操青青，趙力超，方祥，鐘青萍，廖振林，王麗

（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642）

食源性致病菌引發(fā)的公共衛(wèi)生事件是全球食品安全領(lǐng)域最受關(guān)注的問題之一[1,2]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種廣泛存在的食源性致病菌，經(jīng)常在各種海產(chǎn)品包括蛤蜊、蝦和牡蠣等中被檢測出。食用被副溶血性弧菌污染的食品會導致惡心、頭痛、發(fā)燒和腹痛等健康問題[3-5]。據(jù)報道，在其他國家比如日本、歐美、韓國等由副溶血性弧菌危害導致的食源性疾病頻繁發(fā)生[6,7]。在中國，由副溶血性弧菌引起的食物中毒常造成集體發(fā)病[8-10]。因此，由副溶血性弧菌引起的食品安全問題已經(jīng)關(guān)系到人類健康和國際公共衛(wèi)生安全，而且已有研究表明副溶血性弧菌對抗生素產(chǎn)生了抗性[11]，因此加強對副溶血性弧菌的檢測十分必要。

目前針對副溶血性弧菌的檢測方法主要包括傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)法、分子診斷法以及免疫診斷法。然而，傳統(tǒng)培養(yǎng)法耗時長、過程繁冗、對操作者的實驗技術(shù)要求較高[12]?；诤怂釘U增的分子診斷法，包括常規(guī)PCR方法、恒溫核酸擴增法以及RPA技術(shù)。PCR技術(shù)對副溶血弧菌的檢測靈敏度較高，達到10 CFU/mL[13]，但PCR技術(shù)由于對設(shè)備要求較高，限制了其使用的靈活度。恒溫核酸擴增和RPA技術(shù)對設(shè)備要求低、靈敏度高，對副溶血性弧菌檢測的靈敏度分別達到了 3.6 CFU/mL[14]、1.0×103CFU/mL[15]，但樣品前處理仍比較繁瑣。免疫診斷法中常用的ELISA檢測技術(shù)對實驗環(huán)境以及技術(shù)人員要求高，檢測時間較長，其對副溶血性弧菌的檢測靈敏度為 5×104~1×105CFU/mL[16,17]?；谶@些方法對副溶血性弧菌檢測的特異性好，但普遍存在實驗過程復雜，實驗設(shè)備精密以及實驗操作人員專業(yè)等問題，尚不能滿足現(xiàn)場大規(guī)?？焖贆z測的要求。免疫層析技術(shù)（Immunochromatographic assay，ICA）是一類簡單、成本低的快速檢測方法[18]。ICA的原理是基于抗原抗體特異性反應。目前，已有研究報道過免疫層析技術(shù)用于副溶血性弧菌的檢測[19,20]。然而，傳統(tǒng)的免疫層析技術(shù)中常采用的熒光標記物如膠體金（AuNPs）、量子點（QDs）和熒光微球（FM）會受到來自樣本細胞組織的影響和自體熒光的干擾，導致檢測結(jié)果信號偏低[21-24]。時間分辨熒光微球（EuNPs）具備斯托克斯位移大、熒光壽命長以及優(yōu)異的光穩(wěn)定性等特征[25,26]，其在免疫層析技術(shù)中的應用引起了廣大研究者的注意。傳統(tǒng)的基于 EuNPs的時間分辨熒光免疫層析技術(shù)（ Time-Resolved Fluorescence Lateral Flow Immuneassay，TRF-LFIA）針對致病菌的檢測在測試樣本前要將標記物和待測樣本混勻，再進行加樣[27,28]。其檢測流程在快速檢測的應用中仍舊繁瑣且對原材料耗費大，不利于致病菌的快速檢測[29,30]。因此，開發(fā)一種檢測步驟簡單、適合副溶血性弧菌現(xiàn)場快速檢測的TRF-LFIA檢測方法具有實際應用價值。

本研究將 EuNPs標記技術(shù)與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，重建傳統(tǒng)TRF-LFIA檢測致病菌的試紙條結(jié)構(gòu)，并對影響該方法檢測性能的關(guān)鍵實驗參數(shù)進行優(yōu)化，最終建立了針對副溶血性弧菌檢測的TRF-LFIA檢測方法?；赥RF-LFIA所制備的檢測試紙條具有可以批量生產(chǎn)、便于運輸、操作簡單等優(yōu)點，適于在現(xiàn)場檢測中的應用。本研究建立的TRF-LFIA檢測方法能對副溶血性弧菌進行有效監(jiān)測，有望為海產(chǎn)品市場和偏遠地區(qū)副溶血性弧菌的現(xiàn)場大規(guī)模檢測提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與試劑

