張禾垟，鄭軍軍，周雅，劉琳玲，李浩東，楊福合，王桂武

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112）

鹿茸（Cervi cornu Pantotrichum）指的是鹿科動(dòng)物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）或馬鹿（Cervus elaphus Linnaeus）的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]。鹿茸作為我國(guó)應(yīng)用較早且沿用至今的名貴中藥材，其性溫，味甘、咸，歸肝、腎經(jīng)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種可完全再生的哺乳動(dòng)物器官[2,3]。目前，對(duì)于鹿茸的藥理作用的研究已取得很大的進(jìn)展[4]，主要體現(xiàn)在對(duì)神經(jīng)功能[5,6]、免疫功能[7]和生殖功能[8]的影響，對(duì)心肌損傷[9]、肝損傷的保護(hù)[10,11]以及對(duì)組織創(chuàng)傷的修復(fù)[12,13]等方面?，F(xiàn)在市場(chǎng)上所售賣的鹿茸茸色多為紅色，但也有少量茸色為黑色的鹿茸在市面上出現(xiàn)，從外表來(lái)看，二者除在茸皮顏色上不同外，其他方面（如茸型和茸重等）均無(wú)明顯差別。可能是由于藥典中記載的花鹿茸性狀為外皮紅色或紅棕色[1]，所以顧客更傾向于購(gòu)買茸皮顏色為紅色的鹿茸，導(dǎo)致這些黑色的鹿茸往往售出的價(jià)格較紅色的鹿茸低，因此養(yǎng)殖戶更傾向于養(yǎng)殖產(chǎn)紅茸的梅花鹿，并且有研究記載，在早期的選種階段，就開(kāi)始有意識(shí)地淘汰產(chǎn)黑茸的鹿[14]。但近些年又有業(yè)內(nèi)工作者重新評(píng)估了黑茸梅花鹿的種用價(jià)值，認(rèn)為仍應(yīng)將黑茸梅花鹿留做種用[15]。紅茸與黑茸究竟孰高孰低？本研究通過(guò)營(yíng)養(yǎng)成分分析來(lái)揭曉。

本研究通過(guò)對(duì)比分析市面上紅茸與黑茸水分、灰分、蛋白質(zhì)、粗脂肪、多糖、膠原蛋白和氨基酸的含量，闡明紅茸與黑茸營(yíng)養(yǎng)成分含量差異，從而在一定程度上減少消費(fèi)者購(gòu)買鹿茸時(shí)的盲目性。本試驗(yàn)結(jié)果也可以為未來(lái)梅花鹿的育種方向提供參考，為增加梅花鹿的品種多樣性提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

FW135粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；MS204S-電子分析天平，瑞士-Mettler Toledo公司；GZX-9240 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；MF-0912P陶瓷纖維馬弗爐，華港通科技（北京）有限公司；BCHI_K437凱氏定氮系統(tǒng)消解爐，瑞士步琦有限公司；BCHI_339凱氏定氮儀，瑞士步琦有限公司；HH-4 A數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電氣有限公司；MTV-100多管旋渦混合儀，杭州奧盛儀器有限公司；XW-80A微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；HC-3018高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本Hitachi公司；SPECORD紫外分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；KQ-800DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Direct-Pure Ro-超純水器，四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司。

1.2 試劑耗材

硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅指示劑、亞甲基藍(lán)指示劑、氫氧化鈉、乙醇、石油醚、乙腈、甲醇、濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、鹽酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉（優(yōu)級(jí)純）、氯化鈉（優(yōu)級(jí)純）、17種L-氨基酸標(biāo)品（日本W(wǎng)oke公司，批號(hào)為：BYA1031）、L-Hyp標(biāo)品（索萊寶試劑公司，批號(hào)為：YZ-111578）、60目篩、稱量瓶、石英坩堝、索氏提取器、蒸發(fā)皿、氨基酸水解管。

若無(wú)特殊說(shuō)明，本試驗(yàn)所用實(shí)際試劑均為分析純，除水浴鍋內(nèi)用自來(lái)水外，其余均用三級(jí)水。

1.3 試驗(yàn)材料

鮮梅花鹿二杠茸，茸皮顏色為紅色和黑色的各4副，均為采集于吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)的新鮮鹿茸，試驗(yàn)前保存于20℃，經(jīng)王桂武研究員鑒定為純種梅花鹿鹿茸。將每副梅花鹿鹿茸整支切片、烘干、粉碎、過(guò)60目篩備用。

2 試驗(yàn)方法

2.1 水分含量的測(cè)定

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》（GB 5009.3-2016）[16]中第一法：直接干燥法來(lái)測(cè)定鹿茸粉中的水分。

2.2 灰分含量的測(cè)定

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》（GB 5009.4-2016）[17]中第一法測(cè)定鹿茸粉中的總灰分。

