許麗梅,董丹宇,薛維婳,羅芳芳,高松,李西海,林木南

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院,福建 福州 350002; 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福建 福州 350122

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種常見且復(fù)雜的骨關(guān)節(jié)疾病,其特征是關(guān)節(jié)軟骨退化,導(dǎo)致嚴(yán)重的關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)畸形甚至殘疾[1]。據(jù)粗略統(tǒng)計,全球OA患者約有5億人。由于人口老齡化、預(yù)期壽命延長、肥胖人群增多等原因,OA已成為世界第四大致殘疾病[2]。據(jù)統(tǒng)計,在不同的高收入國家,OA醫(yī)療費(fèi)用占GDP的1.0%～2.5%。OA的病變涉及整個關(guān)節(jié),包括軟骨、軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜和關(guān)節(jié)周圍肌肉的結(jié)構(gòu)變化等[3]。其發(fā)病與年齡、性別、肥胖、負(fù)重、運(yùn)動、糖尿病、遺傳因素等相關(guān),且這些因素之間可相互作用[4]。

OA屬于中醫(yī)“痹證、痿證”范疇,以本痿標(biāo)痹為核心病機(jī),以“筋骨失養(yǎng)”所致的軟骨退變等為主要病理改變[5-6]。OA的治療應(yīng)重在調(diào)理肝腎,使筋骨得養(yǎng),同時佐以祛風(fēng)寒濕藥,蠲痹止痛。獨(dú)活寄生湯(孫思邈《備急千金要方》)是治療OA的經(jīng)典名方,具有祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎、補(bǔ)氣血之功,廣泛應(yīng)用于OA的臨床治療,且療效確切。課題組前期研究表明獨(dú)活寄生湯具有抗炎[7-8]、抗凋亡[9]等作用,其機(jī)制涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡、自噬等,以此發(fā)揮防治OA的作用。鐵死亡是新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡方式,被證實(shí)與OA密切相關(guān)[10],故本文將簡述鐵死亡的主要機(jī)制,論述鐵死亡與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬等之間的關(guān)聯(lián),探討?yīng)毣罴纳鷾ㄟ^鐵死亡相關(guān)通路防治OA的相關(guān)機(jī)制,旨在闡明從鐵死亡論治獨(dú)活寄生湯防治OA的科學(xué)依據(jù),為獨(dú)活寄生湯及中醫(yī)藥的研究提供新的方向。

1 鐵死亡的關(guān)鍵過程

鐵死亡的特征是膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的積累和質(zhì)膜多不飽和脂肪酸的消耗。在遺傳和形態(tài)學(xué)水平上,鐵死亡明顯不同于壞死、凋亡等細(xì)胞死亡模式,其在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為線粒體嵴減少和線粒體外膜破裂,導(dǎo)致線粒體功能障礙等[11-12]。鐵死亡的發(fā)生機(jī)制主要與鐵代謝、脂質(zhì)過氧化和氨基酸代謝等有關(guān),其中鐵代謝、脂質(zhì)過氧化被認(rèn)為是鐵死亡的中心介質(zhì)[13]。

胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)(cystine/glutamate antiporter system X-,system Xc-)是一種質(zhì)膜胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常存在于磷脂雙層中,system Xc-還是細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的一個組成部分[14]。胱氨酸和谷氨酸可以通過system Xc-在細(xì)胞內(nèi)外11進(jìn)行交換,胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)降解為半胱氨酸,該物質(zhì)與谷胱甘肽(glutathione,GSH)的產(chǎn)生密切相關(guān),還是維持谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)功能的關(guān)鍵因子,GSH在GPX4存在下能夠抑制活性氧[15](reactive oxygen species,ROS)。若抑制system Xc-功能減少胱氨酸吸收,影響GSH的產(chǎn)生,會導(dǎo)致GPX4活性下調(diào)并大大削弱細(xì)胞的抗氧化能力,最終導(dǎo)致氧化損傷和鐵死亡[16]。

