章小洪，鄭連寶，陳衛(wèi)平，王偉影，賀云鵬，方芳，胡彤

（1.麗水市質量檢驗檢測研究院，浙江麗水 323000）（2.浙江工業(yè)大學生物工程學院，浙江杭州 310032）（3.德清縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江湖州 313200）（4.衢州市食品藥品檢驗研究院，浙江衢州 324000）

沙門氏菌是一種重要的食源性致病菌，該菌主要污染的食品有肉、蛋、乳等禽肉類制品和速凍食品。一旦發(fā)生沙門氏菌污染的情況，食品生產環(huán)境中殘留的沙門氏菌不易控制，存在交叉污染的安全隱患[1,2]。消費者食用了被沙門氏菌污染的食品容易引起腹瀉甚至敗血癥等食物中毒的現象。全球細菌性食物中毒事件中，沙門氏菌引起的食物中毒長期占據榜首[3]。GB 4789.4[4]中，沙門氏菌的檢驗程序繁瑣，需要4~6 d才能確認結果，當前急需一種高效、低成本的快速沙門氏菌檢測方法。因此，開發(fā)新的沙門氏菌檢測方法一直是一個熱點研究方向[5]。近年來核酸檢測技術的迅速發(fā)展帶動了食品檢測技術的進步，其中熒光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）技術被應用于食品中沙門氏菌的檢驗[6]。熒光定量環(huán)介導等溫擴增技術（Quantitative Loop-Mediated Isothermal Amplification，qLAMP）、重組聚合酶擴增等技術在沙門氏菌檢測中也取得了重要進展[7,8]。這些等溫擴增技術一方面減少了昂貴的PCR儀器使用，另外也將沙門氏菌的檢測效率大大提高了。

在食品微生物的定量檢測中，MPN（Most Probable Number，MPN）計數法是一種基于概率計算的計數方法，相比平板計數法具有更高的靈活性，且檢出限可根據加樣量進行調整，因此廣泛用于食品中大腸菌群、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等微生物的定量檢測。國家標準GB 4789.4中只對沙門氏菌規(guī)定了定性檢測方法[5]，但沙門氏菌的研究通常需要定量方法的輔助。美國分析化學家協會（AOAC）、美國環(huán)保局（EPA）等機構制定的國際標準中均運用了該方法[9,10]，可見MPN計數法對于沙門氏菌的定量研究具有重要意義。

invA基因編碼位于沙門氏菌致病島上的入侵蛋白，是侵襲宿主細胞所需的毒力因子。現有商業(yè)化檢測試劑盒均以invA基因作為靶標基因[11]，但近年來發(fā)現有12.3%的S.entericaserovar Kentucky分離菌株無法檢測出invA基因[12]，且S.entericaserovar Litchfield和Senftenberg等菌株在自然界中也存在丟失invA基因的可能[13]。ttrRSBCA轉座子是沙門氏菌無氧代謝過程中重要的基因，Malorny B等開發(fā)了基于ttrRSBCA轉座子檢測食品中沙門氏菌屬的qPCR方法[14]。近年來，Kreitlow等[15]發(fā)現ttr基因在沙門氏菌中的特異性最高，其包容性和排他性均為100%，而invA基因在沙門氏菌的特異性次之，排他性100%，包容性為97.6%，證明了ttr基因在沙門氏菌的檢測中優(yōu)于invA基因。

本研究針對ttrRSBCA基因座建立一種快速檢測食品中沙門氏菌的 qLAMP技術，并結合 mini-MPN和短時間增菌技術，即沙門氏菌的mini-MPN-qLAMP法，并與已建立的mini-MPN-qPCR法[16]比較，以確定所建立的mini-MPN-qLAMP方法的可靠性，為食品中沙門氏菌快速定量檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設備

U445超低溫保存箱，西班牙泰事達科技公司；QuantStudio5熒光定量PCR儀、LEGEND MICRO21離心機，美國賽默飛世爾科技公司；IN260生化培養(yǎng)箱，德國美墨爾特有限公司；HF-Safe-1200JE生物安全柜，上海力申科學儀器有限公司。

