楊冬冬，劉穎，曹曉東，張楠，張子英※，馬麗杰※

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)慢性病分子流行病實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是雌激素受體、孕激素受體和人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子均為陰性的一種惡性程度最高的乳腺癌亞型，約占所有乳腺癌的15%~20%[1]。TNBC具有發(fā)病年齡小、侵襲性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移潛能高和預(yù)后差等特征[2]，在臨床治療中，由于缺乏明確的治療靶點(diǎn)，對(duì)內(nèi)分泌和治療不敏感，手術(shù)和化療仍然是主要治療手段[3]。

山慈菇（Cremastra appendicutata,CR AP）為蘭科植物杜鵑蘭、獨(dú)蒜蘭和云南獨(dú)蒜蘭的干燥假鱗莖[4]，山慈菇味甘、微辛，性涼，是具有清熱解毒、化痰散結(jié)的傳統(tǒng)中藥，是臨床上的抗腫瘤藥物[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)[6]其可以通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和干擾細(xì)胞侵襲遷移等發(fā)揮抗乳腺癌作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)篩選藥物、疾病靶點(diǎn)，構(gòu)建生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)圖，揭示中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用關(guān)系，這與中醫(yī)強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)觀(guān)、整體觀(guān)相符[7,8]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選山慈菇治療TNBC的活性化合物、作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)測(cè)可靠性，以期為后續(xù)研究TNBC發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的分子機(jī)制及尋找臨床山慈菇的潛在靶點(diǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

山慈菇（批號(hào)：17122501，內(nèi)蒙古暮昕藥業(yè)）；4T1乳腺癌細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；PBS（批號(hào)：AC10260538，Hyclone公司）、DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：S118024，Gibco公司）、0.25% Trypsin-EDTA（批號(hào)：2046777，Gibco公司）；胎牛血清（批號(hào)：11G313，ExCell Bio公司）；Penicillin-Streptomycin（批號(hào)：51H351，Ex-Cell Bio公司）；PI3K多克隆抗體（批號(hào)：AF6241，Affinity公司）、磷酸化PI3K（p-PI3K）多克隆抗體（批號(hào)：AF3241，Affinity公司）、Akt多克隆抗體（批號(hào)：AF4718，Affinity公司）、p-Akt多克隆抗體（批號(hào)：AF6241，Affinity公司）、-actin（批號(hào)：ab8227，abcam公司）、羊抗兔二抗（批號(hào)：ab97051，abcam公司）。

1.2 山慈菇酯提物的制備

將4 kg的山慈菇加4倍無(wú)水乙醇回流提取，揮去乙醇，形成不溶于水的膠體，乙酸乙酯萃取3次，低溫烘干，待用。取125 mg Cremastra appendicutata，加入0.5 mL DMSO助溶，加生理鹽水定容至10 mL，配制12.5 mg/mL母液，過(guò)濾，4℃保存[9]。

1.3 山慈菇活性成分和靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

本研究通過(guò)運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP,ttp：//tcmspw.com/tcmsp.php），以O(shè)B＞30%和DL≥0.18篩選山慈菇活性化學(xué)成分，并查詢(xún)作用靶點(diǎn)；通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)、Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)搜索文獻(xiàn)補(bǔ)充山慈菇抗腫瘤的相關(guān)活性成分，并在SwissADME平臺(tái)（http://www.swissadme.ch/）進(jìn)行篩選，篩選條件是藥代動(dòng)力學(xué)中胃腸吸收（GI absorption）為High，之后使用Swiss Target Prediction平臺(tái)預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)，通過(guò)使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org） 將靶點(diǎn)規(guī)范為統(tǒng)一對(duì)應(yīng)基因，將活性成分和作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建山慈菇 活性成分 作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 疾病相關(guān)基因檢索

以“triple negative breast cancer”為檢索詞在OMIM（https://omim.org/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，兩者合并后得到靶基因，使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行校正統(tǒng)一。

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將山慈菇和乳腺癌靶點(diǎn)輸入Venny 2.1中得到交集靶點(diǎn)，并導(dǎo)入String（http：//string-db.org/cgi/input.pl）數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析，將結(jié)果保存為T(mén)SV格式文件。使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將節(jié)點(diǎn)與degree值大小關(guān)聯(lián)，節(jié)點(diǎn)越大degree值越大。

