(duì)該檢測(cè)菌的MIC。

1.2.5 聯(lián)合抑菌試驗(yàn)：采用微量棋盤法測(cè)定聯(lián)合抑菌效果，在無(wú)菌96孔板中加入A藥、B藥，橫向孔分別加入50 μl 1/8 MIC到8 MIC的A藥，縱向孔分別加入50 μl 1/8 MIC到8 MIC的B藥，各個(gè)孔加入0.5麥?zhǔn)系拇郎y(cè)菌液100 μl，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，孔內(nèi)清晰不出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為聯(lián)合抗菌藥物對(duì)該檢測(cè)菌的MIC。聯(lián)合抑菌結(jié)果判斷依據(jù)：分級(jí)抑菌濃度(FIC)指數(shù)=(A藥聯(lián)合的MIC/A藥單側(cè)MIC)+(B藥聯(lián)合的MIC/B藥單側(cè)MIC)，F(xiàn)IC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用，>0.5～1(包括=1)為相加作用，>1～2為無(wú)關(guān)作用，>2為拮抗作用。

2 結(jié) 果

2.1 蒲公英、金銀花水提劑及顆粒劑對(duì)4種致病菌的抑菌作用 蒲公英全草對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌及蠟樣芽孢桿菌均有一定的抑菌作用，且隨著藥物濃度的增加，抑菌效果增強(qiáng)；其中金黃色葡萄球菌對(duì)所有濃度的蒲公英水提劑及顆粒劑均為中度敏感(抑菌圈直徑11～20 mm)，大腸桿菌、白色念珠菌、蠟樣芽孢桿菌對(duì)蒲公英水提劑及顆粒劑均為低度敏感(抑菌圈直徑7～10 mm)。金銀花對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有一定的抑菌作用，且隨著藥物濃度增加，抑菌效果也逐漸增強(qiáng)，其中金黃色葡萄球菌對(duì)所有濃度的金銀花水提劑及顆粒劑均為中度敏感(抑菌圈直徑11～20 mm)，大腸桿菌對(duì)所有濃度的金銀花水提劑及顆粒劑均低度敏感(抑菌圈直徑7～10 mm)；金銀花對(duì)白色念珠球菌、大腸桿菌無(wú)抑菌作用。比較兩種劑型的抑菌結(jié)果顯示，蒲公英全草顆粒劑和金銀花顆粒劑的抑菌作用均優(yōu)于水提劑(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 中藥顆粒劑和水提劑對(duì)四種致病菌的抑菌作用

2.2 蒲公英、金銀花水提劑及顆粒劑對(duì)4種常見(jiàn)致病菌的MIC值 蒲公英顆粒劑對(duì)金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的MIC為46.88 mg/ml，對(duì)大腸桿菌、白色念珠菌的MIC為23.44 mg/ml；蒲公英全草水提劑對(duì)金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的MIC為93.75 mg/ml，對(duì)大腸桿菌、白色念珠菌的MIC為46.88 mg/ml。金銀花顆粒劑對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為46.88 mg/ml，對(duì)大腸桿菌的MIC為93.75 mg/ml；金銀花水提劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC為93.75 mg/ml，金銀花對(duì)白色念珠菌和蠟樣芽孢桿菌無(wú)抑菌作用，見(jiàn)表2。

表2 蒲公英、金銀花水提劑及顆粒劑對(duì)4種常見(jiàn)致病菌的MIC值

2.3 蒲公英、金銀花水提劑及顆粒劑聯(lián)合應(yīng)用的作用效果 蒲公英顆粒劑和金銀花顆粒劑聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌呈現(xiàn)相加作用，見(jiàn)表3。蒲公英水提劑和金銀花水提劑聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑菌呈現(xiàn)相加作用，見(jiàn)表4。

表3 蒲公英、金銀花顆粒劑聯(lián)用對(duì)2種致病菌的抑菌作用

表4 蒲公英、金銀花水提劑聯(lián)用對(duì)2種致病菌的抑菌作用

3 討 論

抗生素在臨床治療中應(yīng)用廣泛，但其導(dǎo)致的不良反應(yīng)、耐藥性等問(wèn)題日益凸顯。在疾病治療過(guò)程中耐藥菌的產(chǎn)生與日俱增，增加了疾病治療的難度。中藥在臨床使用過(guò)程中以其安全有效、較少出現(xiàn)耐藥等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛的關(guān)注。

蒲公英、金銀花含有多種藥用活性成分，具有不同程度的抑菌作用。本實(shí)驗(yàn)表明，蒲公英的抑菌作用效果優(yōu)于金銀花，兩者聯(lián)用抑菌效果增強(qiáng)；比較兩種中藥的顆粒劑與水提劑對(duì)常見(jiàn)致病菌抑菌效果，結(jié)果顯示，顆粒劑抑菌效果較好，與李健[8]的結(jié)果存在一定的差異，可能是因?yàn)橹兴幩釀┲谱鞣彪s且無(wú)統(tǒng)一煎煮標(biāo)準(zhǔn)，可能產(chǎn)生質(zhì)量差異，市面上的中藥飲片出廠家不同、制作方法不同導(dǎo)致作用效果的差異[9]；在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不排除誤差的影響，本實(shí)驗(yàn)采取的是打孔法測(cè)定抑菌作用，藥物可能通過(guò)小孔外滲進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)為體外抑菌實(shí)驗(yàn),雖可證明蒲公英、金銀花兩種中藥具有抑菌作用,但其臨床應(yīng)用效果還需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。只有進(jìn)一步的進(jìn)行探討和比較，才能為臨床用藥提供有力的依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突。