楊雅婧，張志衡，琚魏波，李玉娥，陳振家

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801)

大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)，豆科大豆屬，在全世界范圍內(nèi)均有種植。大豆中有35%～40%的蛋白質(zhì)，是良好的蛋白質(zhì)來源之一，脂類約占20%，還含有約9%的膳食纖維[1]。已證明大豆中的蛋白質(zhì)、異黃酮、皂甙和蛋白酶抑制劑等生物活性物質(zhì)在調(diào)節(jié)人體生理功能和預(yù)防慢性疾病方面起著重要作用[2]。豆腐作為一種傳統(tǒng)豆制品，由于其熱量較低而在全球范圍內(nèi)廣受歡迎。研究表明，豆腐可以潛在地降低心血管疾病、高血壓、糖尿病和其他疾病的風(fēng)險[3]。隨著豆腐形成理論的確認(rèn)和現(xiàn)代食品加工技術(shù)的發(fā)展，豆腐產(chǎn)品的多樣性滿足了不同的消費需求。

豆腐的生產(chǎn)過程中點漿是最關(guān)鍵的一步，即在豆?jié){中添加不同的凝固劑使其發(fā)生凝固[4]。內(nèi)酯豆腐是加入GDL這種酸類凝固劑形成的，GDL在豆?jié){中溶解，釋放出葡萄糖酸，由于H+釋放速率相對緩慢，蛋白質(zhì)表面的靜電斥力減弱，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成緩慢，有助于形成細(xì)膩均勻的結(jié)構(gòu)[5]，因此制作出的內(nèi)酯豆腐爽口滑嫩、質(zhì)地細(xì)膩，深受消費者喜愛。

然而長期以來，我國內(nèi)酯豆腐生產(chǎn)企業(yè)大多生產(chǎn)模式較粗放，凝固劑的用量依靠經(jīng)驗確定，這些因素會導(dǎo)致內(nèi)酯豆腐品質(zhì)極不穩(wěn)定，無法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)?；诖耍ㄟ^對不同GDL添加量形成的內(nèi)酯豆腐品質(zhì)進(jìn)行檢測與分析，研究GDL添加量與內(nèi)酯豆腐凝膠特性的相關(guān)性，以期為豆制品的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料

市售大豆樣品：綏化市正大米業(yè)有限公司；市售δ-葡萄糖酸內(nèi)酯：安琪酵母股份有限公司。

1.2 試劑

考馬斯亮藍(lán)G-250、SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、低分子量蛋白質(zhì)Marker(14.4～97.4 ku)、Tris：北京索萊寶科技有限公司；甲叉雙丙烯酰胺、無水乙醇、甘氨酸、甘油：生工生物工程(上海)股份有限公司；氯化鈉、尿素、鹽酸、羅丹明：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純，均用普通蒸餾水配制。

1.3 主要儀器與設(shè)備

九陽JYL-G12E型榨汁攪拌機；華帝TLSK-22GB01型電陶爐；HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司；TMS-Pro型質(zhì)構(gòu)儀 Food Technology Corporation；TCS SP8型激光掃描共聚焦顯微鏡 德國徠卡(Leia)儀器公司；HC-2064型高速離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；UV-1200型可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；DYY-7C型電泳儀 北京六一儀器廠；Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克(Bruker)公司。

1.4 方法

1.4.1 內(nèi)酯豆腐的制備

大豆浸泡12 h，按1∶5的比例與水磨漿，過200目篩，取豆?jié){煮沸5 min[6]，冷卻至85 ℃，在豆?jié){pH為6.5的條件下分別按照豆?jié){0.2%、0.3%、0.4%的比例添加GDL，于85 ℃水浴鍋中恒溫1 h取出。

1.4.2 內(nèi)酯豆腐質(zhì)構(gòu)性的測定

將豆腐切成長方體(4 cm×4 cm×1 cm)，采用質(zhì)構(gòu)儀測定[7]，重復(fù)10次。

1.4.3 內(nèi)酯豆腐含水量及保水性的測定

含水量(MC)參照GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》中的直接干燥法[8]進(jìn)行測定。

參考王睿粲[9]的方法。離心管內(nèi)管底部為網(wǎng)狀，放一張濾紙于內(nèi)管中，記濾紙和內(nèi)管的質(zhì)量為m1，稱取豆腐約1 g于內(nèi)管中，記此時內(nèi)管質(zhì)量為m2，離心管在3 500 r/min下離心10 min后，記內(nèi)管質(zhì)量為m3，其保水性通過下式計算：

