劉新玉，劉 錕，何念軍，柳梓晨，黨超琪

(1.陜西佛坪國家級自然保護區(qū)管理局，陜西 漢中 723400；2.陜西省寧西林業(yè)局，西安 710300；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；4.陜西省氣象服務(wù)中心，西安 710014)

犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus,CDV)主要傳染源為患病動物及其分泌物、排泄物和血液或被其污染的飼料、用具和飲用水等；直接或間接接觸傳染源均可被傳染，高發(fā)于冬季[1]。近年來，在陜西佛坪國家級自然保護區(qū)周圍開展的研究發(fā)現(xiàn)，患病大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)體內(nèi)分離出的CDV毒株全基因組與家犬(Canislupusfamiliaris)及貉(Nyctereutesprocyonoides)分離毒株具有高度同源性，因此，家犬?dāng)y帶的CDV極有可能在犬和大熊貓中產(chǎn)生種間傳播[1]。在對陜西佛坪國家級自然保護區(qū)和四川唐家河國家級自然保護區(qū)家犬?dāng)y帶CDV情況進行的風(fēng)險評估中，發(fā)現(xiàn)兩地家犬抗體陽性率分別為71.0%和96.4%，說明該保護區(qū)內(nèi)家犬生活的環(huán)境中存在CDV的流行史；同時通過GPS定位和地理信息技術(shù)進行研究得知，大熊貓與家犬活動范圍有所重疊，推斷野生大熊貓的生存環(huán)境已受到家犬源CDV的威脅[2]。

近幾年來，國家在保護區(qū)建設(shè)上投入了大量精力，保護區(qū)生態(tài)環(huán)境有了明顯改善，珍稀野生動物種群的數(shù)量得到顯著提高。但種群的增加也使人類與各種野生動物生存空間的重疊率大大提升，加深了野生動物與家養(yǎng)動物共患疾病的風(fēng)險。其中，以犬瘟熱為主的病毒性傳染病對野生動物的危害最大，有研究表明，CDV在自然環(huán)境內(nèi)局部性爆發(fā)，很可能導(dǎo)致某些諸如東北虎(Pantheratigrisaltaica)等小種群野生動物的滅絕[3]，這已成為嚴(yán)重制約保護區(qū)野生動物生存的一大因素。

據(jù)全國第四次大熊貓調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，截至2013年底，全國野生大熊貓種群數(shù)量比第三次調(diào)查增加了268只，達1 864只，增長了16.8%，其中分布于陜西省秦嶺山區(qū)的秦嶺亞種共計345只[4]。盡管大熊貓的數(shù)量得到了顯著增長，但大熊貓疫病時有發(fā)生。1982年，南京動物園2只圈養(yǎng)大熊貓和2只小熊貓死亡，張振興等[5]從疫病癥狀、病理變化、流行情況、免疫預(yù)防等方面推斷死因系大熊貓的CDV與李斯特菌感染所致，并稱之為熊貓瘟熱病；胡學(xué)貴等[6]報道了某圈養(yǎng)大熊貓機構(gòu)2只大熊貓感染CDV并死亡的病例。此后，各地動物園及圈養(yǎng)大熊貓機構(gòu)均有大熊貓感染犬瘟熱的病例報告[7]。1999年，李金中等[8]首次用PCR方法進行基因序列分析，確診了死亡的大熊貓系犬瘟熱病毒感染。Mainka等[9]在臥龍保護區(qū)圈養(yǎng)的大熊貓血清中檢測到CDV抗體。2014年12月，陜西省爆發(fā)大熊貓犬瘟熱疫情，導(dǎo)致5只圈養(yǎng)大熊貓染病并全部死亡，死亡率達100%。當(dāng)前我國家養(yǎng)犬?dāng)?shù)量龐大，但免疫率低，犬瘟呈現(xiàn)大流行趨勢明顯，這很可能是CDV通過家犬傳播至野生動物重要的一個途徑[3]。