1.6 GO富集和KEGG通路富集分析

將1.3中篩選出的山慈菇抗乳腺癌的交集靶點(diǎn)基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//david.ncifcrf.gov/），選擇GO富集和KEGG通路富集分析，設(shè)置閾值P＜0.05，并用OmicShare tool（shttp：//www.omicshare.com/tools/）繪圖軟件可視化。

1.7 分子對(duì)接

選取PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索山慈菇的活性成分的3D結(jié)構(gòu)，在RCSB PBD（https：//www1.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵蛋白，使用Autodock tools 1.5.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接，其結(jié)果以結(jié)合自由能的高低作為活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合的程度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。通?；钚晕镔|(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定能量越低，發(fā)生作用的可能性越大，對(duì)接結(jié)果越可靠。

1.8 Western blot檢測(cè)4T1細(xì)胞AKT/PI3K通路蛋白表達(dá)

將4T1細(xì)胞貼壁培養(yǎng)12 h后，根據(jù)課題組前期研究[8]設(shè)置空白組和山慈菇酯提物低、中、高劑量組，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用PBS洗凈培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，每瓶加300L的蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度并計(jì)算蛋白上樣量。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF膜，一抗孵育4℃過(guò)夜，TBST洗滌3次，5 min/次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，5 min/次，ECL顯色后進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 山慈菇的活性成分及作用靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和中國(guó)知網(wǎng)上檢索相關(guān)山慈菇抗腫瘤的文獻(xiàn)并經(jīng)過(guò)篩選后得到12種成分，將12種活性成分利用TCMSP和Swiss TargetPrediction平臺(tái)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，合并后共得到340個(gè)。如圖1所示，通過(guò)cytoscape 3.7.2軟件得到山慈菇活性成分作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖。紅色菱形代表山慈菇，粉色圓形代表山慈菇活性成分，藍(lán)色方形代表作用靶點(diǎn)，共有364個(gè)靶點(diǎn)，652條邊，代表山慈菇成分與靶點(diǎn)的相互作用。

表1 山慈菇活性化合物成分Table 1 Active compounds of Cremastra appendicutata

圖1 山慈菇化學(xué)成分作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Active compound network of Cremastra appendicutata

2.2 山慈菇抗三陰性乳腺癌候選靶基因的篩選

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索三陰性乳腺癌，取Score＞5得到766個(gè)靶點(diǎn)；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到487個(gè)靶基因，兩者合并后得到1 235個(gè)靶基因。與山慈菇靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，用Venn圖形式體現(xiàn)，得到97個(gè)交集靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 山慈菇和三陰性乳腺癌映射核心靶點(diǎn)Fig.2 Intersection gene of Cremastra appendicutata and triple negative breast cancer target

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將97個(gè)交集靶點(diǎn)代入String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI分析，限定物種為Human，獲取核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系，通過(guò)cytoscape軟件可視化，根據(jù)Degree值對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊代表蛋白之間關(guān)聯(lián)，節(jié)點(diǎn)越大顏色越深說(shuō)明該點(diǎn)的Degree值越高。圖中共有88個(gè)節(jié)點(diǎn)521條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為11.8。從圖可知degree排名前10的靶點(diǎn)有HSP90AA1、EGFR、MAPK1、JUN、PIK3CA、CCND1、TNF和ESR1等。

圖3 核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)互作圖Fig.3 Protein-protein core interaction network diagram

2.4 GO和KEGG富集分析

為了說(shuō)明中藥化合物的靶點(diǎn)蛋白在基因功能和信號(hào)通路中的作用，采用DAVID對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）分析，以P＜0.05篩選顯著富集前10個(gè)條目。如圖4所示，在生物學(xué)過(guò)程（biological process,BP）中涉及調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程等；在細(xì)胞成分（cellular component,CC）涉及了細(xì)胞核、核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)及線(xiàn)粒體膜等；在分子功能（molecular function,MF）主要涉及酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合和蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。