1.4.4 內(nèi)酯豆腐凝膠作用力的測定

參考Gómez-Guillén等[10]的方法。采用考馬斯亮藍(lán)法測定。

1.4.5 SDS-PAGE

參考Lars等[11]的方法。稱取5 mg固體樣品加入處理液中，液體樣品的蛋白濃度為1 mg/mL，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，上樣量為6 μL。

1.4.6 傅里葉變換紅外光譜分析

參照Shin等[12]的方法。將凍干樣品與KBr按1∶100研磨，壓成透明片狀后測定，利用PeakFit軟件計算二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.4.7 內(nèi)酯豆腐微觀結(jié)構(gòu)的測定

參考Kuipers等[13]的方法。將1 mL 0.2%羅丹明溶液加入100 mL豆乳中，分別配制0.2%、0.3%、0.4% GDL添加量的混合溶液，振蕩均勻后取10 μL滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，并滴加少量指甲油防止水分蒸發(fā)，包裹錫紙，在90 ℃保溫箱中保溫1 h，冷卻至室溫，避光放置，通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，激發(fā)波長設(shè)置為543 nm，測定范圍為580～700 nm。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8.0和Excel軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)并作圖，用SPSS軟件分析不同處理間的差異性，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 GDL添加量對豆腐質(zhì)構(gòu)性的影響

質(zhì)構(gòu)性是評價豆腐感官特性的重要指標(biāo)之一，在測定過程中，模擬施加的食物在口腔中的咀嚼過程，選取以下4個參數(shù)：硬度、內(nèi)聚性、彈性和咀嚼性[14]。由表1可知，隨著GDL添加量的增加，內(nèi)酯豆腐的彈性、硬度和咀嚼性均呈上升趨勢，內(nèi)聚性先降低后升高。表明隨著GDL添加量的增加，H+釋放增多，進(jìn)一步降低豆?jié){水溶性蛋白體系的pH值，使大豆蛋白H+電離程度降低，進(jìn)而削弱大豆蛋白的水合能力，促使大豆蛋白失去水化膜而發(fā)生聚集[15]。GDL添加量的增加也導(dǎo)致更多的蛋白質(zhì)參與豆腐凝膠的形成，進(jìn)而形成更加完善的凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這是導(dǎo)致內(nèi)酯豆腐的硬度、彈性和咀嚼性增加的原因[16]。

表1 GDL添加量對豆腐質(zhì)構(gòu)性的影響Table 1 Effect of GDL addition amount on the texture properties of tofu

2.2 GDL添加量對豆腐含水量與保水性的影響

含水量指食物中水分所占比例；保水性指蛋白質(zhì)保留住水分的能力，隨著豆腐保水性的增加，其得率也增加，豆腐品質(zhì)得到提升[17]。由圖1可知，內(nèi)酯豆腐的含水量很高，均在90%左右，當(dāng)GDL添加量為0.2%時含水量最高，達(dá)到91.78%，隨著GDL添加量的增加，含水量逐漸降低；GDL添加量對豆腐保水性的影響很大，內(nèi)酯豆腐的保水性隨著GDL添加量的增加呈逐漸上升趨勢，0.4%內(nèi)酯豆腐的保水性最高，達(dá)到83.38%。

圖1 GDL添加量對豆腐含水量和保水性的影響Fig.1 Effect of GDL addition amount on water content and water retention of tofu

GDL添加量的增加會促進(jìn)豆?jié){中蛋白質(zhì)的聚集，而聚集程度的增加會加速豆腐凝膠網(wǎng)絡(luò)形成的速率，導(dǎo)致部分水分從凝膠網(wǎng)絡(luò)中析出[18]。因此，隨著GDL添加量的增加，內(nèi)酯豆腐的含水量逐漸降低，此外，GDL添加量會促進(jìn)更多蛋白質(zhì)參與凝膠形成和凝膠網(wǎng)絡(luò)的充分形成，加大對凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部水分的束縛，進(jìn)而內(nèi)酯豆腐的保水性隨著GDL添加量的增加呈逐漸上升趨勢[19]。

