阮音音，孫海，吳虎平，錢佳奇，梁浩，嚴光玉，張亞玉,3※

[1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；3.吉林省中藥材種植（養(yǎng)殖）重點實驗室，吉林 長春 130112；4.瓦屋山藥業(yè)有限責任公司，四川 眉山 620365]

雅連是毛茛科多年生植物三角葉黃連（Coptis deltoidea）的干燥根莖，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，一般用于濕熱痞滿、嘔吐吞酸及消渴等癥狀[1]，在治療糖尿病及消渴癥方面有突出優(yōu)勢。雅連是最早有記載的黃連商品藥材，可以追溯到西漢時期[2]，在明清時代甚至是川渝地區(qū)上貢的貢品[3]，是歷史上公認的優(yōu)良黃連藥材，留有大量方劑傳世，是值得傳承的優(yōu)良中藥材。2012年，雅連成為地理標志產(chǎn)品，目前僅有四川洪雅、峨眉等少數(shù)地區(qū)有林下種植。

土壤細菌作為土壤微生物的組成部分，是森林生態(tài)系統(tǒng)的一部分，其群落多樣性與伴生樹種聯(lián)系緊密。研究表明，植物的微生物群落具有能幫助植物抑制疾病、提供營養(yǎng)和對生物或非生物脅迫響應等功能[4-6]。David[7]提出，植被組成及植物凋落物類型會對土壤生物多樣性產(chǎn)生影響。在生產(chǎn)過程中，選林也是種植前的重要步驟，如果選林不當，很可能發(fā)生爛根、枯葉等現(xiàn)象，從而造成減產(chǎn)甚至絕收。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同樹種對于雅連的生長具有極大的影響作用，有些樹種下雅連的保苗較好，長勢較好，產(chǎn)量較高；而有些樹種下雅連的生長受到抑制，病害重，產(chǎn)量低。但目前關于雅連林下種植及土壤微生物的研究未見報道。

本研究在產(chǎn)地調(diào)研的基礎上，對主產(chǎn)區(qū)洪雅縣雅連根區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)合土壤營養(yǎng)指標的對比分析研究，篩選適宜雅連生長的土壤微生物標志物種，探究雅連根區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤營養(yǎng)指標的相關性，為雅連的林下種植選林、選土技術提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

雅連樣品的采集地點位于四川省眉山市洪雅縣瓦屋山鎮(zhèn)黑山村（103°9” E,29°28” N），海拔1 900 m，年降雨量1 435.5 mm，年日照1 006.1 h，年無霜期307 d，年平均氣溫16.6℃，屬中亞熱帶濕潤氣候。采集時間為2020年9月20日，樣品全部采自同一基地內(nèi)，分別采自珙桐（Davidiainvolucrata）、少花桂（Cinnamomum pauciflorum）、貓兒屎（Decaisneainsignis）、核桃樹（Juglans regia）、楓楊（Pterocarya stenoptera）以及漆樹（Toxicodendron vernicifluum）6種樹種下的雅連及其根區(qū)土壤。

表1 雅連及土壤樣品采集點信息Table1 Information on sample collection points of Coptis deltoidea and soil

每個樹種樣地分別選擇3個采樣點，每個樣點采集雅連3~6株。將表層枯枝落葉去除，采集0~30 cm的根層土壤，采集的土壤采用四分法進行混合。一部分裝入10 mL無菌離心管80℃進行冷藏，用于土壤微生物測定；另一部分風干后分別過0.85 mm及0.15 mm篩，并裝于自封袋中進行保存，用于土壤營養(yǎng)指標測定。

1.2 方法

土壤有機質(zhì)含量、全氮含量使用德國產(chǎn)元素分析儀Vario ELⅢ測定，其中土壤有機質(zhì)的含量為全碳含量的1.724倍；土壤全磷、速效磷含量采用鉬銻抗比色法；土壤全鉀、有效鉀使用火焰光度法測定；銨態(tài)氮及硝態(tài)氮使用氯化鉀浸提后，用AA-3流動分析儀進行測定（Brawn Luyy，德國）；土壤的中微量元素采用硝酸-高氯酸消化-ICP710ES法。

采用Mo Bio/QIAGEN公司的DNeasy PowerSoil Kit對土壤微生物基因組DNA進行抽提，用16SrRNA基因V3-V4可變區(qū)引物（338F:5” -ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3” ；806R:5” -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3” ）進行PCR擴增（Pyrobest DNA Polymerase,TaKaRa,DR500A）；然后進行膠回收純化：針對目標條帶進行割膠回收，得到純化的樣本（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit,Axygen,AP-GX-500）；然后進行各樣本定量：利用BioTek酶標儀對各個樣品定量（BioTek Flx800酶標儀；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit,Invitrogen,P7589）；最后采用標準的Illumina TruSeq DNA文庫制備實驗流程（Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Guide）構(gòu)建所需的上機文庫。經(jīng)過DNA雙末端修復后，在3” 端引入“A”堿基，完成接頭連接并純化連接產(chǎn)物后，富集DNA片段，驗證、均一化并混合文庫，進行上機測序。本實驗涉及的土壤樣品DNA提取、擴增和上機測序技術委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

