李昆諭，劉玉芳，陶林，江炎庭，歐陽(yáng)依娜，儲(chǔ)明星※，※

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056001；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

對(duì)于山羊（Capra hircus）的生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，產(chǎn)羔數(shù)是一個(gè)極為重要的經(jīng)濟(jì)性狀，但現(xiàn)如今世界上大部分山羊品種產(chǎn)羔數(shù)量不均一，僅有少數(shù)擁有一胎多羔的優(yōu)良繁殖特性[1,2]。因此，提高山羊的產(chǎn)羔數(shù)能夠有效提高山羊養(yǎng)殖的效益并促進(jìn)山羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前關(guān)于山羊育種改良的研究主要集中于繁殖性狀的重要候選基因上，選擇這些基因的有利等位基因可能有助于高產(chǎn)育種群體的建立，對(duì)山羊的選育工作有持續(xù)深遠(yuǎn)的影響。

早期生長(zhǎng)反應(yīng)4（early growth response 4,EGR4）屬于早期生長(zhǎng)反應(yīng)家族（EGR），該蛋白家族由EGR1、EGR2、EGR3和EGR4 4種密切相關(guān)的蛋白組成。這4種EGR蛋白都具有一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合域，與基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的一個(gè)9 bp的反應(yīng)元件結(jié)合，以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活[3]。EGR4基因定位于山羊11號(hào)染色體，擁有2個(gè)外顯子。賴氨酸脫甲基酶4C（lysine demethylase 4C,KDM4C）和賴氨酸脫甲基酶6A（lysine demethylase 6A，KDM6A）分別定位于山羊的8號(hào)和X號(hào)染色體，分別擁有24個(gè)和31個(gè)外顯子。KDM4C和KDM6A均屬于組蛋白賴氨酸去甲基化酶（KDM）家族。目前研究表明，部分KDM家族成員參與體細(xì)胞、生殖細(xì)胞和胚胎細(xì)胞H3K4甲基化水平的調(diào)節(jié)，包括KDM1（例如KDM1A和KDM1B）和KDM5（例如KDM5A、KDM5B和KDM5C）家族成員[4-7]。有研究人員發(fā)現(xiàn)KDM1A可以調(diào)節(jié)精子發(fā)生并影響跨代遺傳[8]，而KDM5B能調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育和存活[4,6]。綜上所述，EGR4、KDM4C和KDM6A可能與山羊的繁殖有一定關(guān)系。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)云上黑山羊（云上黑山羊是以云嶺山羊?yàn)槟副?、努比山羊?yàn)楦副九嘤傻奈覈?guó)第一個(gè)肉用黑山羊品種[9,10]）的重測(cè)序結(jié)果，通過(guò)GWAS分析篩選出全基因組中的正選擇基因（positively selected genes,PSG）EGR4、KDM4C和KDM6A，結(jié)合文獻(xiàn)資料，推測(cè)EGR4、KDM4C和KDM6A可能對(duì)山羊繁殖性能有一定的影響。在前期數(shù)據(jù)結(jié)果中篩選出與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的8個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為EGR4 g.11028295G＞A、g.11029053G＞T和g.11029600T＞A位點(diǎn)；KDM4C g.37764228T＞A、g.37767773T＞A和g.37768026C＞G位點(diǎn)；KDM6A g.27102554T＞A和g.27177505C＞A位點(diǎn)。采用MassARRAY?SNP分型技術(shù)，在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊3個(gè)山羊群體中對(duì)候選基因的基因型進(jìn)行檢測(cè)，分析其多態(tài)性與山羊繁殖性能之間的關(guān)聯(lián)性，以期為山羊的高繁殖力分子標(biāo)記輔助選擇育種提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)山羊品種共計(jì)768只（2~5歲），其中云上黑山羊544只、濟(jì)寧青山羊133只、遼寧絨山羊91只。本實(shí)驗(yàn)中濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊?yàn)閷?duì)照群體，其中將濟(jì)寧青山羊視為高繁殖力群體（均為經(jīng)產(chǎn)母羊，產(chǎn)羔數(shù)3.00±0.38），遼寧絨山羊視為低繁殖力群體（均為經(jīng)產(chǎn)母羊，產(chǎn)羔數(shù)1.02±0.19），見(jiàn)表1。所有試驗(yàn)用山羊飼養(yǎng)條件一致，云上黑山羊擁有至少1胎產(chǎn)羔數(shù)記錄，部分擁有初生窩重和斷奶窩重（3月齡）記錄，所有羊均采用頸靜脈采血（10 mL/只），使用EDTA-K2抗凝，20℃保存。

表1 被測(cè)山羊品種及個(gè)體數(shù)量信息Table 1 The information on the breeds of goats tested and the number of individuals

