吳艷芳 秦海軍 俞周萍 于 波 王靖婷 黃楊敏 沈治平 李 超※

（1.合肥華潤神鹿藥業(yè)有限公司，安徽 合肥 231202；2.濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 泰興 225400）

羅布麻葉配方顆粒是夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetumL.的干燥葉經(jīng)炮制加工后制成的配方顆粒[1]。根據(jù)多批次樣品的實(shí)際性狀描述，本品為棕黃色的顆粒，氣微，味苦、澀。羅布麻作為一味名貴的中草藥，全草可入藥，其被李時(shí)珍寫入《本草綱目》[2]以前，就有對羅布麻的記載，例如三國時(shí)期陶弘景所著的《名醫(yī)別錄》[3]也有記載羅布麻的根可以入藥；《救荒本草》[4]等記載羅布麻葉具有平心悸、止眩暈的作用?，F(xiàn)代藥理研究[5-8]證明，羅布麻葉的臨床效果較好，在降血壓、降血脂、保肝、抗抑郁等方面具有十分明顯的功效。中藥配方顆粒，是指以單味中藥飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代工藝提取、精制而成的一種顆粒狀制劑[9]。由于中藥配方顆粒具有便攜性及易服用性，因此成為近年來的研究熱點(diǎn)，但是其在質(zhì)量方面仍存在無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的問題，產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊。本研究為了增加配方顆粒工藝的穩(wěn)定性以及質(zhì)量的可控性，對羅布麻葉配方顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制研究，同時(shí)為中藥配方顆粒質(zhì)量研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料 羅布麻葉配方顆粒，批號：1907013、1908013、1908023，規(guī)格：3 g/ 袋（相當(dāng)于飲片量10 g），濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司。羅布麻葉對照藥材，批號：120979-201505，規(guī)格：2 g/支，中國食品藥品檢定研究院。金絲桃苷，批號：111521-201809，規(guī)格：20 mg/支，純度：94.9%，中國食品藥品檢定研究院。槲皮素，批號：100081-201610，規(guī)格：100 mg/支，純度：99.1%，中國食品藥品檢定研究院。山柰素，批號：110861-202013，規(guī)格：20 mg/支，純度：93.2%，中國食品藥品檢定研究院。糊精，190211，安徽山河藥用輔料股份公司。乙醇、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲酸、磷酸、無水氯化鋁為分析純，上海國藥集團(tuán)。甲醇、乙腈為色譜純，德國默克公司。

1.2 儀器設(shè)備 硅膠G 薄層板，青島海浪硅膠干燥劑有限公司；XSE 205DU 電子天平，梅特勒-托利多（常州）稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；SY8200T 超聲波清洗器，上海聲源有限公司；Goodlook-2000 薄層成像儀，大昌華嘉商業(yè)（中國）有限公司；KW-1000DC 水浴鍋，江蘇中大有限公司；SHIMADZU LC20AD 高效液相色譜儀，日本島津公司。

2 方法

2.1 薄層鑒別

2.1.1 鑒別方法 參考《中華人民共和國藥典》2020 年版第一部中羅布麻葉飲片的薄層鑒別方法并進(jìn)行優(yōu)化，該方法分別以羅布麻葉對照藥材和槲皮素對照品、山柰素對照品作為對照品。

精密稱取羅布麻葉配方顆粒0.3 g，置于錐形瓶中，加甲醇溶液20 mL，超聲處理25 min（功率200 W，頻率58 kHz），濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，用水飽和正丁醇20 mL 振搖提取，分取正丁醇溶液，置水浴鍋上蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。取羅布麻葉對照藥材1 g，同供試品溶液制備方法處理對照藥材，作為羅布麻葉對照藥材溶液。取槲皮素對照品、山柰素對照品適量，加乙醇制成每l mL 各含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。

吸取2 μ L 槲皮素對照品、2 μ L 山柰素對照品溶液、5 μ L 羅布麻葉對照藥材溶液、3 μ L 供試品溶液，依次點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7∶2.5∶0.1∶0.2），顯色劑為3%三氯化鋁乙醇溶液，展開晾干噴顯色劑后放置于105 ℃烘箱中加熱2 min，斑點(diǎn)顯色清晰后取出，置紫外燈（365 nm）下檢視。

2.1.2 專屬性試驗(yàn) 精密稱取糊精0.015 g，置于錐形瓶中，按羅布麻葉供試品處理方法制得陰性樣品。分別取槲皮素和山柰素對照品溶液各2 μ L、羅布麻葉對照藥材溶液5 μ L、供試品和陰性樣品溶液各3 μ L，按優(yōu)化后的薄層鑒別方法進(jìn)行操作。