佛坪縣森林覆蓋率達90.3%，常住人口約3.5萬人，由于歷史、地理等因素，佛坪保護區(qū)內(nèi)村民習(xí)慣散養(yǎng)家犬來看家護院，但是由于食物匱乏，家犬經(jīng)常成群結(jié)隊進入山區(qū)自由覓食，而且會自由來往于保護站，加之佛坪保護區(qū)內(nèi)的大熊貓在冬季時喜歡從高海拔山地遷徙至低海拔的村莊周圍，增加了家犬將CDV傳播至野生大熊貓種群的風(fēng)險。因此，本研究將對保護區(qū)內(nèi)自由活動的家犬進行CDV免疫注射，并引入未免疫犬只(哨兵犬)作為環(huán)境病毒監(jiān)測的指示動物，同時在佛坪保護區(qū)內(nèi)利用GIS技術(shù)成熟的可視化功能，及其對野生動物種群棲息地強大的空間分析能力[10]，分析免疫后家犬、哨兵犬和野生大熊貓的空間分布格局，探究此措施在冬季野生大熊貓CDV的預(yù)防與監(jiān)測中的可行性。

1 研究方法

1.1 調(diào)查地點及試驗動物

調(diào)查地點為佛坪保護區(qū)不同海拔高度的3個保護站，分別為A組(涼風(fēng)埡保護站，33.6975°N，107.9344°E)、B組(三官廟保護站，33.6453°N，107.7941°E)、C組(大古坪保護站，33.5894°N，107.7743°E)，其中涼風(fēng)埡和三官廟分別距離大古坪約16 km與8 km。

試驗動物為3個保護站的健康家犬，共34只，同時引入大古坪保護站9只未進行過CDV疫苗免疫且犬瘟熱抗體檢測陰性的犬為D組(作為哨兵犬組)。登記每只犬的年齡、性別等信息，并拍照記錄。所有犬只自由活動且可以穿梭于各保護站，年齡在10月齡至6歲不等，各類犬種均有涉及，所有犬只和5只野生大熊貓均佩戴GPS項圈，記錄其活動軌跡。

1.2 CDV疫苗注射

對3個保護站(A、B、C組)的34只家犬注射衛(wèi)佳伍商品化CDV弱毒活疫苗，疫苗注射當(dāng)日A組分布5只，B組分布6只，C組分布23只，9只哨兵犬(D組)不注射疫苗。

1.3 血清的采集與CDV抗體檢測

設(shè)置注射疫苗當(dāng)日為D0天，注射疫苗后第一天為D1天，依此類推。所有犬只均在D0與D21天分別采5 mL靜脈血，室溫放置2 h后，3 000 r·min-1離心5 min，取血清備用。使用CDV抗體(IgG)檢測試劑盒(西班牙英吉納公司)對所有血清CDV抗體進行檢測。

1.4 D21天家犬和哨兵犬的活動區(qū)域與冬季大熊貓活動區(qū)域的關(guān)系分析

每日沿預(yù)設(shè)的6條路線收集5只野生大熊貓GPS項圈數(shù)據(jù)，每隔100 m搜索3次GPS項圈信號，將5只野生大熊貓活動軌跡點通過ArcGIS 10.2軟件的核密度分析模塊的固定核空間法計算,得出野生大熊貓的冬季活動區(qū)域面積，并對D21天34只家犬與9只哨兵犬的活動點位進行空間聚集分析。

1.5 家犬與哨兵犬CDV抗原監(jiān)測

于D30、D45、D60天，分別采集34只家犬與9只哨兵犬的鼻液、唾液和淚液樣本，利用CDV膠體金試紙法檢測犬只體內(nèi)CDV抗原攜帶情況。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

將各保護站犬只D0及D21天血清檢測樣本的雙孔OD平均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，計算對應(yīng)樣本的抗體IgG濃度(N)，所得負(fù)值代表樣本中抗體濃度為零，并計算D0及D21天的抗體IgG濃度差(ΔN)。使用SPSS 25.0軟件對各保護站家犬血清檢測樣本的CDV抗體濃度進行單樣本K-S檢驗，若符合正態(tài)分布，則使用單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較3個保護站(A、B、C組)與哨兵犬組中犬只樣本的CDV抗體濃度的組間差異。