1.1.2 主要材料和試劑

雞胸肉購置于本地超市，慶元烏米飯購自本地市場；緩沖蛋白胨水（BPW）、XLT-4瓊脂，購于青島海博生物技術有限公司；ThermoPol緩沖液、Bst2.0 DNA聚合酶（8 U/μL）、MgSO4（100 mmol/L）、LAMP熒光染料，購于NEB北京公司；TBGreen Premix Ex Taq、ROX 參比熒光染料、dNTP Mixture（10 mmol/L），購于寶生物工程有限公司。

1.1.3 菌種和引物

引物：依據沙門氏菌屬穩(wěn)定表達的ttr RSBCA轉座子基因序列（AF282268.1），LAMP引物使用NEB LAMP Primer Design Tool（https://lamp.neb.com/）軟件設計，經實驗篩選得到引物；qPCR引物使用PrimerQuest（https://sg.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index）軟件設計，引物序列詳見表1。所有引物均使用BLAST進行比對，由上海生工生物工程有限公司合成。菌種：實驗主要測試菌株為鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028，具體特異性驗證菌株詳見表2。

表1 實驗用引物Table 1 The primers used in this experiment

1.2 實驗方法

1.2.1 菌液制備與核酸提取

菌液制備：將待測菌株接種于BPW中36 ℃培養(yǎng)16 h得到新鮮菌液。

核酸提?。翰捎弥蠓蟹ㄌ崛『怂?。吸取1 mL樣液于12 000 r/min離心5 min，小心移去上清液900 μL，加入1 mL無菌水后混勻再12 000 r/min離心5 min，小心移去上清液 900 μL，置于 100 ℃電熱板中煮沸15 min，迅速冷卻后12 000 r/min離心1 min，移取上清液直接用于qPCR和qLAMP實驗。

1.2.2 qLAMP和qPCR的反應條件

LAMP反應體系：10 X ThermoPol Buffer 2 μL，MgSO41.2 μL，dNTP Mixture 2.8 μL，50 X LAMP 熒光染料 0.2 μL，ROX 參比熒光染料 0.2 μL，10 X Primers Mix 2 μL，Bst2.0 WarmStart DNA 聚合酶0.8 μL，DNA 粗提液 5 μL，加無菌水至 20 μL。反應條件：65 ℃保溫反應40 min，以1 min作1個循環(huán)檢測熒光值，結束后測定溶解曲線（65~95 ℃，0.2 ℃/s）。

qPCR反應體系參照文獻[16]。

1.2.3 qLAMP和 qPCR的特異性實驗和純培養(yǎng)檢出限測定

特異性檢測：參照1.2.1提取表2中各菌株核酸，使用建立的qLAMP法和qPCR法對方法的特異性進行檢測。

檢出限檢測：參照 1.2.1制備鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028菌液，使用PBS進行10倍系列稀釋，得到 5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100CFU/mL稀釋液，每個濃度取1 mL分別進行核酸提取和qLAMP、qPCR實驗，確定方法檢出限，并進行溶解曲線分析。同時取適宜濃度100 μL樣液進行XLT-4平板涂布計數。

1.2.4 平板計數法定量檢測沙門氏菌

使用PBS進行10倍系列稀釋，取3個適宜稀釋梯度，分別吸取100 μL稀釋菌液，涂布于XLT-4平板，36 ℃培養(yǎng) 24 h。然后對典型菌落進行計數，并依據GB 4789.4-2016進行后續(xù)鑒定工作。

1.2.5 mini-MPN-qLAMP、mini-MPN-qPCR和mini-MPN法定量檢測沙門氏菌

使用BPW對樣液進行10倍系列稀釋，每個梯度濃度取1.2 mL至48孔板，每個濃度加3孔，置于36 ℃增菌5 h后分別從48孔板中取1 mL增菌液，提取核酸，進行qPCR和qLAMP鑒定實驗，剩余增菌液繼續(xù)置于36 ℃增菌至18 h，然后在XLT-4平板劃線，依據GB 4789.4進行鑒定。依據不同濃度陽性孔數進行MPN查表計數[17]。

