趙磊，姜大成，王丹彧，馬彧※，王路宏※

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 四平 136000）

藍(lán)刺頭為菊科藍(lán)刺頭屬植物藍(lán)刺頭（Echinops latifolius Tausch.）的干燥頭狀花序，收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊(cè)》中，蒙語(yǔ)稱作“扎日阿烏拉”，具有固骨質(zhì)、接骨愈傷和清熱止痛的功效，用于骨折、骨熱、刺痛癥及瘡瘍等疾病[1]，分布于我國(guó)東北、內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、河北、山西及陜西[2]，生于海拔120~2 200 m的山坡草地及山坡疏林下。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道藍(lán)刺頭中含有有機(jī)酸、黃酮和苯丙素類等化學(xué)成分[3-9]，其中有機(jī)酸類作為一種重要的生物活性物質(zhì)，具有清除自由基、抗菌、消炎、抗病毒、保肝利膽、降血壓和降血脂等作用，是藍(lán)刺頭藥材中重要的藥效物質(zhì)。現(xiàn)行《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊(cè)》標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)刺頭項(xiàng)下缺少含量測(cè)定項(xiàng)目，僅有一些文獻(xiàn)報(bào)道。李巖等[11]采用HPLC法測(cè)定藍(lán)刺頭及其制劑中芹菜素-7-O-葡萄糖的含量；周容等[12]采用HPLC法測(cè)定了新疆藍(lán)刺頭花乙醇提取物中蘆丁的含量，但尚未有學(xué)者對(duì)其有機(jī)酸含量測(cè)定方法進(jìn)行深入研究。本研究建立藍(lán)刺頭中的7個(gè)有機(jī)酸類成分測(cè)定方法，簡(jiǎn)便、可靠，為建立藍(lán)刺頭多指標(biāo)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、試藥

1.1 儀器

1260型液相色譜儀配DAD檢測(cè)器（Agilent公司）；BT125D型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠制造）；2001B型系列超純水器（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KQ-500DV型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸（批號(hào)110753-202119，含量以96.3%計(jì)）、咖啡酸（批號(hào)110885-201703，含量為99.7%）、蘆丁（批號(hào)100080-202012，供HPLC法測(cè)定，含量為91.6%）、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸（批號(hào)111782-201807，含量以94.3%計(jì)）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸（批號(hào)111894-202104，含量以95.1%計(jì)）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；5-咖啡?？崴幔ㄅ?hào)MUST-16022403，含量大于98.0%）、3,4-二咖啡?？崴幔ㄅ?hào)MUST-16031612，含量大于98.0%）由成都曼斯特生物科技有限公司提供。水為純化水；三氟乙酸、乙腈、甲醇均為色譜純。收集到10批藍(lán)刺頭藥材，樣品經(jīng)四平市食品藥品檢驗(yàn)所趙磊主任藥師鑒定為菊科藍(lán)刺頭屬植物藍(lán)刺頭Echinops latifolius Tausch.的干燥頭狀花序，規(guī)定批號(hào)為L(zhǎng)CT1~LCT10，見(jiàn)表1。

表1 藍(lán)刺頭樣品信息來(lái)源Table 1 Echinops latifolius sample source information

2 溶液的配置

2.1 混標(biāo)對(duì)照品配置

精密稱取5-咖啡?？崴?、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸對(duì)照品分別置于100 mL量瓶中，采用甲醇搖勻溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為101.1g/mL、102.6g/mL、96.1g/mL、94.5g/mL、96.1g/mL、100.3g/mL、95.5g/mL的7種成分對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液10mL、5mL、5mL、5mL、5 mL、20 mL、10 mL置同一個(gè)100 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋成為10.11g/mL、5.13g/mL、4.80g/mL、4.72g/mL、4.80g/mL、20.06g/mL、9.55g/mL的混標(biāo)對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.2 樣品溶液制備

精密稱定藍(lán)刺頭粉末0.3 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放置室溫后再稱定重量，采用50%甲醇補(bǔ)足蒸發(fā)的重量，混勻后過(guò)濾，用0.45m微孔濾膜濾過(guò)，即得。