鐵是人體的必需物質(zhì),體內(nèi)鐵的代謝異常會影響機(jī)體正常生理過程。在血液中,鐵多以Fe2+的形式存在,主要來源于紅細(xì)胞降解或腸道吸收[17]。鐵穩(wěn)態(tài)依靠轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor,TFR)分別將Fe2+、Fe3+泵至細(xì)胞外空間和細(xì)胞質(zhì)來維持。Fe3+通過TFR-轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)移到內(nèi)體,被還原為Fe2+,并釋放到不穩(wěn)定的鐵池中,鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin,FPN)則將多余的Fe2+氧化為Fe3+[18]。正是這種嚴(yán)格的鐵的體內(nèi)回收利用,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài),一旦鐵在體內(nèi)的回收利用循環(huán)失衡,導(dǎo)致游離鐵大量聚積,催化芬頓反應(yīng),氧化細(xì)胞膜中的脂質(zhì),通過脂氧化酶(lipoxygenase,LOX)催化脂質(zhì)過氧化則導(dǎo)致鐵死亡發(fā)生[19]。

細(xì)胞內(nèi)除了鐵的積累外,脂質(zhì)代謝紊亂也是鐵死亡發(fā)生的基礎(chǔ)[20]。磷脂是細(xì)胞膜中流動的主要成分,其中多不飽和脂肪酸易受脂質(zhì)過氧化的影響,并且是鐵死亡的必需物質(zhì),但必須經(jīng)過酯化、氧化才可作為鐵死亡關(guān)鍵物質(zhì)[21]。相關(guān)研究還表明,含有花生四烯酸(arachidonic acid,AA)或其延伸產(chǎn)物腎上腺素的磷脂酰乙醇胺,是細(xì)胞發(fā)生氧化并走向鐵死亡的關(guān)鍵磷脂[16]。當(dāng)鐵依賴性ROS過度升高時,會發(fā)生多余的多不飽和脂肪酸過氧化,導(dǎo)致細(xì)胞膜功能障礙并推動細(xì)胞走向鐵依賴性細(xì)胞死亡。

2 OA中鐵死亡與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬等的關(guān)系

近年來,研究證實(shí)鐵死亡是OA進(jìn)程中的重要機(jī)制。臨床觀察表明,OA患者的血清或血漿、滑液、滑膜、軟骨中均有鐵沉積和鐵相關(guān)蛋白的表達(dá)改變,并有脂質(zhì)過氧化程度增加(如MDA等),抗氧化系統(tǒng)激活下降(如GSH和GPX);在OA動物模型中觀察到鐵沉積和脂質(zhì)過氧化,在鐵過載動物模型中則存在OA病理改變,而這些改變均可以被鐵螯合劑或抗氧化劑逆轉(zhuǎn)。其機(jī)制可能在于鐵死亡通過與脂質(zhì)過氧化、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等相互作用,造成軟骨退變、滑膜炎和細(xì)胞外基質(zhì)降解,加速OA的病情進(jìn)展。鐵死亡是造成軟骨細(xì)胞死亡的重要原因,且主要與ROS聚集、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞有關(guān),并在滑膜增生及細(xì)胞外基質(zhì)降解中均發(fā)揮作用。所有證據(jù)表明,鐵死亡與OA密切相關(guān)。

2.1 OA鐵死亡與炎癥反應(yīng)炎癥是機(jī)體受到致炎因子的刺激后出現(xiàn)以防御為主的病理過程。AA是細(xì)胞膜脂的主要成分,在細(xì)胞應(yīng)激時被磷脂釋放,代謝主要途徑:LOX和環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)途徑,使AA被進(jìn)一步代謝為炎癥介質(zhì),COX和LOX活性受細(xì)胞脂質(zhì)氫過氧化物穩(wěn)態(tài)水平的直接控制[22]。鐵死亡發(fā)生時會釋放大量氧化的脂質(zhì)介質(zhì),促進(jìn)COX和LOX活性,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[23]。GPX4可以降低細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)直接抑制這些酶的活化。研究證實(shí),GPX4能通過調(diào)控核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)通路,降低LOX、ROS水平,抑制炎癥[24]。一旦GPX4缺乏,即可誘發(fā)炎癥反應(yīng),表明炎癥與鐵死亡有密切聯(lián)系。一些炎性細(xì)胞因子不僅在鐵死亡和炎癥之間的相互作用中產(chǎn)生影響,還可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞鐵死亡。