2 研究結(jié)果

2.1 CDV抗體水平

表1 標(biāo)準(zhǔn)品及空白對照孔平均OD值

表2 試驗組(34只家犬)間接ELISA檢測樣本抗體濃度

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度以及OD值(表1)計算出的標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式為y=220.59x-27.478，標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9949，根據(jù)該ELISA試劑盒以R≥0.9900為準(zhǔn)確性評價標(biāo)準(zhǔn)，表明該試驗具有準(zhǔn)確性。

將34只家犬以及哨兵犬血清樣品的OD值代入方程得出CDV抗體濃度，根據(jù)3個保護站家犬D0天CDV初始抗體水平檢測結(jié)果的中位數(shù)，以100 μg·mL-1為界限，將所有犬只的CDV初始抗體水平分為高水平和低水平。結(jié)果表明(表2)：試驗組中67.65%的家犬CDV初始抗體水平屬于低水平，其中C組中初始抗體水平呈現(xiàn)低水平的犬只占該保護站家犬的69.57%，高于其他2組。3個保護站部分犬只體內(nèi)初始抗體水平較高，由于所有犬只在本研究前均無接種疫苗史，推測可能由于曾經(jīng)暴露于CDV造成感染所導(dǎo)致。D21天3個試驗組所有家犬均達到高抗體水平。D組D0天的初始抗體水平與D21天抗體水平均為低水平(表3)。

比較3個試驗組家犬注射疫苗后血清抗體濃度差值發(fā)現(xiàn)，不同海拔高度的保護站的犬只注射疫苗后，抗體水平的提升沒有顯著地域差異(P>0.05)。比較試驗組犬只注射疫苗后與哨兵犬組的血清抗體濃度差值，試驗組犬只注射疫苗后，其中低初始抗體水平犬只的血清抗體濃度全部提升為高抗體水平，而哨兵犬組抗體水平無提升，存在顯著性差異(P<0.05)，故注射疫苗后3個保護站犬只抗體水平的提升顯著高于未注射疫苗的哨兵犬(圖1)。

表3 對照組(9只哨兵犬)間接ELISA檢測樣本抗體濃度

2.2 注射CDV疫苗后D21天家犬與哨兵犬的分布與野生大熊貓冬季活動區(qū)域的關(guān)系

固定核空間法計算得出冬季5只野生大熊貓活動區(qū)域面積為65.18 km2，此面積覆蓋了通向涼風(fēng)埡、三官廟與大古坪3個保護站的主干線路；通過核密度分析可以看出，注射疫苗D21天后家犬在大古坪保護站分布密度最高，應(yīng)作為后續(xù)疫情監(jiān)控與犬只免疫的重點區(qū)域(圖2)。D0天引入大古坪保護站的哨兵犬在D21天后有6只分布在大古坪保護站，3只移動到三官廟保護站，且均分布在野生大熊貓冬季活動區(qū)域內(nèi)。

2.3 家犬與哨兵犬CDV抗原監(jiān)測結(jié)果

D30與D45天保護區(qū)內(nèi)3個保護站所有犬只CDV膠體金試紙檢測結(jié)果均為陰性。D60天7只哨兵犬出現(xiàn)CDV膠體金試紙陽性結(jié)果，其中涼風(fēng)埡保護站與三官廟保護站各2只，大古坪保護站3只(表4)。D60天3個保護站分布的34只家犬的CDV膠體金試紙檢測結(jié)果依然為陰性。此外，不同時間點各保護站內(nèi)的家犬與哨兵犬的分布數(shù)量并不固定，再一次說明保護區(qū)內(nèi)犬只可自由穿梭于3個保護站之間，為CDV的大范圍傳播增加了風(fēng)險。