3 色譜條件

流動(dòng)相為乙腈（A）-0.08%三氟乙酸水溶液（B），進(jìn)樣量為10L，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm。色譜柱為Waters HSS T3 C18（4.6 mm 250 mm,5m）。梯度洗脫見(jiàn)表2。

表2 藍(lán)刺頭7種成分測(cè)定梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure for the determination of seven components of Echinops latifolius sample

4 測(cè)定法

圖1 藍(lán)刺頭中7種成分的色譜圖Fig.1 HPLC of 7 Components in Echinops latifolius

5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

5.1 線性關(guān)系考察及檢測(cè)限與定量限

精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、1 mL、2.0 mL和5.0 mL分別置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度作為混標(biāo)溶液。分別精密吸取各系列濃度混標(biāo)溶液及對(duì)照品儲(chǔ)備液各10L測(cè)定，分別以7種對(duì)照品的質(zhì)量濃度（g/mL）為橫坐標(biāo)，采用峰面積為縱坐標(biāo)，得到線性方程。稀釋對(duì)照品溶液后進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為3時(shí)測(cè)定檢測(cè)限，當(dāng)信噪比為10時(shí)測(cè)定定量限。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 7種測(cè)定成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限與定量限Table 3 Standard curve equation,linear range,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of 7 determined components

5.2 精密度考察

5.3 重復(fù)性考察

取樣品粉末（LCT1樣品）6份，分別按照供試品溶液制備方法制備，按照色譜方法測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果各份供試品溶液的5-咖啡?？崴帷⒕G原酸、咖啡酸、蘆丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和4,5-O-二咖啡?？鼘幩岬臏y(cè)定結(jié)果RSD（n=6）分別在1.38%~1.96%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

5.4 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液（LCT1樣品溶液），分別于0h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果5-咖啡?？崴帷⒕G原酸、咖啡酸、蘆丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡?；鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩岬姆迕娣e的RSD（n=6）分別在0.68%~1.13%，結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

5.5 回收率考察

取已知含量得藍(lán)刺頭樣品（LCT1樣品）粉末6份，每份約0.15 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入近等量得各對(duì)照品溶液，分別按照供試品溶液方法制備，按色譜方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果5-咖啡?？崴?、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡?；鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩崞骄訕踊厥章剩╪=6）分別在97.89%~99.67%，RSD分別在1.54%~2.11%，表明回收率良好。

5.6 藍(lán)刺頭7種成分含量測(cè)定

測(cè)定LCT1~LCT10批樣品，分別按供試品溶液制備方法制備。精密吸取各供試品溶液10L，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算百分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 藍(lán)刺頭中7種成分含量測(cè)定結(jié)果Table 4 Content determination results of 7 components in Echinops latifolius %

6 討論

6.1 色譜條件的選擇

采用高效液相色譜法測(cè)定藍(lán)刺頭中的7種主要化學(xué)成分，5-咖啡?？崴帷⒕G原酸、咖啡酸、蘆丁、3,4-二咖啡?？崴帷?,5-O-二咖啡?；鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩岱蛛x度良好，50 min完成測(cè)定，結(jié)合文獻(xiàn)查詢，結(jié)果采用325 nm時(shí)7種化學(xué)成分均有較大吸收，雜質(zhì)峰干擾較少，故采用325 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。流動(dòng)相經(jīng)多種流動(dòng)相體系測(cè)定，結(jié)果顯示乙腈-0.08%三氟乙酸為流動(dòng)相分離效果好，色譜峰理論板數(shù)較高，峰形對(duì)稱。

6.2 含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)在同一色譜條件下，同時(shí)測(cè)定不同批次藍(lán)刺頭中綠原酸、4-咖啡?？崴帷⒖Х人?、蘆丁、3,4-二咖啡?？崴帷?,5-O-二咖啡?；鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩?種有效成分的含量，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，為有效控制藍(lán)刺頭的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。測(cè)定的10批藥材中綠原酸與3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量結(jié)果差異較大，可能因?yàn)闃颖九c產(chǎn)地、采收期及儲(chǔ)存時(shí)間都有密切的關(guān)系，并且綠原酸和咖啡酰基成分也不太穩(wěn)定。