2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5-2016）[18]中第一法：凱氏定氮法測(cè)定鹿茸粉中的蛋白質(zhì)含量。

2.4 粗脂肪含量的測(cè)定

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》（GB 5009.6-2016）[19]中第一法：索氏抽提法測(cè)定鹿茸粉中粗脂肪的含量。

2.5 多糖含量的測(cè)定

鹿茸粉中多糖的測(cè)定參考文獻(xiàn)中的方法，采用水提醇沉法提取鹿茸中的水溶性多糖，然后再用苯酚-硫酸法測(cè)定其含量[20]。

培養(yǎng)基：培養(yǎng)分離均采用BG-11培養(yǎng)基，其中分離在BG-11固體培養(yǎng)基中進(jìn)行，分離后純培養(yǎng)及后續(xù)培養(yǎng)在液體BG-11中進(jìn)行。

2.5.1 多糖的提取準(zhǔn)確稱取1 g鹿茸試樣于濾紙筒中，將濾紙筒放入索氏提取裝置中用石油醚脫脂2 h，取出濾紙筒，置于蒸發(fā)皿中揮干醚液，將濾紙筒剪碎與鹿茸粉一起浸泡于20 mL超純水中，浸泡12 h（過(guò)夜），然后50℃超聲提取60 min，8 000 r/min離心5 min，重復(fù)提取1次，合并兩次提取液。利用Sevag法除蛋白，加入10 mL氯仿－正丁醇（1:1，V/V）溶液，渦旋10 min，以8 000 r/min離心5 min，沉淀蛋白質(zhì)，重復(fù)上述操作7次，然后將提取液于水浴鍋中蒸干，加入10 mL超純水復(fù)溶，再加入40 mL 95%乙醇4℃醇沉過(guò)夜。以8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀2~3次，定容至50 mL，即得鹿茸水溶性多糖供試品。

2.5.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取適量無(wú)水葡萄糖，于105℃下烘至恒重，準(zhǔn)確稱取10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻線。依次吸取0.1mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL和0.6 mL，置于試管中，先用超純水補(bǔ)足至1mL，再加入1mL超純水、1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚水溶液（稱取1g苯酚用超純水定容至20 mL）和5 mL濃硫酸，渦旋混勻，于室溫靜置10 min，30℃水浴20 min，于490 nm處測(cè)定吸光度。

2.5.3 多糖含量的測(cè)定取1mL 2.5.1制備的水溶性多糖供試品，按照2.5.2中的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算鹿茸樣品中的多糖含量。

2.6 氨基酸含量的測(cè)定

參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》（GB5009.124-2016）[21]以及文獻(xiàn)中的方法[22,23]對(duì)鹿茸試樣中17種氨基酸：天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）和脯氨酸（Pro）進(jìn)行測(cè)定。

準(zhǔn)確稱取鹿茸樣品30 mg，置于氨基酸水解管中，加入20 mL 6 mol/L HCl溶液，擰緊螺旋塞密封，于恒溫干燥箱中110℃水解22 h，水解結(jié)束冷卻至室溫，將溶液定容至50 mL，取2 mL于小燒杯中，60~70℃蒸干，用0.02 mol/L鹽酸溶液定容至2 mL，渦旋使充分溶解，將溶液過(guò)水系濾膜（0.22m），上機(jī)待測(cè)。

17種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品測(cè)定液分別以相同體積注入氨基酸分析儀，以外標(biāo)法通過(guò)峰面積計(jì)算樣品測(cè)定液中氨基酸的濃度[21]。

2.7 膠原蛋白含量的測(cè)定

Hyp的測(cè)定方法按照2.6項(xiàng)中的方法進(jìn)行。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本試驗(yàn)采用SPSS 25以及GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)比較分析。對(duì)所得到的結(jié)果首先進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，對(duì)于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行比較，對(duì)于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較，從而得到兩組數(shù)據(jù)間的差異。

2.9 測(cè)定結(jié)果

2.9.1 鹿茸試樣中5種營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定結(jié)果對(duì)鹿茸試樣中水分、灰分、粗脂肪、蛋白質(zhì)和多糖這5種營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鹿茸試樣中5種營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of five nutrients in pilose antler samples %

對(duì)鹿茸試樣中水分、灰分、粗脂肪、蛋白質(zhì)和多糖這5種營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果符合正態(tài)分布，再利用SPSS軟件對(duì)這5種營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P值均大于0.05，說(shuō)明紅茸與黑茸在這5種營(yíng)養(yǎng)成分的含量上無(wú)顯著差別。

2.9.2 鹿茸試樣中膠原蛋白含量的測(cè)定結(jié)果對(duì)鹿茸試樣中膠原蛋白含量的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果符合正態(tài)分布，對(duì)其進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性比較，檢驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，紅茸和黑茸中膠原蛋白的含量分別為38.43%和35.64%，紅茸中的膠原蛋白含量顯著高于黑茸中的膠原蛋白含量（P=0.025 1＜0.05）。