表4 家犬與哨兵犬CDV抗原監(jiān)測結(jié)果

3 討 論

本試驗選用CDV弱毒活疫苗在佛坪保護區(qū)內(nèi)單次接種后，3個保護站34只家犬血清內(nèi)CDV抗體水平均有較顯著的提升，且均可達到保護效價，產(chǎn)生較好的免疫效果。根據(jù)喬貴林等[11]的研究，接種CDV弱毒疫苗后D21天時，只有約80%的試驗犬只抗體效價超過1∶100，到D35天時，才有100%的試驗犬只抗體效價超過1∶100，與本試驗結(jié)果有所差異，推測可能是由于使用的疫苗株不同導(dǎo)致的結(jié)果。相徳忠[12]對犬只緊急免疫前后體內(nèi)抗體的變化情況進行了觀察，發(fā)現(xiàn)犬只在緊急免疫一次CDV弱毒疫苗后體內(nèi)的抗體呈現(xiàn)低—高—低的變化規(guī)律。由于本研究中試驗犬為自由活動的犬只，受抓捕等操作限制，只進行了單次免疫并只檢測了D21天的抗體水平，在后續(xù)研究中將會持續(xù)觀察D21天后的抗體水平變化規(guī)律，為再次加強免疫CDV疫苗的時間點提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時，Jin等[13]研究認(rèn)為佛坪保護區(qū)內(nèi)的野生大熊貓會在夏天遷徙至高海拔地區(qū)采食箭竹，而在冬季會再次遷徙至低海拔區(qū)采食，與本研究中冬季野生大熊貓活動區(qū)域一致，位于低海拔的村莊周圍，覆蓋在涼風(fēng)埡、三官廟和大古坪保護站沿線地帶。冬季為犬瘟熱病毒的高發(fā)季節(jié)，這無疑為3個保護站的家犬向野生大熊貓傳播CDV創(chuàng)造了機會。

本試驗D0天檢測的34只家犬中有部分犬只體內(nèi)初始血清抗體的含量較高，由于所有犬只在本研究前均無接種疫苗史，所以推測該現(xiàn)象是由于家犬曾經(jīng)暴露于CDV環(huán)境所導(dǎo)致，表明保護區(qū)可能存在CDV的流行史，但之前并沒有引起足夠的關(guān)注。然而于D60天成功監(jiān)測到7只哨兵犬體內(nèi)CDV抗原，并且這7只哨兵犬的分布范圍已遍布大古坪、三官廟和涼風(fēng)埡三個保護站，其作為無抗體保護的哨兵動物，起到了對保護區(qū)潛在CDV的監(jiān)測作用，并警示保護區(qū)工作人員應(yīng)及時加強環(huán)境消殺力度以及將患病犬只進行栓養(yǎng)治療，削弱保護區(qū)內(nèi)CDV對野生大熊貓的威脅。本試驗設(shè)置的不攜帶CDV抗體的哨兵犬，因具有自由穿梭于各保護站的特點，可以作為野生大熊貓冬季活動區(qū)域內(nèi)CDV的環(huán)境監(jiān)測指示“工具”，通過定期對其體內(nèi)CDV抗原的監(jiān)測，可作為該區(qū)域是否爆發(fā)CDV的風(fēng)險評估數(shù)據(jù)源。

4 結(jié) 論

在冬季對保護區(qū)內(nèi)家犬進行CDV疫苗接種，可以顯著提高家犬對CDV的抵抗力，而保護區(qū)內(nèi)引入的無CDV抗體的哨兵犬會受到環(huán)境病毒影響并感染CDV。這表明免疫后的家犬在大熊貓冬季活動區(qū)域內(nèi)形成CDV免疫屏障的同時，哨兵犬也對大熊貓冬季活動區(qū)域內(nèi)的CDV起到監(jiān)測作用，故在保護區(qū)內(nèi)對家犬進行CDV疫苗接種并設(shè)置哨兵犬的舉措，可以成為冬季佛坪保護區(qū)內(nèi)大熊貓CDV的有效預(yù)防與監(jiān)測措施。