炎癥是OA進(jìn)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[25]。炎癥因子的表達(dá)與軟骨損傷呈正相關(guān),介導(dǎo)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝的炎癥因子有許多,白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)是其中一個關(guān)鍵因子[26]。研究表明分別使用IL-1β模擬細(xì)胞軟骨炎癥、枸櫞酸鐵銨模擬鐵過載,結(jié)果證明二者均能成功誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞鐵死亡,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞脂質(zhì)中ROS積累和鐵死亡相關(guān)蛋白GPX4、ACSL4、SLA7A11表達(dá)的變化,使用相關(guān)抑制劑Ferrostatin-1后則逆轉(zhuǎn)了上述蛋白的表達(dá),同時改善軟骨基質(zhì)相關(guān)因子的表達(dá)[27]。另一項(xiàng)研究結(jié)果同樣使用IL-1β干預(yù)小鼠軟骨細(xì)胞從而模擬炎癥反應(yīng),與經(jīng)典的鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞鐵死亡進(jìn)行對比,結(jié)果表明,IL-1β同樣可以增加ROS和脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的水平,并改變了軟骨細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。以上均表明了炎癥因子能夠介導(dǎo)軟骨細(xì)胞鐵死亡[28]。

2.2 OA鐵死亡與氧化應(yīng)激當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的ROS累積到一定程度,超出抗氧化系統(tǒng)的處理范疇,過量的ROS堆積導(dǎo)致氧化損傷,稱為氧化應(yīng)激。研究表明GSH的下降是氧化應(yīng)激產(chǎn)生的一個重要原因,而在鐵死亡中亦有GSH的下降。鐵作為人體必須的微量元素之一,由于其易被還原為Fe2+和氧化成Fe3+,經(jīng)常參與底物之間的電子轉(zhuǎn)移,而電子轉(zhuǎn)移是機(jī)體代謝產(chǎn)生ROS必不可少的環(huán)節(jié)[29]。研究發(fā)現(xiàn)Fe2+可以誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激[30],而氧化應(yīng)激又能影響鐵穩(wěn)態(tài)的相關(guān)基因。故鐵離子在氧化應(yīng)激和鐵死亡中均扮演關(guān)鍵角色。

紅系衍生的核因子2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2),是多種抗氧化酶的主要調(diào)節(jié)劑,不僅調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激的狀態(tài),還是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵[31],Nrf2被激活后,會從細(xì)胞質(zhì)移動到細(xì)胞核,然后通過結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件激活抗氧化酶基因。多個抑制鐵死亡的關(guān)鍵因子受Nrf2的調(diào)控,其下游多個靶基因還參與細(xì)胞中的抗氧化還原失衡。例如鐵蛋白的輕鏈和重鏈(FTL/FTH1)是關(guān)鍵的鐵儲存蛋白,以及負(fù)責(zé)鐵轉(zhuǎn)出的運(yùn)鐵蛋白均受Nrf2控制[32-33]。另外,許多與GSH合成和代謝相關(guān)的整合酶均在Nrf2的調(diào)控下,包括谷胱甘肽合成酶和system Xc-(SLC7A11)等[34]。而GPX4不僅是抑制鐵死亡的關(guān)鍵因子,也是Nrf2轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)[35]。Nrf2是抑制脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的關(guān)鍵物質(zhì),也是細(xì)胞通過控制氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制鐵死亡的途徑之一。

在一項(xiàng)關(guān)于軟骨細(xì)胞鐵死亡的研究中發(fā)現(xiàn),經(jīng)IL-1β處理軟骨細(xì)胞后Nrf2及其下游效應(yīng)因子的總蛋白水平的表達(dá)明顯提高,使用鐵死亡抑制劑后,Nrf2等的表達(dá)及其核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象進(jìn)一步增強(qiáng),表明鐵死亡限制了Nrf2抗氧化系統(tǒng)的激活。此外,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),敲除Nrf2會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞GPX4水平降低,且Nrf2抗氧化系統(tǒng)和鐵死亡在炎癥和鐵過載條件下相互調(diào)節(jié)[27]。