圖4 核心靶點(diǎn)GO分析Fig.4 Core target GO analysis

KEGG通路富集分析共得到109條富集分析結(jié)果，以P＜0.05選取山慈菇治療乳腺癌潛在治療靶點(diǎn)的前20條富集結(jié)果（見(jiàn)圖5和圖6），主要涉及到膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌等多條癌癥相關(guān)通路，PI3K-Akt信號(hào)通路，Ras信號(hào)通路等，構(gòu)建關(guān)鍵成分靶點(diǎn)通路圖，從圖中發(fā)現(xiàn)前10條通路與41個(gè)靶點(diǎn)有著密切的關(guān)系。其中12種活性成分、40個(gè)靶點(diǎn)作用于癌癥通路，有12種成分的27個(gè)靶點(diǎn)作用于PI3KAkt信號(hào)通路，提示山慈菇可能通過(guò)不同成分與多個(gè)靶點(diǎn)相互結(jié)合，調(diào)控不同信號(hào)通路發(fā)揮治療乳腺癌的作用。

圖5 KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

圖6 “成分靶點(diǎn)通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 The“components targets pathways”network diagram

2.5 分子對(duì)接

為了進(jìn)一步明確山慈菇治療乳腺癌的關(guān)鍵靶標(biāo)與活性成分之間的結(jié)合效能，選取山慈菇前4個(gè)活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中前5個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，當(dāng)結(jié)合能＜0 kJ/mol時(shí)，認(rèn)為分子蛋白質(zhì)能自發(fā)結(jié)合，當(dāng)結(jié)合能＜5 kJ/mol時(shí)，認(rèn)為分子蛋白質(zhì)具有較好的結(jié)合性，且結(jié)合能越低，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定。如圖7所示，2-methoxy-9，10-dihydrophenanthrene-4，5-diol，與JUN受體蛋白中氨基酸殘基DA-37、DA-6有兩個(gè)氫鍵聯(lián)系；與MAPK受體蛋白中GLN-103、ASP-104有3個(gè)氫鍵聯(lián)系；與HSP90AA1受體蛋白中氨基酸殘基LYS209、GLN-212、PHE-213有4個(gè)氫鍵聯(lián)系。表2結(jié)果顯示4個(gè)化合物與5個(gè)靶點(diǎn)均能穩(wěn)定結(jié)合，提示山慈菇活性成分與上述靶點(diǎn)之間的相互作用可能為山慈菇治療乳腺癌的機(jī)制之一。2.6山慈菇酯提物對(duì)4T1細(xì)胞AKT/PI3K通路蛋白表達(dá)

表2 山慈菇核心有效成分分子對(duì)接結(jié)果Table 2 Molecular docking results of core active ingredients of Cremastra appendicutata

由圖8可知，山慈菇酯提物作用于乳腺癌細(xì)胞24 h后，與空白組相比，12.5g/mL和125g/mL的CR AP能顯著降低AKT的磷酸化水平，1 250g/mL的CR AP能顯著降低PI3K和AKT的磷酸化的表達(dá)水平（P＜0.05）。

圖8 各組細(xì)胞PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白Western blot電泳圖Fig.8 Western blot analysis of PI3K,p-PI3K,AKT and p-AKT proteins in each group of cells

3 討論

山慈菇始載于我國(guó)唐代《本草拾遺》，是臨床上常用的抗癌中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)山慈菇具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和延緩細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力[14,15]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出山慈菇11個(gè)抗腫瘤活性成分主要包括甾體類(lèi)、二氫菲類(lèi)、聯(lián)芐類(lèi)和芳香酯類(lèi)等。-谷甾醇廣泛存在于各種植物中，研究發(fā)現(xiàn)[16]-谷甾醇可以通過(guò)干擾多種細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮抗乳腺癌的特性。Zhu等[17]發(fā)現(xiàn)-谷甾醇可抑制MCF-7和MDA-MB-231兩種人乳腺癌細(xì)胞增殖，并通過(guò)抑制PI3K-AKT/mTOR通路活化而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。Attanzio等[18]發(fā)現(xiàn)-谷甾醇抑制細(xì)胞乳腺癌活性，并介導(dǎo)線(xiàn)粒體凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。豆甾醇具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎癥等特點(diǎn)[19]。Hyocheol等[20]發(fā)現(xiàn)豆甾醇能上調(diào)卵巢癌中促凋亡bax和Caspase-3等蛋白表達(dá)促使癌細(xì)胞凋亡，并通過(guò)下調(diào)MMP9等蛋白抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)查詢(xún)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)搜索發(fā)現(xiàn)山慈菇成分以菲類(lèi)、二氫菲類(lèi)居多，李小平[13]研究發(fā)現(xiàn)二氫菲類(lèi)化合物是杜鵑蘭的主要成分，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，提示這可能是山慈菇治療乳腺癌的重要成分。