1.2.6 人工污染雞胸肉混合液和冷凍烏米飯定量檢測

從當地市場購置雞胸肉和烏米飯，置于無菌均質袋中，送入實驗室，適度均質后置于冰箱中冷凍保存。參照GB 4789.4-2016進行檢驗，確認無沙門氏菌污染后，再制備成樣品混合液（即人工添加 102~108CFU/mL不同濃度的沙門氏菌稀釋液）待平板計數法、mini-MPN法、mini-MPN-qPCR法和mini-MPN-qLAMP法定量檢測。

1.2.7 數據統計與處理

以上實驗均設3個平行，使用SigmaPlot 14.0進行數據統計和Bland-Altman相關性分析。

2 結果與分析

2.1 qLAMP和qPCR檢測方法確立

實驗測定的標準曲線和溶解曲線如圖1，qPCR實驗獲得的相對標準曲線方程為y=-3.02x+36.61，r2=0.997，PCR擴增效率為 100%，檢出限為50 CFU/mL，溶解曲線分析表明溶解溫度為86.1 ℃；qLAMP實驗獲得的相對標準曲線方程為y=-2.39x+12.51，r2=0.949，PCR擴增效率為 151%，檢出限為500 CFU/mL，溶解曲線分析表明溶解溫度為 87.4 ℃。與本項目組之前基于invA基因建立的qPCR法和qLAMP法相比，本研究建立的兩種方法檢出限具有一致性[16,18]。并且qPCR法建立的標準曲線相對qLAMP法標準曲線穩(wěn)定性更好。當使用qLAMP法對低濃度的沙門氏菌進行檢測時，曲線線性易受到影響，本實驗多次測試結果表明，低濃度下LAMP的擴增不穩(wěn)定，Ct值容易出現較大波動，這與 Youn[19]等研究得到的結果一致。同時，本研究中qLAMP法檢出限與Fang等[20]建立的qLAMP法檢出限相似。

圖1 qLAMP和qPCR檢出限測定和溶解溫度分析Fig.1 The detection limit and melting temperature analysis of qLAMP and qPCR

為了驗證所建立的qLAMP和qPCR方法的特異性，本研究使用15株沙門氏菌菌株和21株非沙門氏菌菌株進行qLAMP和qPCR實驗。如表2，qLAMP和qPCR均特異性良好，15株沙門氏菌菌株均能擴增出ttr基因片段，而21株非沙門氏菌菌株均未檢出ttr基因，故實驗結果符合沙門氏菌特異性鑒定的要求。

表2 qLAMP和qPCR的特異性實驗Table 2 Specificity of qPCR and qLAMP

2.2 人工污染速凍烏米飯混合液的定量檢測

實驗使用初始濃度為5×108CFU/mL的沙門氏菌菌液進行10倍稀釋后，每個濃度分別取1 mL至25 g烏米飯樣品中均質，加入225 mL BPW稀釋后，得到終濃度為 6.30、5.30、4.30、3.30、2.30、1.30、0.30、-0.70 lg CFU/mL稀釋液，分別使用mini-MPN-qLAMP、mini-MPN-qPCR、mini-MPN計數法和平板計數法對速凍烏米飯中沙門氏菌進行定量檢測，結果如表3所示。平板計數法最低檢出濃度為 1.46 lg CFU/mL，而基于MPN的方法最低可檢出-0.44 lg MPN/mL的沙門氏菌，相較平板計數法檢出限顯著降低。從表中得出，基于MPN 的mini-MPN-qLAMP、mini-MPN-qPCR、mini-MPN法計數結果相近。其中mini-MPN-qLAMP和mini-MPN-qPCR法的結果平均差異為0.02 lg MPN/mL，最大差異為 0.28 lg MPN/mL。所有計數結果均在mini-MPN-qLAMP的95%置信區(qū)間內。實驗結果顯示mini-MPN-qLAMP法的檢出限為-0.44 lg MPN/mL。

表3 速凍烏米飯的沙門氏菌定量檢測結果Table 3 The quantitative detection of Salmonella in frozen black rice