2.3 OA鐵死亡與自噬自噬作為細(xì)胞內(nèi)的降解系統(tǒng),維持細(xì)胞內(nèi)能量代謝的穩(wěn)定狀態(tài)。適度自噬對于細(xì)胞具有保護(hù)作用,過度自噬會促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生,甚至凋亡[36]。在細(xì)胞內(nèi),自噬同樣可以通過鐵代謝來介導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生。鐵蛋白的選擇性自噬,稱為鐵自噬,屬于自噬的一種,當(dāng)鐵蛋白轉(zhuǎn)換減少使鐵顯著減少,打破鐵穩(wěn)態(tài),即可誘發(fā)鐵死亡,而核受體輔活化子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)作為細(xì)胞自噬中溶酶體的重要轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì),將鐵蛋白遞送到自噬體以進(jìn)行溶酶體降解,促進(jìn)自噬的降解作用,并釋放游離鐵,從而促進(jìn)鐵死亡[37]。鐵代謝和鐵蛋白吞噬的調(diào)節(jié)是鐵死亡的額外潛在控制點(diǎn)。

鐵死亡又與自噬、細(xì)胞凋亡相互串?dāng)_。近年來,通過自噬抑制軟骨細(xì)胞凋亡引起了廣泛關(guān)注[38]。最新研究表明,OA軟骨中的自噬水平降低,自噬可以保護(hù)軟骨細(xì)胞免于降解[39]。酵母Atg6同系物1(Beclin-1)是自噬關(guān)鍵分子,在保護(hù)軟骨細(xì)胞和改善OA中發(fā)揮重要作用[40-41]。Beclin-1與凋亡關(guān)鍵因子Bcl-2在細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合的相對數(shù)量在一定程度上決定了細(xì)胞的自噬水平,當(dāng)二者結(jié)合時,會抑制細(xì)胞自噬,反之則會激活細(xì)胞自噬。Beclin-1還可以作用于system Xc-的SLC7A11蛋白,形成Beclin1-SLC7A11復(fù)合物,Beclin1-SLC7A11復(fù)合物可抑制SLC7A11活性,誘發(fā)細(xì)胞鐵死亡,即Beclin1會阻斷system Xc-促進(jìn)鐵死亡[42]。因此,自噬與OA鐵死亡發(fā)生密切相關(guān)。

3 獨(dú)活寄生湯抑制軟骨細(xì)胞鐵死亡的理論依據(jù)

3.1 獨(dú)活寄生湯治療OA的組方依據(jù)獨(dú)活寄生湯,由獨(dú)活、細(xì)辛、桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防風(fēng)、桂枝、川芎、當(dāng)歸、芍藥、干地黃、人參、茯苓、甘草共15味藥物所組成。方中獨(dú)活為君,長于祛風(fēng)化濕,蠲痹止痛;防風(fēng)、秦艽、細(xì)辛、肉桂,四藥皆為臣藥,防風(fēng)、秦艽祛風(fēng)除濕止痛;細(xì)辛發(fā)散少陰之邪;肉桂溫里以散陰寒,通利血脈;佐以杜仲、桑寄生、芍藥、牛膝以治本,滋補(bǔ)肝腎以強(qiáng)健筋骨;川芎、當(dāng)歸、干地黃和營養(yǎng)血;人參、茯苓、甘草益氣扶正健脾;甘草調(diào)和諸藥,兼為使藥。該方切合OA病因病機(jī)特點(diǎn),具有祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎、補(bǔ)氣血之功,標(biāo)本兼顧,是臨床治療OA的常用經(jīng)典名方之一。

3.2 獨(dú)活寄生湯通過鐵死亡防治OA的依據(jù)現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),獨(dú)活寄生湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎以黃酮類、香豆素類、甾體類及多糖類等有效化學(xué)成分為基礎(chǔ),通過調(diào)控相關(guān)炎性因子、干預(yù)氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解、影響細(xì)胞增殖和凋亡等不同途徑發(fā)揮作用,體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)[43]。既往關(guān)于獨(dú)活寄生湯的研究已證實(shí),其可通過抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬、凋亡等相關(guān)通路,發(fā)揮促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)、延緩軟骨退變的作用。