圖1 鹿茸試樣中膠原蛋白測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination results of collagen in pilose antler sample

2.9.3 鹿茸試樣中氨基酸含量的測(cè)定結(jié)果

對(duì)鹿茸試樣中單個(gè)氨基酸及總氨基酸含量的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，對(duì)不符合正態(tài)性分布的結(jié)果（Ala、Met和Pro）進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)確定其差異性，對(duì)其余符合正態(tài)性分布的結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較其差異性，檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2以及圖2、圖3。結(jié)果表明，紅茸與黑茸在氨基酸總含量（TAA）以及單個(gè)氨基酸Asp、Thr、Glu、Val、Leu、Tyr和Phe的含量上差異顯著，在單個(gè)氨基酸Ile和Lys的含量上差異極顯著，且均為黑茸的含量高于紅茸。

圖2 鹿茸試樣中單個(gè)氨基酸測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination results of single amino acids in pilose antler samples

圖3 鹿茸試樣中總氨基酸測(cè)定結(jié)果Fig.3 Determination results of total amino acid in pilose antler samples

表2 鹿茸試樣中各氨基酸的含量Table 2 Content of amino acids in pilose antler sample

3 討論

通過(guò)對(duì)比分析紅茸與黑茸中水分、灰分、粗脂肪、蛋白質(zhì)和多糖這5種營(yíng)養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)紅茸與黑茸在這5種營(yíng)養(yǎng)成分的含量上并不存在顯著的差異，即單從這5種營(yíng)養(yǎng)成分含量來(lái)看，紅茸與黑茸沒(méi)有明顯區(qū)別。

鹿茸的蠟片、粉片、紗片和骨片分別對(duì)應(yīng)發(fā)育程度不同的軟骨組織[3]，不同區(qū)段的鹿茸價(jià)格差距較大，市場(chǎng)上鹿茸蠟片的價(jià)格比骨片高百倍[28]，因此，鹿茸蠟片區(qū)所占比重越大，往往市場(chǎng)價(jià)格也就越高。蠟片區(qū)組織分生旺盛，膠原蛋白含量較高，但粉片區(qū)、紗片區(qū)和骨片區(qū)的骨組織發(fā)育越來(lái)越成熟，且據(jù)宮瑞澤等[25]的研究，帶血茸蠟片區(qū)膠原蛋白含量顯著高于粉片區(qū)和紗片區(qū)，但同時(shí)又顯著低于骨片區(qū)，因此，紅茸中的膠原蛋白含量顯著高于黑茸的原因不能確定是紅茸中的蠟片區(qū)含量一定高于黑茸，也有可能是因?yàn)榧t茸中的軟骨發(fā)育比較成熟，骨片區(qū)所占比重較大導(dǎo)致的，故不能以此來(lái)斷定紅茸的市場(chǎng)價(jià)格一定高于黑茸。

氨基酸作為構(gòu)成機(jī)體所需蛋白質(zhì)的基本單位，是鹿茸中非常重要的生物活性物質(zhì)且與鹿茸品質(zhì)密切相關(guān)[22,29,30]。郭曉晗等[30]在其研究中表明，鹿茸中氨基酸的含量越高則鹿茸的等級(jí)越高。本次試驗(yàn)中，黑茸中的總氨基酸含量顯著高于紅茸（P＜0.05）；且在此次試驗(yàn)中檢測(cè)出7種人體必需氨基酸（Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe和Lys），其中6種必需氨基酸（Thr、Val、Ile、Leu、Phe和Lys）的含量均是黑茸顯著高于紅茸（P＜0.05）；除此之外，還有3種非必需氨基酸（Asp、Glu和Tyr）的含量也是黑茸均顯著高于紅茸（P＜0.05）。Glu和Asp是食物呈現(xiàn)鮮味的特征氨基酸，也是影響食物風(fēng)味的前體物質(zhì)[22,23,31]。Asp、Glu和Tyr等一起參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及功能[32-34]。Glu還參與了機(jī)體許多重要代謝，是合成嘌呤和嘧啶核苷酸的能源底物，且參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，對(duì)任何動(dòng)物的生長(zhǎng)健康來(lái)說(shuō)是必需的[31]。另外，黑茸中Tyr含量顯著高于紅茸的直接原因可能是黑茸皮中黑色素含量較高導(dǎo)致，這也與表型相互印證。

綜上所述，紅茸中的膠原蛋白含量更高，黑茸則含有更為豐富的氨基酸，特別是人體必需氨基酸，這對(duì)于之后紅、黑鹿茸市場(chǎng)價(jià)格的調(diào)整，以及未來(lái)的育種方向都提供了參考。