使用QIIME2及R語言及派森諾基因云平臺對序列進行去噪、聚類、物種分類學注釋、計算Alpha多樣性指數(shù)、稀疏曲線、PCoA分析及NMDS分析等微生物群落多樣性組成譜分析，使用Excel2019、SPSS26和Origin2022軟件進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析與可視化表達。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樹種下雅連根區(qū)土壤營養(yǎng)指標

不同樹種下雅連根區(qū)土壤營養(yǎng)指標值，見圖1。在有機質(zhì)含量方面，貓兒屎組的含量（196.37g/kg±53.37g/kg）顯著高于其他各樣本組。楓楊組（4.88 g/kg±0.46 g/kg）及漆樹組（4.83g/kg±0.71g/kg）的全氮含量顯著高于少花桂組（3.02 g/kg±0.47 g/kg）。少花桂組（9.12±2.28 g/kg）及楓楊組（9.12 g/kg±6.19 g/kg）的土壤全磷含量顯著高于其他各樣本組，且少花桂組（13.56g/kg±3.22g/kg）的土壤全鉀含量也顯著高于其他各樹種組。

圖1 不同樹種下雅連土壤大量元素含量Fig.1 Content of mass elements in soil under different tree species

不同樹種下雅連根區(qū)土壤的中微量元素含量（表2）可知，土壤中金屬元素鈣、銅、鐵、錳、鎂、鈉、鋅、鋁等在各樣本組間均存在顯著差異性。綜合看來，漆樹組的土壤中微量元素含量屬于較低水平。

表2 不同樹種下雅連土壤中微量元素含量Table 2 Soil medium and trace elements content under different tree species mg/kg

2.2 不同樹種下雅連根區(qū)土壤16S測序數(shù)據(jù)的基本分析

對土壤樣本16S測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進行分析，平均每個樣品測得94 772對原始序列，去除部分低質(zhì)量序列、去噪及嵌合體后，平均獲得高質(zhì)量序列55 826條，片段長度為162~441 bp，集中分布在405~432 bp區(qū)間內(nèi)。對所有樣品所得結(jié)果在97%的相似水平下進行生物信息統(tǒng)計分析，一共得到13 005條OTU，不同樣品間的OTU數(shù)量變化范圍為709~941。OTUs物種注釋結(jié)果顯示，6個樣本組中的細菌群落結(jié)構(gòu)中包含40門108綱268目481科1 024屬2 735種。使用QIIME軟件可以獲得每個樣品于不同的分類水平上的物種組成以及其相對分度表，對于其中豐度大于1%的細菌進行分析可以得到不同水平下的相對豐度柱狀圖。對不同樹種間根區(qū)土壤間細菌在門、屬水平下樣品的分類學組成進行分析（圖2 a和圖2 b）。

在6種樹種下，門水平的前10個優(yōu)勢菌種如圖2 a所示，其中Proteobacteria（變形桿菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Chloroflexi（綠屈撓菌門）4個菌門占在各組所有菌門的80%左右，是絕對的優(yōu)勢菌門。對各組相對豐度前10的優(yōu)勢菌門進行方差分析，結(jié)果表明酸桿菌門在少花桂組及楓楊組中的相對豐度顯著高于珙桐組及漆樹組；珙桐組的綠屈撓菌門豐度顯著高于少花桂組、楓楊組、漆樹組；貓兒屎組的Bacteroidetes（擬桿菌門）豐度顯著高于楓楊組；Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）在楓楊組的豐度顯著高于珙桐組及貓兒屎組；Verrucomicrobia（疣微菌門）在漆樹組中的相對豐度最高，顯著高于其他樹種。6個樣本組相對豐度為前15的優(yōu)勢菌屬如圖2 b所示，分別為不同樣本組的各菌屬占比有明顯不同，除了酸桿菌門下的Subgroup_2及變形桿菌門下Bradyrhizobium（慢生根瘤菌屬）的在各組中相對豐度均處于較高水平外，各組物種組成差異很大。

圖2 不同樹種下土壤細菌群落Fig.2 Soil bacteria community of different interplanting models under different tree species

