吳津麗 高 晗 曾永禎 吳清雨 陳博濤 李軍山,2,3 王亞濤 董博宇 張睿智 孫福仁*

1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司,河北 石家莊 051430;2.楚雄神威施普瑞藥物研究有限公司,云南 楚雄 675000; 3.云南省中藥配方顆粒工程研究中心,云南 楚雄 675000

美洲大蠊為蜚蠊科昆蟲美洲蜚蠊Periplanetaamericana(Linnaeus) 的干燥全體。本品味咸，性寒，入心、肝、脾、腎經(jīng)。具有健脾消疳，活血通脈，利水消腫，斂瘡生肌的功效。內(nèi)用治療脅痛、癥瘕、疳積、心悸、氣喘、水腫；外用治療水火燙傷、各種創(chuàng)傷及潰瘍[1]。美洲大蠊藥材分布廣泛[2]。其富含蛋白質(zhì)、脂肪酸、核苷類、多糖、昆蟲神經(jīng)肽、異黃酮、油脂等多種化學(xué)成分[3-8]。

核苷類物質(zhì)是構(gòu)成RNA和DNA的前體物質(zhì)，也是抗腫瘤和抗病毒藥物的中間體[8]。核苷類物質(zhì)檢測(cè)是美洲大蠊藥材及加工品檢測(cè)的主要指標(biāo)，溫慧敏等[9]采用HPLC法測(cè)定美洲大蠊飲片中尿嘧啶、肌苷的含量；黃博等[10]利用HPLC法同時(shí)測(cè)定美洲大蠊藥材中尿嘧啶、肌苷、次黃嘌呤三種成分；趙從琪等[11]對(duì)美洲大蠊藥材脫脂處理并測(cè)定5種核苷類成分；馬雪偉等[12]建立HPLC法測(cè)定美洲大蠊提取物凍干粉中9種核苷類成分。上述文獻(xiàn)的研究對(duì)象集中于美洲大蠊藥材及其提取物，尚未有關(guān)于美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相關(guān)報(bào)道。本文以不同產(chǎn)地的美洲大蠊飲片為原料，制備了10批美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑。采用HPLC法同時(shí)測(cè)定尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸6種成分含量，為美洲大蠊配方顆粒質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 WATERS Symmetry Shield C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；島津高效液相色譜儀：LC-20AT泵，SPD-M20A型檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，島津LabSolutions色譜工作站；CPA225D型電子分析天平(北京賽多利斯)；JM-A5002型電子天平(余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KH-7200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申科生物技術(shù)有限公司)；LGJ-12壓蓋型真空冷凍干燥機(jī)(河南兄弟儀器設(shè)備有限公司)；榮事達(dá)養(yǎng)生藥膳壺(合肥榮事達(dá)小家電有限公司)；0.45 μm有機(jī)系/水系針頭式濾器(ASC，AMERICAN SCIENTIFIC)；

1.2 對(duì)照品 尿嘧啶(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：T14A8X33880，純度≥98%)；尿苷(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110887-202104，純度為99.6%)；鳥苷(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111977-201501，純度為93.6%)；次黃嘌呤(樂美天醫(yī)藥/德思特生物，批號(hào)：DST200305，純度≥98%)；肌苷(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140669-202007，純度為99.2%)；原兒茶酸(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110809-201906，純度為97.7%)。甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)均為HPLC級(jí)(美國ACS公司)；水為純化水；其他試劑均為分析純。

1.3 藥材來源及標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法

1.3.1 藥材 10批美洲大蠊飲片來源于云南、四川、安徽、山東4個(gè)產(chǎn)區(qū)，經(jīng)原河北省藥品檢驗(yàn)所孫寶惠老師鑒定，為蜚蠊科昆蟲美洲蜚蠊Periplanetaamericana(Linnaeus) 的干燥全體。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑 根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》中相關(guān)規(guī)定，確定美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝為：取飲片100 g，加水煎煮二次，一煎加8倍水，浸泡30 min，煮沸，保持微沸煎煮30 min，200目篩網(wǎng)過濾，立即冷卻至室溫；二煎加6倍水，煮沸，保持微沸煎煮20 min，200目篩網(wǎng)過濾，合并兩次煎液，立即冷卻至室溫，低溫真空濃縮，濃縮液冷凍干燥，密封包裝，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 WATERS Symmetry Shield C18(柱長為250 mm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5.0 μm)；以甲醇為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～9 min，0%～0%A；9～10 min，0%～2%A；10～15 min，2%～2%A；15～20 min，2%～5%A；20～35 min，5%～6%A；35～55 min，6%～10%A；55～60 min，10%～11%A)；柱溫20℃；體積流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長為254 nm。理論板數(shù)按肌苷峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸對(duì)照品2.13 mg、8.11 mg、4.20 mg、11.54 mg、6.76 mg、13.70 mg，分別置于25 mL、10 mL、25 mL、10 mL、50 mL、25 mL容量瓶中，加30%甲醇定容至刻度，制成儲(chǔ)備液。再精密量取各成分儲(chǔ)備液4 mL、1 mL、1 mL、2 mL、1 mL、2 mL，置于25 mL容量瓶中，加30%甲醇定容至刻度，制成每 1 mL含尿嘧啶13.63 μg、次黃嘌呤32.44 μg、尿苷6.72 μg、肌苷92.32μg、鳥苷5.41 μg、原兒茶酸43.84 μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑粉末，精密稱取0.5 g，置25 mL量瓶中，加入適量30%甲醇(V/V)，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用30%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取30%甲醇(V/V)適量，加入25 mL量瓶中，用30%甲醇(V/V)定容至刻度，即得陰性樣品溶液。