2.1.3 樣品鑒別 精密稱取3 批羅布麻葉配方顆粒0.3 g，分別置于錐形瓶中，按優(yōu)化后的薄層鑒別方法進(jìn)行操作。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 島津20AD 高效液相色譜儀，Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.60 mm，5 μ m）色譜柱，以乙腈-0.2%磷酸（15∶85）為流動相，檢測波長為256 nm，進(jìn)樣量為10 μ L，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品約0.2 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，用50%甲醇定容，搖勻，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 取糊精0.015 g，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液，分別精密吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μ L，注入高效液相色譜儀。

Franke研究了關(guān)于對新產(chǎn)品的創(chuàng)意問題，認(rèn)為管理者可以從公司外部的類似市場尋找靈感或解決問題，擴(kuò)大范圍不需拘泥于特定目標(biāo)市場。最新2015年有學(xué)者研究了組織尋找新創(chuàng)意是公司創(chuàng)新過程的中心任務(wù)之一，具有一定經(jīng)濟(jì)潛力。所以學(xué)界有必要對創(chuàng)意問題進(jìn)行深入細(xì)致地探索。

2.2.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱取金絲桃苷對照品，置20 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，濃度720 μ g/mL，作為母液。分別精密量取母液5 份，置于容量瓶中，加甲醇稀釋100、50、20、10、5 倍，搖勻，配制成濃度依次遞增的對照品溶液。分別精密吸取上述5 種濃度的對照品溶液各10 μ L，注入高效液相色譜儀。

2.2.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 精密吸取同一金絲桃苷對照品溶液10 μ L，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法平行處理6 份，精密吸取各10 μ L，注入高效液相色譜儀。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一金絲桃苷對照品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、18、24 h 進(jìn)樣，測定金絲桃苷峰面積的RSD 值；取同一羅布麻葉配方顆粒供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h 精密吸取10 μ L，注入高效液相色譜儀，測定金絲桃苷峰面積的RSD 值。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取金絲桃苷對照品15 mg，置20 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得對照品溶液。取羅布麻葉配方顆粒約0.1 g，共6 份，精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，分別精密加入上述金絲桃苷對照品溶液1 mL，再加入適量50%甲醇，超聲處理（功率200 W，頻率58 kHz）30 min，放冷，加50%甲醇定容，搖勻，濾過，制得6 份供試品溶液，精密吸取各10 μ L，注入高效液相色譜儀。

2.2.9 中間精密度試驗(yàn) 取同一批羅布麻葉配方顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理樣品，由不同的操作人員、不同時(shí)間、在不同儀器上，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。

2.2.10 樣品測定 取3 批不同批次的羅布麻葉配方顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理樣品，按上述含量測定方法學(xué)的結(jié)果進(jìn)行金絲桃苷含量的測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 薄層鑒別結(jié)果

圖1 羅布麻葉配方顆粒薄層色譜圖

圖2 專屬性試驗(yàn)薄層色譜圖

3.1.2 樣品檢測 使用上述優(yōu)化方法對3 批羅布麻葉配方顆粒進(jìn)行薄層鑒別，3 批供試品與對照藥材、槲皮素對照品、山柰素對照品在相應(yīng)的位置均有相同顏色的熒光斑點(diǎn)出現(xiàn)（見圖3）。所以可將該薄層色譜方法列入羅布麻葉配方顆粒薄層色譜的質(zhì)量研究中。

圖3 羅布麻葉配方顆粒薄層色譜圖

3.2 含量測定結(jié)果

3.2.1 方法學(xué) 金絲桃苷是羅布麻葉配方顆粒的有效活性物質(zhì)之一，也是《中華人民共和國藥典》2020 年版中羅布麻葉飲片的含量測定所要求的物質(zhì)，為考察輔料糊精是否會干擾金絲桃苷的含量測定，從原處方中去除羅布麻葉，按制劑工藝制備得陰性制劑，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。對比供試品以及陰性樣品色譜圖，結(jié)果顯示陰性樣品色譜圖在金絲桃苷相應(yīng)的保留時(shí)間處無吸收峰，表明糊精對羅布麻葉配方顆粒含量測定無干擾，該方法專屬性較好。

線性關(guān)系試驗(yàn)中，以進(jìn)樣濃度（μ g/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為Y=28 965.538 2X+10 078.925 4，R2=0.999 9。以上表明，金絲桃苷在6.794～135.880 μ g/mL 的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

進(jìn)樣精密度試驗(yàn)中，對照品峰面積RSD 值為0.79%，表明該方法進(jìn)樣精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)中，6 份樣品含量測定結(jié)果的RSD 值為0.64%，表明該方法重現(xiàn)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)中，對照品峰面積RSD 值為0.80%，供試品峰面積RSD 為0.21%，表明對照品溶液以及供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)中，平均加樣回收率為95.44%，RSD值為1.40%，說明該方法準(zhǔn)確度較好。