1.2 血液DNA的提取

試驗(yàn)樣本使用酚氯仿法提取基因組DNA，采用Nano Drop2000檢測(cè)DNA樣本濃度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.3 基因分型

采用Sequenom MassARRAY?SNP分型技術(shù)對(duì)EGR4、KDM4C和KDM6A基因共計(jì)8個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，相關(guān)引物信息見(jiàn)表2，分型樣品為DNA，每個(gè)樣品需要量為20L，DNA濃度為40~80 ng/L。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2020軟件統(tǒng)計(jì)山羊EGR4、KDM4C和KDM6A突變位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用IBM SPSS Statistics 25軟件中的一般線性模型，多重比較采用LSD法，對(duì)山羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（**P＜0.01；*P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGR4多態(tài)性分析

利用Sequenom MassARRAY?SNP對(duì)768只山羊血液DNA進(jìn)行基因分型。結(jié)果顯示，EGR4 3個(gè)SNPs位點(diǎn)在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊中存在多態(tài)性，其中g(shù).11028295G＞A位點(diǎn)基因型為GG、GA、AA，g.11029053G＞T位點(diǎn)基因型為GG、GT、TT，g.11029600T＞A位點(diǎn)基因型為AA、TA和TT（圖1）。

圖1 EGR4位點(diǎn)分型結(jié)果Fig.1 The results of EGR4 gene locus typing

統(tǒng)計(jì)濟(jì)寧青山羊（高繁）和遼寧絨山羊（低繁）山羊品種中EGR4 3個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率（表3），EGR4g.11028295G＞A和g.11029600T＞A位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），g.11028295G＞A和g.11029053G＞T位點(diǎn)在高繁群體和低繁群體的優(yōu)勢(shì)基因型均為GG，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镚；g.11029600T＞A位點(diǎn)在高繁群體和低繁群體的優(yōu)勢(shì)基因型為T(mén)T，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)門(mén)。

表3 EGR4、KDM4C和KDM6A 8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在高繁、低繁山羊品種中的基因型和等位基因頻率Table 3 Genotype and allele frequencies of 8 polymorphic loci of EGR4，KDM4C and KDM6A in high-and low-reproduction goat breeds

群體遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)表明，EGR4 g.11029053G＞T和g.11029600T＞A位點(diǎn)在云上黑山羊中為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），在濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊中為低度多態(tài)（PIC＜0.25），g.11028295G＞A位點(diǎn)在3個(gè)山羊群體中為低度多態(tài)（PIC＜0.25）?？ǚ竭m應(yīng)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，EGR4基因3個(gè)SNPs位點(diǎn)在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），見(jiàn)表4。

2.2 KDM4C和KDM6A基因多態(tài)性分析

基因分型結(jié)果表明（圖2，3），KDM4C和KDM6A5個(gè)SNPs位點(diǎn)在3個(gè)山羊群體中均存在多態(tài)性。KDM4C和KDM6A 5個(gè)SNPs位點(diǎn)在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊中存在3種基因型。

圖2 KDM4C位點(diǎn)分型結(jié)果Fig.2 The results of KDM4C locus typing

如表3所示，KDM4C g.37764228T＞A、KDM6A g.27177505C＞A位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），但KDM4C g.37767773T＞A和g.37768026C＞G位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異不顯著（P＞0.05）。其中KDM4C g.37764228T＞A、g.37767773T＞A和KDM6A g.27102554T＞A位點(diǎn)在高繁和低繁山羊群體中的優(yōu)勢(shì)基因型為T(mén)T，優(yōu)勢(shì)等位基因均為T(mén)；KDM4C g.37768026C＞G位點(diǎn)在高繁和低繁山羊群體中的優(yōu)勢(shì)基因型為CC，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镃；KDM6A g.27177505C＞A位點(diǎn)在高繁和低繁山羊群體中的優(yōu)勢(shì)基因型為AA，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳。

群體遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)表明，KDM4C g.37764228T＞A位點(diǎn)在濟(jì)寧青山羊中為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），在遼寧絨山羊和云上黑山羊中為低度多態(tài)（PIC＜0.25），KDM4C g.37767773T＞A和g.37768026C＞G位點(diǎn)在3個(gè)山羊群體中為低度多態(tài)（PIC＜0.25）；KDM6A g.27177505C＞A在濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊中為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），在云上黑山羊中為低度多態(tài)（PIC＜0.25）?？ǚ竭m應(yīng)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，KDM4C g.37764228T＞A、g.37767773T＞A和g.37768026C＞G在3個(gè)山羊群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）；KDM6A g.27102554T＞A和g.27177505C＞A位點(diǎn)分別在遼寧絨山羊中和濟(jì)寧青山羊中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P＜0.05），在云上黑山羊中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 EGR4、KDM4C和KDM6A 8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在不同山羊品種中的群體遺傳學(xué)分析Table 4 The population genetic analysis of 8 polymorphic loci of EGR4，KDM4C and KDM6A in different goat breeds