本研究中涉及的副溶血性弧菌ATCC 17802、創(chuàng)傷弧菌ATCC 27562、溶藻性弧菌ATCC 33787、金黃色葡萄球菌 ATCC 6538、單核細胞增生李斯特氏菌ATCC 19115、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、大腸桿菌O157:H7 ATCC 35150和阪崎腸桿菌ATCC 29544，均保藏在-80 ℃條件下的甘油管菌種庫中。

時間分辨熒光微球（EU 100 C、EU 180 C、EU 300 C），輝質(zhì)生物公司。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺活性酯（NHS）、牛血清白蛋白（BSA）、2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES），美國Sigma-Aldrich公司。3% NaCl堿性蛋白胨水（3%NaCl APW）、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（TSB）和胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），廣東環(huán)凱微生物有限公司。其他普通的試劑均為化學分析純，廣州化學試劑廠。

1.2 主要儀器和設(shè)備

生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；恒溫恒濕儲存柜，廣東執(zhí)誠生物科技有限公司；恒溫生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；干式熒光免疫分析儀，上海執(zhí)誠生物科技有限公司；酸度計，德國賽多利斯；Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀，英國馬爾文儀器公司；高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 菌株活化和菌液制備

用接種環(huán)無菌操作取適量-80 ℃甘油保存的副溶血性弧菌在m=3% NaCl TSA平板上劃線接種活化，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后挑取單個典型菌落，反復吹打于m=3% NaCl APW中，37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)18 h，然后取培養(yǎng)后的菌液1 mL于1.5 mL無菌離心管中，8 000 r/min離心5 min，除上清，用pH值為7.4的無菌PBS洗滌兩次后重懸，用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，最后通過平板計數(shù)法確定菌數(shù)，得到含一系列濃度梯度的溶血性弧菌樣本數(shù)。

1.4 TRF-LFIA檢測方法的建立

EuNPs與抗體偶聯(lián)的標記過程參考Wang等[30]的方法成功制備了微球抗體偶聯(lián)物。在此基礎(chǔ)上，用噴膜稀釋液將制備好的微球抗體偶聯(lián)物稀釋10倍，并采用三維噴點機以3 μL/cm的噴量均勻噴在結(jié)合墊上，放入烘箱14 h后取出。硝酸纖維素（NC）膜貼在PVC板載體的中間位置，使用三維噴點機以1 μL/cm的包被抗體噴量均與噴涂在 NC膜上，然后置于溫度為37 ℃的烘箱環(huán)境中干燥固定14 h。試紙條按吸水紙、NC膜、樣品墊、結(jié)合墊的順序組裝，并相互有2 mm左右的重疊，最后用切條機切成3.95 mm寬的試紙條，安裝到試劑卡蓋上（圖1a）。實驗測試時，取100 μL的樣品加入到試劑卡加樣孔中，反應15 min，使用干式免疫熒光分析儀（圖1b、1c）進行信號測試。

圖1 試紙條信號檢測的裝備Fig.1 Test strip signal detection equipment

1.5 實驗參數(shù)的優(yōu)化

選取來自不同廠家推薦的抗體組合，選用五種包被抗體蛋白濃度、采用三種不同粒徑的EuNPs（表1）以及使用六種噴膜稀釋液（表2）進行實驗參數(shù)優(yōu)化測試?？贵w篩選首先用配置好的陰性樣本（Negative，N）和陽性樣本（Positive，P）對所有的抗體組合進行初步篩選，其次用配置好的濃度梯度樣本對初步篩選后的抗體組合進行進一步測試。包被抗體濃度、EuNPs、噴膜稀釋液分別使用配置好的濃度梯度樣本進行加樣測試篩選。所有的樣品濃度測試設(shè)置三個平行實驗。

表1 三種型號EuNPs信息表Table 1 The information of three kinds of EuNPs

表2 稀釋液配方Table 2 The formula of diluent

1.6 TRF-LFIA檢測副溶血性弧菌的性能評價

按菌液制備的流程制備一系列含濃度梯度菌液的樣本，通過常規(guī)平板計數(shù)法測定樣本中添加的副溶血性弧菌濃度。采用TRF-LFIA試紙條測試同一系列濃度梯度的菌液樣本并用干式免疫熒光分析儀測得T線上的熒光強度值（HT）與C線上的熒光強度值（HC），并分析HT/HC比值的大小以進行檢測評價。該方法以樣本檢測出的熒光信號值≥2.1倍的空白樣本檢測出的信號值對應的最低菌濃度為該方法的最低檢出限。從同一批次的PVC大板和不同批次的PVC大板中抽取大板制備試紙條，并對副溶血性弧菌進行檢測。分析試紙條檢測的回收率和變異系數(shù)（CV）的大小，用于評判TRF-LFIA試紙條檢測的準確度。