2.3 GDL添加量對豆腐凝膠作用力的影響

在豆腐制備過程中大豆蛋白的凝膠化過程較為復(fù)雜，包括通過熱變性暴露疏水基團(tuán)，通過蛋白質(zhì)締合聚集，以及通過疏水和電荷相互作用凝結(jié)，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[20]。內(nèi)酯豆腐中維持凝膠結(jié)構(gòu)的分子間作用力主要包括氫鍵、離子鍵、疏水相互作用和二硫鍵，這些作用力使得凝膠達(dá)到平衡狀態(tài)[21]。由圖2可知，0.2%內(nèi)酯豆腐的凝膠作用力貢獻(xiàn)大小排序為：疏水作用>二硫鍵>氫鍵>離子鍵，0.3%內(nèi)酯豆腐的凝膠作用力貢獻(xiàn)大小排序為：疏水作用>二硫鍵>離子鍵>氫鍵，0.4%內(nèi)酯豆腐的凝膠作用力貢獻(xiàn)大小排序為：疏水作用>氫鍵>二硫鍵>離子鍵，隨著GDL添加量的增加，內(nèi)酯豆腐的疏水作用有一定增加，離子鍵和二硫鍵先增加后減少，而氫鍵則先減少后增加，由于豆?jié){中的蛋白質(zhì)全部參與了內(nèi)酯豆腐凝膠結(jié)構(gòu)的形成，因此作用力的測定結(jié)果說明，增加GDL添加量后，更多的蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合到凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，改變了內(nèi)酯豆腐中凝膠作用力的比例。

圖2 GDL添加量對豆腐中凝膠作用力組成的影響Fig.2 Effect of GDL addition amount on gel force composition of tofu

在豆腐形成過程中，大豆蛋白在豆?jié){煮制過程中已經(jīng)得到充分變性，變性后的蛋白疏水基團(tuán)充分暴露，此時豆?jié){中蛋白已經(jīng)具備足夠的聚集趨勢，但蛋白與水分之間的水合狀態(tài)在氫鍵作用下得以保持[22]。而隨著內(nèi)酯的添加，在改變pH值的同時，破壞蛋白質(zhì)的水合狀態(tài)，引發(fā)蛋白聚集。因此，GDL的添加促進(jìn)更多的蛋白質(zhì)通過疏水作用力形成并構(gòu)建凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[23]。

2.4 SDS-PAGE

由圖3中a可知，內(nèi)酯豆腐中的亞基組成主要包括11S的A、B亞基和7S的α、α′、β亞基，以及部分大分子聚集體(>100 ku)，豆腐中可溶性蛋白含量很少且主要由11S亞基組成，不溶性蛋白主要由7S亞基組成，且隨著GDL添加量的增加，可溶性蛋白的亞基條帶逐漸減少，說明蛋白質(zhì)向凝膠轉(zhuǎn)化的趨勢增大；由圖3中b可知，內(nèi)酯豆腐在SA、SB、SC、SD 4種溶液中的亞基條帶逐漸增加，尤其以SC、SD溶液中的變化最為明顯，說明疏水作用是內(nèi)酯豆腐中主要作用力，而離子鍵和氫鍵在豆腐中的占比較少，SA、SB、SC溶液中以11S的A亞基條帶為主，說明離子鍵和氫鍵主要參與了11S凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，SD中7S條帶大幅增加，11S亞基條帶也有所加深，說明疏水作用主要參與7S凝膠的形成，同時對11S凝膠的形成也有一定的貢獻(xiàn)，增加GDL添加量后，SB、SC溶液7S亞基逐漸消失，離子鍵和氫鍵的占比降低；對比圖3中a、c和b、d發(fā)現(xiàn)，加入β-巰基乙醇后，電泳圖中出現(xiàn)了新的亞基(A3)，11S的B亞基條帶明顯加深，且大分子聚集體條帶變淺，說明內(nèi)酯豆腐中的部分11S和大分子聚集體通過二硫鍵結(jié)合。

a

b

c

d

2.5 紅外光譜測定結(jié)果

大豆蛋白質(zhì)凝膠體系與其二級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，通過傅里葉變換紅外光譜對豆腐中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，能夠反映出GDL添加量對豆腐中蛋白質(zhì)聚集狀態(tài)的影響[24]。紅外光譜圖上不同波峰對應(yīng)不同的基團(tuán)，例如3 250～3 400 cm-1是羥基基團(tuán)，脂肪族氨基酸殘基分別在2 800～3 000 cm-1和1 440～1 465 cm-1附近歸屬于C-H拉伸和彎曲模式，蛋白質(zhì)的紅外吸收帶主要有3個，其中酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)對研究二級結(jié)構(gòu)最重要，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要包括β-折疊、無規(guī)則卷曲、α-螺旋及β-轉(zhuǎn)角，分別對應(yīng)1 600～1 640 cm-1、1 640～1 650 cm-1、1 650～1 660 cm-1和1 660～1 700 cm-1[25]。