圖3 KDM6A位點(diǎn)分型結(jié)果Fig.3 The results of KDM6A locus typing

2.3 候選SNPs位點(diǎn)與云上黑山羊繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

EGR4 g.11029600T＞A位點(diǎn)TT型的初生窩重和斷奶窩重顯著高于AA型（P＜0.05）。KDM4C g.37764228T＞A位點(diǎn)TT和TA型的產(chǎn)羔數(shù)、初生窩重和斷奶窩重顯著高于AA型（P＜0.05）。KDM6A g.27177505C＞A位點(diǎn)CC型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CA型和AA型（P＜0.05）；KDM6A g.27102554T＞A位點(diǎn)TT型的初生窩重和斷奶窩重顯著高于AA型（P＜0.05）。其余SNPs位點(diǎn)多態(tài)性與云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)、初生窩重和斷奶窩重?zé)o顯著相關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表5。

表5 EGR4、KDM4C和KDM6A對(duì)云上黑山羊產(chǎn)羔性能的影響（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）Table 5 The influence of EGR4，KDM4C and KDM6A on the reproduction performance of Yun shang black goats(mean±standard error)

3 討論

3.1 EGR4與生殖性狀的關(guān)系

EGR4最初發(fā)現(xiàn)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，但是EGR家族的其他成員在中樞神經(jīng)系統(tǒng)外也存在著廣泛的表達(dá)[11]。有研究表明，EGR4的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠生殖細(xì)胞發(fā)育的不成熟，進(jìn)而導(dǎo)致雄性小鼠的不育[12]。在Sertoli細(xì)胞中，EGR4對(duì)于Sertoli細(xì)胞的分裂有一定調(diào)控作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)精子的發(fā)生，EGR4也可在管周肌樣細(xì)胞和其他一些生殖細(xì)胞中發(fā)揮作用[13]。此外，有研究表明EGR4在人類的不孕癥中也發(fā)揮了一定的作用[14]。我們的研究表明在云上黑山羊中EGR4g.11029600T＞A位點(diǎn)TT型個(gè)體的初生窩重和斷奶窩重顯著高于TA和AA型個(gè)體。因此，我們推測(cè)EGR4g.11029600T＞A位點(diǎn)的突變可能影響了羔羊初生體重，并在初生羔羊的初期發(fā)育中起到了一定的作用。EGR4 g.11029600T＞A位點(diǎn)或可作為云上黑山羊初生窩重和斷奶窩重選擇的一個(gè)潛在分子標(biāo)記。

3.2 KDM4C和KDM6A與生殖性狀的關(guān)系

有研究表明，KDM6A可以影響配子體的發(fā)育，對(duì)動(dòng)物繁殖至關(guān)重要，在嚙齒動(dòng)物中，敲除KDM6A后破壞了原始生殖細(xì)胞的發(fā)育[15]。在雌性小鼠中，包含生殖相關(guān)同源框基因的Rhox基因簇也受KDM6A調(diào)控[16]。此外，KDM6A還可以調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞的成熟[17]。我們的研究表明，KDM4C g.37764228T＞A位點(diǎn)TT和TA型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)、初生窩重和斷奶窩重顯著高于AA型個(gè)體，KDM6A g.27177505C＞A位點(diǎn)CC型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CA型和AA型個(gè)體。這些結(jié)果都表明KDM4C和KDM6A的多態(tài)性對(duì)于云上黑山羊母羊的繁殖性能是有一定的影響的。KDM4C g.37764228T＞A可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)、初生窩重和斷奶窩重選擇的一個(gè)潛在分子標(biāo)記。KDM6A g.27177505C＞A可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的一個(gè)潛在分子標(biāo)記。此外，KDM6A g.27102554T＞A位點(diǎn)的多態(tài)性與云上黑山羊的初生窩重和斷奶窩重顯著相關(guān)?？傮w而言，KDM4C和KDM6A在調(diào)控山羊繁殖性能方面有一定的作用。

4 結(jié)論

本研究表明，EGR4 g.11029600T＞A、KDM4C g.37764228T＞A和KDM6A g.27102554T＞A位點(diǎn)與云上黑山羊初生窩重和斷奶窩重存在顯著關(guān)聯(lián)，可作為云上黑山羊窩重選擇的潛在分子標(biāo)記。KDM4C g.37764228T＞A和KDM6A g.27177505C＞A位點(diǎn)與云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)存在顯著關(guān)聯(lián)，可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標(biāo)記。