以IL-1β等為代表的炎癥介質(zhì)通過介導(dǎo)多個炎癥信號通路,參與軟骨退變,在OA發(fā)生發(fā)展過程中常作為軟骨細(xì)胞的炎癥、凋亡誘導(dǎo)劑。最新研究表明,IL-1β亦能誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞鐵死亡[27-28]。GPX4作為鐵死亡調(diào)節(jié)的關(guān)鍵參與者,不僅能夠負(fù)調(diào)控鐵死亡,還可以抑制炎癥反應(yīng),如AA的氧化及NF-κB通路的激活[44]。GPX4通過MAPK/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)鐵死亡及細(xì)胞外基質(zhì)降解,從而緩解OA的進(jìn)展[45]。GPX4在OA與鐵死亡中發(fā)揮重要作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),獨(dú)活寄生湯通過調(diào)控炎性因子IL-1β、TNF-α進(jìn)而抑制炎性反應(yīng),延緩關(guān)節(jié)軟骨退變[46];并作用于TLR4/NF-κB炎癥通路,抑制關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子NF-κB的表達(dá)發(fā)揮重要的抗炎作用[7]。

ROS在OA軟骨中含量很高,是慢性炎癥的主要原因之一[47]。研究證實(shí),獨(dú)活寄生湯可以調(diào)控氧化應(yīng)激,減輕氧自由基對軟骨細(xì)胞的破壞,加速氧自由基清除,抑制關(guān)節(jié)軟骨的退變,延緩OA的進(jìn)展。臨床研究證明口服獨(dú)活寄生湯可顯著減低OA患者關(guān)節(jié)液中NO、MDA的含量。MDA可反映體內(nèi)氧自由基對軟骨細(xì)胞的破壞程度和氧化應(yīng)激水平變化[48]。自噬中的關(guān)鍵因子Beclin-1與自噬的發(fā)生呈正相關(guān)。有學(xué)者采用Videman造模法制作兔骨關(guān)節(jié)炎模型,結(jié)果顯示模型組軟骨中自噬水平升高,軟骨組織Beclin-1、Bcl-2等表達(dá)升高,予以加味獨(dú)活寄生合劑干預(yù)后,Beclin-1、Bcl-2進(jìn)一步升高,提示加味獨(dú)活寄生合劑可促進(jìn)自噬,通過提高自噬水平從而改善關(guān)節(jié)軟骨[49]。

4 結(jié)語

隨著研究的深入及科技的發(fā)展,近年來關(guān)于OA病理機(jī)制的探索不斷深入、拓寬,軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等細(xì)胞死亡方式及相關(guān)機(jī)制的研究也不斷深化,但仍未能完全闡明OA的病理機(jī)制。鐵死亡的出現(xiàn)則為OA機(jī)制和治療研究提供了新的切入點(diǎn),并且由于鐵死亡與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬、凋亡等有著千絲萬縷的聯(lián)系,提示從鐵死亡的角度抑制炎癥、氧化應(yīng)激等,也為OA的治療提供新的靶點(diǎn)。獨(dú)活寄生湯治療OA由來已久,現(xiàn)代研究表明,獨(dú)活寄生湯可以通過抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激,調(diào)控自噬、凋亡等機(jī)制,改善軟骨退變,延緩OA進(jìn)程,這也是獨(dú)活寄生湯多成分、多靶點(diǎn)靶向治療OA的藥理機(jī)制,故探討?yīng)毣罴纳鷾种芆A鐵死亡有堅實(shí)的理論基礎(chǔ)和科學(xué)價值。既往關(guān)于獨(dú)活寄生湯的研究大多相對孤立,無法體現(xiàn)中醫(yī)治療的整體觀念,而鐵死亡的出現(xiàn)則將各種病理機(jī)制聯(lián)系到一起,不僅有利于OA機(jī)制的研究,也為獨(dú)活寄生湯防治OA的研究提供新的思路,更能體現(xiàn)中醫(yī)整體觀念,及中醫(yī)藥多靶點(diǎn)、多通路的特性。但目前關(guān)于鐵死亡及其在OA中作用的研究尚不夠全面,不同機(jī)制間的串?dāng)_更是錯綜復(fù)雜,需要進(jìn)一步完善和挖掘。