為驗證mini-MPN-qLAMP的有效性，實驗將mini-MPN-qLAMP法和其它定量檢測方法的結果進行Bland-Altman相關性比較分析，結果見圖2。mini-MPN-qPCR、mini-MPN和平板計數法的定量結果與 mini-MPN-qLAMP結果一致性程度較高。平板計數法與mini-MPN-qLAMP的相關系數r2=0.997，而mini-MPN與mini-MPN-qLAMP的相關系數r2=0.998，具有更好的線性關系。從圖中可以看出，mini-MPN和mini-MPN- qLAMP法的95%置信區(qū)間上差異為-0.19和0.28 lg MPN/mL之間，這兩種方法在95%置信區(qū)間差異不超過0.15 lg MPN/mL，因此，與已被廣泛認可的MPN計數法相比，mini-MPN-qLAMP法為沙門氏菌定量檢測提供了一種可靠的替代方法。

圖2 在速凍烏米飯應用中mini-MPN-qLAMP法與其他方法的Bland-Altman比較分析Fig.2 Bland-Altman analysis of mini-MPN-qLAMP and other quantitative methods infrozen black rice

2.3 人工污染速凍雞胸肉混合液的定量檢測

實驗使用濃度4×108CFU/mL菌液進行10倍稀釋后，稀釋液分別取1 mL至25 g雞胸肉樣品中均質，加入225 mL BPW稀釋后得到終濃度為6.20、5.20、4.20、3.20、2.20、1.20、0.20、-0.80 lg CFU/mL稀釋液，分別使用 mini-MPN-qLAMP、mini-MPN-qPCR、mini-MPN法和平板計數法對速凍雞胸肉中沙門氏菌進行定量檢測，結果見表4所示。基于MPN的方法在檢出限方面相比平板計數法同樣更具優(yōu)勢。mini-MPN-qLAMP和mini-MPN-qPCR法的結果平均差異為0.51 lg MPN/mL，最大差異為1.03 lg MPN/mL。相較于速凍烏米飯，在速凍雞胸肉中mini-MPN-qPCR、mini-MPN-LAMP、mini-MPN和平板計數法四種方法的結果一致性程度較低，原因可能是生肉制品中存在大量的腐敗假單胞菌[21]對結果造成的干擾。另外，通過平板計數法發(fā)現雞胸肉中存在大量大腸菌群等干擾菌，這些細菌容易對常規(guī)的mini-MPN法和平板計數的結果造成干擾。在增菌過程中，大腸菌群等細菌大量繁殖，而mini-MPN法的增菌時間偏長，大腸菌群屬于優(yōu)勢菌種，導致mini-MPN法的結果存在較大偏差。這些結果與本課題組對山泉水中沙門氏菌的檢測結果相似[18]。實驗結果顯示 mini-MPN-qLAMP法的檢出限為-0.64 lg MPN/mL。

表4 雞胸肉混合液的沙門氏菌定量檢測結果Table 4 The quantitative detection of Salmonella in chicken breast rinsate

實驗將 mini-MPN-qLAMP法和其它定量檢測方法的結果進行Bland-Altman相關性分析，結果見圖3。平板計數法與mini-MPN-qLAMP的相關系數r2=0.963，mini-MPN與mini-MPN-qLAMP的相關系數r2=0.970。mini-MPN-qPCR與mini-MPN-qLAMP相關線性最好，r2=0.990。如圖所示，mini-MPN-qLAMP法和其他檢測方法的 95%置信區(qū)間上差異普遍偏大，mini-MPN-qPCR與mini-MPN-qLAMP的結果在95%置信區(qū)間上差異為-0.40和1.18 lg MPN/mL之間。相比而言，在高污染雜菌的條件下，mini-MPN-qLAMP法為沙門氏菌定量檢測提供了一種可靠的檢測方法，具有較好的定量檢測能力。

圖3 在雞胸肉檢測應用中mini-MPN-qLAMP法與其他方法的Bland-Altman分析Fig.3 Bland-Altman analysis of mini-MPN-qLAMP and other quantitative methods in chicken breast rinsate

3 討論

由于不同食品對于沙門氏菌的檢測影響較大，考慮到沙門氏菌普遍易感的兩種食品速凍面米食品和生制肉制品，本實驗選取速凍烏米飯和速凍雞胸肉進行不同污染程度食品沙門氏菌定量檢測方法的驗證。常用的定量檢測方法有平板計數法，MPN計數法。其中平板計數法由于取樣量少，存在檢出限高的問題，并且對于污染嚴重的樣品可能無法直接計數。