本研究選取的Alpha多樣性指數(shù)（表3）包括Good’s coverage指數(shù)、Pielou’s evenness指數(shù)、Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)，分別說明物種覆蓋程度、均勻度、群落豐富度及多樣性。由表4可知，所有樣品的細菌Good’s coverage指數(shù)均大于0.95，說明該樣本測序可以比較真實的反映樣本的情況；核桃樹及漆樹組的均勻度顯著高于貓兒屎組及楓楊組；各組間豐富度不存在顯著差異，但珙桐組屬于較高水平；珙桐及核桃樹下雅連土壤細菌多樣性顯著高于貓兒屎及楓楊樹下的雅連。

表3 不同樹種下土壤細菌菌門相對豐度方差分析（*P＜0.05）Table 3 ANOVA on the relative abundance of soil bacterial phyla under different tree species(*P＜0.05)

表4 不同樹種下土壤細菌Alpha多樣性指數(shù)（*P＜0.05）Table 4 Alpha diversity index of soil bacteria under different tree species(*P＜0.05)

NMDS分析不受樣本距離的數(shù)值影響，僅考慮彼此之間的大小關系?；贠TU注釋結(jié)果，對不同樹種下的的微生物菌落進行NMDS分析，結(jié)果見圖3，其應力值（Stress）為0.038 9，遠小于0.2，這表明該NMDS分析結(jié)果可以準確反映出不同樹種下的組內(nèi)菌落組成結(jié)構(gòu)的差異程度。比較各樣本組，珙桐組相比其他各組在圖中位置較遠，說明其土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與其他樣品組差異較大；少花桂組、貓兒屎組與楓楊組位置相對集中，其差異程度相對較小。

圖3 不同樹種下土壤細菌NMDS分析Fig.3 NMDS analysis diagram of soil bacteria under different tree species

利用LEfSe分析對所有分類水平同時進行具有顯著性的豐度差異分析，尋找不同樹種間差異顯著的標志物種，結(jié)果見圖4。珙桐組的特征物種為KD4-96綱、KD4-96目、KD4-96科、Hyphomicrobiaceae科（生絲微菌科）、KD4-96屬、Pedomicrobium屬（土微菌屬）物種；核桃樹組標志物種為SC_I_84科、SC_I_84屬；楓楊組為Pseudolabrys屬；漆樹組標志物種包括疣微菌門、Thermoleophilia綱、Verrucomicrobiae綱（疣微菌綱）、Chthoniobacterales目、Gaiellales目、Chthoniobacteraceae科、Candidatus_udaeobacter屬。

圖4 不同樹種下土壤細菌LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis diagram of soil bacteria community under different tree species

在本研究中，使用平均豐度前20位的菌屬豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖以比較各樣本組的物種豐度分布趨勢。由圖5可知，各樣本組的細菌群落可以被聚類為4大組，其中第一組為楓楊組，第二組有樣本組少花桂組及貓兒屎組，第三組為珙桐組，第四組包括核桃樹及漆樹在內(nèi)，其中一二組之間物種組成相似性較高，而第四組組內(nèi)的相似程度也很高，三四組的差異主要集中在AD3、慢生根瘤菌屬這兩個能被聚類的菌屬以及Haliangium、Candidatus_udaeobacter、Rokubacteriales、Nitrospira這4個相似菌屬上。

圖5 不同樹種下土壤細菌屬水平物種組成熱圖Fig.5 Heat map of species composition at the genus level of soil bacteria under different tree species

2.3 不同樹種下雅連根區(qū)土壤微生物群落及營養(yǎng)元素相關性

RDA冗余分析一般用于反應微生物菌群與土壤環(huán)境各因子之間的關系，見表5。結(jié)果表明，雅連根區(qū)土壤營養(yǎng)指標中僅鋁、銅與速效鉀對細菌群落結(jié)構(gòu)有顯著性影響，土壤各營養(yǎng)指標對土壤細菌門群落結(jié)果的前5影響順序為鋁＞銅＞速效鉀＞硝態(tài)氮＞全鉀。對土壤營養(yǎng)指標與豐度前15的細菌菌屬進行Spearman分析（圖6）可知，KD4-96屬與土壤全磷、全鉀、速效磷含量呈顯著負相關，與錳、鋅含量呈極顯著負相關，與速效鉀含量呈顯著正相關，與鈉、鋁含量呈極顯著正相關；Roseiarcus屬與土壤全磷、鐵、鎂含量呈顯著正相關，與全鉀、錳、鋅含量呈極顯著正相關，與鈉含量呈顯著負相關；Rokubacteriales屬與土壤全磷、錳含量呈顯著負相關，與全鉀、鐵、鎂含量呈極顯著負相關；Candidatus_udaeobacter屬與土壤全鉀、鈣、鐵、鎂含量呈顯著負相關，與銅、錳、鋅含量呈極顯著負相關。