本研究通過(guò)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析獲得山慈菇治療TNBC的關(guān)鍵靶蛋白，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)關(guān)鍵靶蛋白HSP90AA1、MAPK1、EGFR和PI3K3CA與山慈菇活性成分間的對(duì)接良好。熱休克蛋白（Heat shock protein 90 alpha family class A,HSP90AA1）編碼癌癥伴侶蛋白HSP90，HSP90通過(guò)刺激生成腫瘤組織的新生血管，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，影響細(xì)胞的增殖與分化[21]。HSP90在乳腺癌患者血液中高表達(dá)，可作為T(mén)NBC患者預(yù)后不良的指標(biāo)[22]。絲裂原激酶蛋白激酶1（Mitogen activated protein kinase 1,MAPK1）是MAPK信號(hào)通路的重要樞紐，與細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生命活動(dòng)有關(guān)[23]。MAPK的表達(dá)與TNBC的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，研究表明激活MAPK可抑制TNBC細(xì)胞的侵襲遷移[24]。表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth facter receptor,EGFR）是酪氨酸激酶1型受體家族成員之一，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究表明EGFR蛋白在TNBC中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，陽(yáng)性率高達(dá)30%~52%[25]，與野生型EGFR相比，突變型EGFR可明顯增加PI3K和AKT的活化水平，激活PI3K/AKT/MTOR通路[26]。磷脂酰肌醇激酶3催化亞基（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha polypeptide gene,PI3K3CA）是一種致癌基因，編碼PI3K的P110亞基，該基因在很多腫瘤處于異常激活狀態(tài)，大約40%的乳腺癌患者存在PIK3CA表達(dá)上調(diào)和頻繁突變，從而導(dǎo)致P110過(guò)度激活[27]，HU等[28]發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因突變可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖，抑制凋亡，并激活PI3K/ATK/MTOR信號(hào)通路從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的耐藥性。

GO富集和KEGG分析關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，發(fā)現(xiàn)山慈菇活性成分的靶點(diǎn)可能通過(guò)Pathways in cancer、PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等生物過(guò)程。PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路，該通路的異常激活可使腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖、抑制細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[29]，還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[30,31]。PI3K蛋白家族是催化肌醇基團(tuán)磷酸化的蛋白激酶，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要成分，能被受體（RTK）激活，而活化的PI3K蛋白家族將磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），進(jìn)一步激活下游信號(hào)因子AKT，促進(jìn)AKT磷酸化[32]，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。

在TNBC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中頻繁發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的過(guò)度激活[33]，這或許與TNBC的侵襲轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、預(yù)后差的臨床特點(diǎn)密切相關(guān)，抑制該通路激活可成為T(mén)NBC新的治療方向。因此為了進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，結(jié)合本課題組前期發(fā)現(xiàn)山慈菇抑制鼠源TNBC 4T1細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡[8]，本研究采用Western blot方法驗(yàn)證了山慈菇是否通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路影響4T1細(xì)胞增殖、凋亡，結(jié)果顯示高濃度的山慈菇干預(yù)4T1細(xì)胞24 h后，4T1細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的蛋白水平明顯降低，提示山慈菇通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路磷酸化，進(jìn)而抑制該通路的活化，影響4T1的增殖和凋亡。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法預(yù)測(cè)了山慈菇有效活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和作用機(jī)制，可為山慈菇治療三陰性乳腺癌的臨床應(yīng)用及深入研發(fā)提供依據(jù)。