與平板計數法相比，MPN計數法可以顯著降低定量方法的檢出限。雖然通過概率計算可能帶入誤差[22]，但MPN值與平板計數法結果之間存在正相關[23]。根據MPN計算公式，MPN法的誤差與加樣量和發(fā)酵管數相關。發(fā)酵管數越多，MPN計數結果越準確，但這將實驗成本升高，操作變得復雜。為了控制實驗成本，減少實驗工作量，項目組使用體積小，容量大的 48孔板作為多管發(fā)酵容器，可實現每孔加樣量1.2 mL，使用3管稀釋法大大降低了傳統MPN計數對人力和物力成本需求，可實現快速簡便定量檢測，并且通過MPN統計表中的95%置信區(qū)間減少誤差。

基于 mini-MPN計數法，本實驗建立了mini-MPN-qLAMP和 mini-MPN-qPCR法。其中mini-MPN-qPCR法的具有良好的定量檢測能力[16,24]，但該方法需要昂貴的熒光定量PCR儀。qLAMP技術對設備要求更低，只需等溫條件即可進行實時熒光檢測。另外，qLAMP是基于熒光的LAMP技術，具有特異性強、靈敏度高、反應快的特點，也可使用顯色反應進行檢測。LAMP技術對于引物設計的要求較高，需要設計合理引物防止出現假陽性現象。而且LAMP顯色技術容易受到核酸提取方法的影響，因此，本研究使用qLAMP法對LAMP過程進行監(jiān)控，檢測結果更加可靠，后續(xù)可增加基于顯色反應的LAMP技術進行檢測，進一步降低儀器要求，實現現場檢測。

項目組同時設計了 mini-MPN-qLAMP、mini-MPN-qPCR、mini-MPN和平板計數法定量測定沙門氏菌，通過Bland-Altman分析對兩種方法的檢測結果的一致性進行評價。兩種檢測方法的結果差異用結果的差值平均值進行估計，平均值的變異情況則用差值的標準差來描述。當測量結果的差值服從正態(tài)分布時，95%的差值位于平均值±1.96標準差之間，則可認為這兩種方法測量結果具有較好的一致性[25]。本實驗使用兩種不同污染程度的食品對所建立的mini-MPN-qLAMP法進行定量檢測驗證，發(fā)現mini-MPN-qLAMP可以通過基因檢測消除初始雜菌對實驗的影響，項目組后續(xù)考慮檢驗結果區(qū)分死菌活菌的能力，配合PMA等檢測方法進行進一步研究[26]。

4 結論

本研究旨在建立一種準確度高、操作簡便的沙門氏菌定量等溫擴增檢測方法。研究使用ttr基因替代傳統的invA基因作為檢測靶點建立了qLAMP和qPCR定性檢測方法，并使用15株沙門氏菌菌株和21株非沙門氏菌菌株進行特異性驗證，僅沙門氏菌檢測呈陽性結果。qLAMP和 qPCR純培養(yǎng)檢出限分別為500 CFU/mL和50 CFU/mL，建立的定性檢測方法可行。研究進一步使用基于48孔板的3孔微量多管發(fā)酵法和短時間增菌技術建立了 mini-MPN-qLAMP法和mini-MPN-qPCR 法實現了定量檢測。通過Bland-Altman分析表明，經過5 h BPW增菌后所建立的 mini-MPN-qLAMP法在速凍烏米飯中檢測結果與mini-MPN-qPCR、mini-MPN計數法、平板計數法相比均具有較高的一致性，r2≥0.994，檢出限為-0.44 lg MPN/mL；而在速凍雞胸肉中該法檢測結果與mini-MPN-qPCR結果一致性最佳，r2=0.990，檢出限為-0.64 lg MPN/mL。肉制品中腐敗雜菌會影響mini-MPN計數和平板計數結果，mini-MPN-qLAMP可排除肉制品中腐敗雜菌對檢測結果的影響。

綜上所述，本實驗建立的mini-MPN-qLAMP法是一種準確度高、操作簡便的沙門氏菌定量檢測方法，無需特定PCR儀器即可進行沙門氏菌的快速檢測，可大幅度提高檢測效率，可在食品的沙門氏菌檢測領域予以推廣。