表5 不同樹種下土壤細菌群落與營養(yǎng)元素的RDA分析Fig.5 RDA analysis of soil bacteria l community and nutrient factors under different tree species

圖6 門水平下土壤細菌相對豐度與營養(yǎng)指標相關性（*≤0.05,**≤0.01）Fig.6 Correlation between relative abundance of soil bacteria and nutrient factors at phylum level(*≤0.05,**≤0.01)

3 討論

微生物是土壤的重要組成成分，其功能包括參與土壤結(jié)構(gòu)形成、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、有機質(zhì)循環(huán)和毒物降解等各類理化及生物過程，和土壤的健康以及質(zhì)量息息相關[6,8]。不同樹種下的土壤營養(yǎng)指標表現(xiàn)出了顯著差異，其原因可能是樹種的凋落物不同，從而影響了林下雅連根區(qū)土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分的補給[9]。研究表明，不同的樹種凋落物所含有的不同碳源和氮源會導致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進行定向進化，進而對土壤肥力產(chǎn)生一定的影響[10]。此外，不同樹種的根系生長代謝也會影響土壤（尤其是根區(qū)土壤）的理化性質(zhì)[11,12]。從土壤各營養(yǎng)指標來看，全磷、全鉀及各金屬元素更容易影響土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)，尤其是錳及鋅這兩種微量元素，與相當一部分的優(yōu)勢菌屬都具有顯著或極顯著相關性。

6種樹種下雅連根區(qū)土壤細菌的優(yōu)勢菌門為變形桿菌門、酸桿菌門和放線菌門，這與王鈺等[13]在西南地區(qū)研究結(jié)果基本一致。土壤微生物種群對于土壤的質(zhì)量和功能以及土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性發(fā)展具有十分重要的意義；在一定程度上，土壤微生物群落組成及類型可以反映出土壤質(zhì)量的變化[14,15]。不同樹種下雅連根區(qū)土壤細菌群落的多樣性指數(shù)較高的是珙桐組，擁有較高水平豐富度及多樣性。

疣微菌門及其門下的Candidatus_udaeobacter屬是漆樹組標志物種，有研究表明Candidatus-udaeobacter常為多年生作物的高年限時的優(yōu)勢種群[16]，其有可能是土壤微生態(tài)失調(diào)的產(chǎn)物，而土壤微生態(tài)失調(diào)往往導致土壤微生物群落的單一化群落結(jié)構(gòu)明顯。核桃樹及漆樹較其他樹種而言，棒狀桿菌門Rokubacteriales處于較高水平，且漆樹下土壤細菌群落中Rokubacteriales為豐度最高的菌屬。而在番華彩等[17]對香蕉枯萎病和健康植株根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病植株中棒狀桿菌門的豐度較健康植株高，香蕉枯萎病植株中Rokubacteriales豐度和健康植株的差異顯著。目前針對雅連的病害研究較少，而作物病害的發(fā)生與植株根際土壤微生物有密切關系，主要體現(xiàn)在微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)方面[18]。對于棒狀桿菌門Rokubacteriales對作物影響的機制尚不明確，可能與病害發(fā)生有聯(lián)系，仍需進一步的實驗證實。

珙桐組的特征物種中，綠屈撓菌門的KD4-96屬占重要地位，同時，其所在的KD4-96科、KD4-96目、KD4-96綱也為珙桐組的特征物種，這說明在珙桐組中該屬起到關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，KD4-96屬與土壤中總磷含量呈正相關關系[19]，其對磷的溶解釋放具有促進作用[20]，且為耐金屬細菌[21]，屬于有益微生物。珙桐組雅連生長狀況較好，可能與KD4-96屬的這些功能有密切關系，其影響機制需進一步實驗驗證。

4 結(jié)論

土壤營養(yǎng)指標和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成受不同樹種的影響，盡管不同樹種下雅連根區(qū)土壤相對豐度占優(yōu)勢的微生物種群改變較小，但是標志微生物的地位存在差異。本研究中6種不同樹種下的雅連土壤樣品經(jīng)16S測序，涵蓋了40門108綱268目481科1 024屬2 735種細菌。

6種樹種下土壤細菌的優(yōu)勢菌門均為變形桿菌門、酸桿菌門、放線菌門，但不同樣本組中的各優(yōu)勢菌屬差異較大，Subgroup_2屬及慢生根瘤菌屬在各樣本組中均處于較高水平，其中鋁、鋅、全磷、鎂、鐵、錳、速效鉀和鈉對細菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。

珙桐樹下的土壤細菌群落有相對較高的豐富度及多樣性，其關鍵微生物是有益細菌綠屈撓菌門的KD4-96，而漆樹下雅連生長狀況較差可能是疣微菌門Candidatus_udaeobacter及棒狀桿菌門Rokubacteriales所致。