內(nèi)酯豆腐的紅外光譜圖見圖4。

圖4 不同GDL添加量制備的內(nèi)酯豆腐中蛋白質(zhì)紅外光譜分析Fig.4 Infrared spectra analysis of protein in lactone tofu prepared with different GDL addition amount

隨著豆?jié){的加熱和GDL添加量的增加，3 250～3 400 cm-1處羥基基團(tuán)吸收峰強度降低，氫鍵作用減弱，2 800～3 000 cm-1處C-H拉伸脂肪族氨基酸殘基對應(yīng)的峰面積隨著內(nèi)酯添加量的增加而增大，蛋白質(zhì)聚集的趨勢增大。

表2 GDL添加量對豆腐二級結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of GDL addition amount on the secondary structure of tofu

由表2可知，內(nèi)酯豆腐中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由β-折疊和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成，無規(guī)則卷曲和α-螺旋含量較少，隨著GDL添加量的增加，β-折疊含量由31.93%增加到38.43%，無規(guī)則卷曲含量由13.93%下降到13.78%，α-螺旋含量先升高后降低，由13.96%增加到15.27%又下降到13.98%，β-轉(zhuǎn)角含量由40.18%下降到33.81%。

天然大豆蛋白以α-螺旋結(jié)構(gòu)含量最高，隨著加熱和豆腐凝膠的形成，蛋白由α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)而形成更為有序的β-折疊，這也是豆腐凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的有序形成所導(dǎo)致。

2.6 GDL添加量對豆腐微觀結(jié)構(gòu)的影響

通過激光共聚焦掃描觀察GDL添加量不同時豆腐的微觀結(jié)構(gòu)，圖5中淺色區(qū)域為蛋白質(zhì)聚集體區(qū)域，而深色區(qū)域為網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的孔隙。有研究表明[26]，酸化速率過低或過高均不利于均勻的凝膠結(jié)構(gòu)的形成。圖5中A為熟豆乳的激光共聚焦掃描圖，圖中淺色區(qū)域均勻分布，孔徑小且密集，表明此時豆乳中蛋白質(zhì)尚未發(fā)生聚集，主要以小分子蛋白形式存在，無凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成；圖5中B為GDL添加量0.2%時豆腐的激光共聚焦掃描圖，相比于圖A中深色區(qū)域增多，表明蛋白質(zhì)在質(zhì)子的作用下發(fā)生了一定程度的聚集，但由于聚集程度較低，只有極少部分蛋白參與了凝膠結(jié)構(gòu)的形成；圖5中C為GDL添加量0.3%時豆腐的激光共聚焦掃描圖，圖中淺色區(qū)域呈連續(xù)均勻的蜂窩狀分布，形成了明顯的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，與圖5中B相比，蛋白質(zhì)聚集體的分布更加均勻，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，說明蛋白質(zhì)聚集程度大幅提高，并且此時酸化速率適宜，尚能形成有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；圖5中D為GDL添加量0.4%時豆腐的激光共聚焦掃描圖，與圖5中C相比，深色區(qū)域明顯增多且分布不均勻，說明由于酸化速率過快，蛋白質(zhì)聚集沉淀速度過快，不利于形成有序的凝膠結(jié)構(gòu)。豆腐中GDL添加量為0.3%時，其凝膠微觀結(jié)構(gòu)最佳，凝膠中蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)更加充分均勻。

圖5 不同GDL添加量豆腐激光共聚焦掃描圖Fig.5 Confocal laser scanning diagram of tofu with different GDL addition amount

3 結(jié)論

通過對不同GDL添加量的豆腐特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，隨著GDL添加量的增加，內(nèi)酯豆腐的硬度、彈性和聚集性逐漸提高，內(nèi)聚性幾乎不變；內(nèi)酯豆腐的含水量降低，保水性呈增大趨勢；內(nèi)酯豆腐凝膠中離子鍵和二硫鍵先增加后減少，而氫鍵則先減少后增加，疏水作用增強，可溶性蛋白的亞基條帶逐漸減少，蛋白質(zhì)逐漸向凝膠網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)化，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變得更加有序，β-折疊在內(nèi)酯豆腐蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中占比最高，隨著GDL添加量的增加，當(dāng)GDL添加量為0.3%時，其凝膠微觀結(jié)構(gòu)中的交聯(lián)反應(yīng)最均勻。