2.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定。結(jié)果顯示，供試品溶液在與尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸對(duì)照品的相同保留時(shí)間處有色譜峰，而陰性樣品溶液中未見色譜峰，表明其對(duì)測(cè)定結(jié)果無干擾，且樣品中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸色譜峰分離度均大于1.5，符合含量測(cè)定要求。如圖1所示。

(A)對(duì)照品溶液

(B)陰性對(duì)照

(C)美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品1.尿嘧啶；2.次黃嘌呤；3.尿苷；4.肌苷；5.鳥苷；6.原兒茶酸圖1 含量測(cè)定色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察分別精密吸取混合對(duì)照品溶液3 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜方法下測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果見表1，各成分在各自規(guī)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性范圍及回歸方程表

2.7 精密度試驗(yàn) 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定、記錄峰面積積分值。經(jīng)計(jì)算，尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸峰面積RSD值分別為0.78%、1.15%、0.85%、0.21%、0.46%、0.55%，結(jié)果說明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑S10干膏粉適量，分別稱取6份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得供試品溶液中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸含量的RSD值分別為0.91%、1.42%、0.98%、1.12%、0.77%、1.24%(n=6)，說明方法重現(xiàn)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑S10干膏粉適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸含量的RSD值分別為1.24%、1.75%、1.64%、1.57%、1.28%、0.94%(n=6)，表明供試品在溶液狀態(tài)下24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑干膏粉(S10)0.25 g，置于25 mL容量瓶中，共計(jì)6份，分別精密加入等量尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸回收率。測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表

2.11 樣品測(cè)定 取10批美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑干膏粉適量，按照“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見表3。

表3 10批美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測(cè)定結(jié)果表 (mg/g)

由表3可知，不同產(chǎn)地美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑中6種成分的含量測(cè)定值有一定差異。根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》中相關(guān)要求，以10批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中6種成分測(cè)定值均值加減30%范圍為限度，評(píng)價(jià)10批標(biāo)準(zhǔn)湯劑是否有異常值。

10批美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑中肌苷成分含量范圍為2.17～3.15 mg/g，平均含量為2.63 mg/g，SD為0.36，RSD為13.69%。肌苷含量平均值的70%～130%的范圍為1.84～3.42 mg/g，10批美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑中肌苷含量處于規(guī)定范圍內(nèi)，沒有異常值。其余5種成分含量值范圍同樣處于均值的70%～130%范圍內(nèi)。

3 討論

本文以美洲大蠊飲片，根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》中相關(guān)規(guī)定制備了10批美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑，制定含量測(cè)定方法，測(cè)定6種成分的含量。

3.1 色譜柱考察 本文以美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸6種成分為分析對(duì)象。通過色譜柱篩選，發(fā)現(xiàn)WATERS Symmetry Shield C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱適合美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑中極性成分的分析，該色譜柱能夠耐受100%水相，且在水相比例大于95%的條件下，對(duì)待分析成分仍有分離作用，因此，確定使用WATERS Symmetry Shield C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

3.2 流動(dòng)相考察 考察了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸不同種類的流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明：采用甲醇-0.1%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，6個(gè)待測(cè)成分色譜峰峰形較好，分離度高，因此，選擇甲醇-0.1%磷酸為流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.3 柱溫考察 分別設(shè)定柱溫為20 ℃、25 ℃、30 ℃測(cè)定供試品中待測(cè)成分含量，結(jié)果表明，柱溫設(shè)定20 ℃時(shí)，6種待測(cè)成分分離度達(dá)到含量測(cè)定要求，因此，確定柱溫為20 ℃。

3.4 檢測(cè)波長考察 通過PDA檢測(cè)器210～400 nm全波長掃描，發(fā)現(xiàn)波長設(shè)定254 nm時(shí)，各色譜峰數(shù)量、分離度均較好，能夠反映出美洲大蠊中水溶性成分的多樣性，所以選擇254 nm作為檢測(cè)波長。

3.5 供試品溶液制備考察 供試品溶液的提取溶劑分別考察采用水及30%、50%、70%甲醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30%甲醇為溶劑時(shí)，6種待測(cè)成分含量最高，故選擇30%甲醇為提取溶媒。

4 結(jié)語

本文以美洲大蠊飲片為原料，按照標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法制備了10批美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑。應(yīng)用HPLC液相色譜法建立美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量測(cè)定方法，可同時(shí)測(cè)定尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸6種成分。6種成分均屬于水中溶解度較高的成分，符合美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑以水為提取溶媒的制備特點(diǎn)。其中，尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷為核苷類成分。經(jīng)方法學(xué)考察，各色譜峰分離度均達(dá)到1.5以上，線性、加樣回收率等均符合含量測(cè)定要求。

美洲大蠊標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測(cè)定方法的建立可為美洲大蠊配方顆粒質(zhì)量控制提供參考。且本文在文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，重新建立含量測(cè)定方法，同時(shí)測(cè)定6種化學(xué)成分，質(zhì)量控制更加全面。