中間精密度試驗(yàn)中，中間精密度RSD 值為1.40%，表明該方法中間精密度良好。

以上含量測定方法學(xué)試驗(yàn)表明，羅布麻葉配方顆粒中金絲桃苷的含量測定方法的專屬性強(qiáng)，進(jìn)樣精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等均符合規(guī)定，故此高效液相色譜條件可用于羅布麻葉配方顆粒中的金絲桃苷的含量測定。

3.2.2 樣品測定 取羅布麻葉配方顆粒（批號：1907013、1908013、1908023），按上述含量測定方法檢測，羅布麻葉配方顆粒的金絲桃苷的平均含量為7.13 mg/g，平均轉(zhuǎn)移率為64.74%。測定結(jié)果見表1。

表1 羅布麻葉配方顆粒中金絲桃苷含量

3.3 討論 薄層色譜鑒別試驗(yàn)中，前期研究對供試品點(diǎn)樣量1 μ L、3 μ L、5 μ L 進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣量過大易造成主要熒光斑點(diǎn)過大而聚集在一起，不易鑒別，點(diǎn)樣量過小易造成熒光斑點(diǎn)不清晰，而點(diǎn)樣量為3 μ L時(shí)，熒光斑點(diǎn)較為適宜，故最終選擇3 μ L 的點(diǎn)樣量。

含量測定方法學(xué)試驗(yàn)中，對超聲提取、加熱回流提取2 種不同方式進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取方式效率高且易操作，故選擇超聲提取；考察了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和相同濃度的乙醇不同提取溶劑對含量測定的影響，結(jié)合《中華人民共和國藥典》2020 年版中50%甲醇提取溶劑，仍采用50%甲醇作為提取溶劑；考察了25 mL、50 mL、70 mL 等提取溶劑量對含量測定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同提取溶劑量所測含量差異無顯著性，考慮到對照品與樣品峰面積不易過大且溶劑使用量最少的原則，選擇50 mL 作為最佳提取溶劑量；考察了15 min、30 min、45 min 3 個不同提取時(shí)間對含量測定的影響，結(jié)果顯示超聲提取30 min 時(shí)所測金絲桃苷含量最大，故選擇超聲提取30 min。

中藥配方顆粒作為中藥飲片的補(bǔ)充，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)充分考慮中藥配方顆粒與中藥飲片基本屬性的一致性[11]。本研究采用薄層色譜法對羅布麻葉配方顆粒進(jìn)行鑒別，供試品與羅布麻葉對照藥材、槲皮素對照品、山柰素對照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。該方法較《中華人民共和國藥典》2020 年版中薄層鑒別方法便于操作，且鑒別效果好，適用于生產(chǎn)實(shí)踐中。采用高效液相色譜法對金絲桃苷含量測定，方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定，并用此方法對3 批羅布麻葉配方顆粒進(jìn)行測定，金絲桃苷平均含量為7.13 mg/g，轉(zhuǎn)移率平均值為64.74%。《中華人民共和國藥典》2020 年版一部羅布麻葉飲片項(xiàng)下規(guī)定金絲桃苷的含量不得少于0.30%，按照轉(zhuǎn)移率按平均值±30%（即45.32%～84.16%）作為限度范圍，則羅布麻葉配方顆粒中含金絲桃苷的含量范圍為4.53～8.42 mg/g（每袋3 g，相當(dāng)于飲片量10 g），故暫定羅布麻葉配方顆粒的含量限度為：本品每1 g 含羅布麻葉以金絲桃苷（C21H20O12）計(jì)應(yīng)為4.53～8.42 mg/g。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)主要從薄層鑒別方法以及含量測定方法2個方面制定羅布麻葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。薄層鑒別方法中，以甲醇及水飽和正丁醇為提取溶劑，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7∶2.5∶0.1∶0.2）為展開劑，以3%三氯化鋁乙醇為顯色劑，供試品與對照藥材、槲皮素對照品、山柰素對照品在相應(yīng)的位置均有相同顏色的熒光斑點(diǎn)出現(xiàn)；含量測定方法中，色譜條件為島津20AD 高效液相色譜儀，Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.60 mm，5 μ m）色譜柱，以乙腈-0.2%磷酸（15∶85）為流動相，檢測波長為256 nm，進(jìn)樣量為10 μ L，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min。在此色譜條件下，測定的羅布麻葉配方顆粒的金絲桃苷平均含量為7.13 mg/g，暫定羅布麻葉配方顆粒的含量限度為：本品每1 g 含羅布麻葉以金絲桃苷（C21H20O12）計(jì)應(yīng)為4.53～8.42 mg/g。