1.7 TRF-LFIA對實際樣品的檢測

首先采用標準方法（GB 4789.7-2013）驗證從當?shù)爻匈徺I的蝦樣品中不存在副溶血性弧菌。同時，取25 g樣品與225 mL的無菌PBS緩沖液混合并拍打成勻漿，將不同濃度的副溶血性弧菌對所制備的樣品進行污染，通過常規(guī)平板計數(shù)法計算人工污染樣品中的副溶血性弧菌數(shù)。分別取100 μL含不同濃度的副溶血性弧菌人工污染樣品用于TRF-LFIA試紙條進行測試，并用干式免疫熒光分析儀進行熒光信號值檢測。未污染的食物樣品做陰性對照，所有實驗均平行測試三次。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 8.5繪圖軟件生成圖形。流程原理圖通過PPT繪制。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 23.0軟件進行，當p＜0.05時，不同處理組之間被認為存在顯著差異。誤差條代表標準偏差，由至少三個獨立實驗確定。

2 結(jié)果與討論

2.1 TRF-LFIA的檢測原理

本研究在傳統(tǒng)檢測致病菌的TRF-LFIA試紙條上加結(jié)合墊，使用噴膜稀釋液將微球標記的抗體固定在樣品墊上，按吸水紙、NC膜、樣品墊、結(jié)合墊的順序制備檢測試紙條，其可以批量生產(chǎn)，在現(xiàn)場檢測應用時無需將樣本與熒光探針進行混合預處理，直接加樣檢測，這極大簡化了現(xiàn)場檢測實驗操作的流程并節(jié)約了熒光原料的使用。TRF-LFIA檢測副溶血性弧菌的原理如圖2，將100 μL的樣品溶液滴加在試紙條的樣品墊上進行檢測，液體通過毛細管作用沿樣品墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水紙方向流動。當樣本中存在副溶血性弧菌時，首先目標細菌被標記抗體偶聯(lián)物捕獲，并一起沿試紙條吸水紙方向流動，在測試線T上副溶血性單克隆抗體通過抗原-抗體反應把細菌-標記抗體偶聯(lián)物截留，因此形成標記抗體偶聯(lián)物-副溶血性弧菌-副溶血性弧菌抗體復合物，過量的標記抗體偶聯(lián)物會繼續(xù)沿著試紙條吸水紙的方向流動，在質(zhì)控線C上山羊抗小鼠抗體通過抗原-抗體反應把標記抗體偶聯(lián)物截留。樣品溶液中副溶血性弧菌濃度越高，與微球抗體偶聯(lián)物結(jié)合的目標菌就越多，測試線T上的熒光信號越強，檢測出的信號值就越大。

圖2 TRF-LFIA試紙條檢測副溶血性弧菌的原理示意圖Fig.2 Schematic diagram of TRF-LFIA test strip for detection of vibrio parahaemolyticus

2.2 實驗參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 免疫層析抗體對的篩選

試紙條對不同濃度菌液的敏感性與很多因素有關(guān)，其中抗體是主要的影響因素之一。一對好的抗體不僅能增加檢測的特異性，也能提高檢測的靈敏度。廠家通常會采用傳統(tǒng)的ELISA方法對抗體性能進行評估，但是這也不能反應在所用方法中抗體應用性能的真實情況[31]，抗體的篩選還需要進行實際測試。十三種抗體組合測試結(jié)果見表3，理論上說，陽性樣本（Positive，P）與陰性樣本（Negative，N）的信號比值即信噪比（Signal-to-Noise Ratio，SNR）的大小反映抗體配對的靈敏度與測試范圍，SNR越大，試劑的靈敏度和測試范圍就越大。

根據(jù)表3測試結(jié)果，組合4、8、13實驗結(jié)果的SNR遠大于其他組合，對這三對組合進行進一步實驗測試。結(jié)果如圖3，組合13相比其它兩個組合，在幾個濃度測試間具有明顯的信號梯度，且對陰性樣本檢測結(jié)果的信號值最低，表明本底信號值低，在后續(xù)特異性測試中具有優(yōu)勢，因此組合13是優(yōu)選配對。

圖3 三組副溶血性弧菌抗體組合信號測試結(jié)果Fig.3 Three groups of vibrio parahaemolyticus antibody combination signal test results

表3 副溶血性弧菌抗體組合SNR結(jié)果Table 3 The SNR results of antibody combinations

2.2.2 抗體包被濃度的確定

每一對抗原抗體反應都有其最佳的濃度比例，選擇合適的包被抗體濃度可以提高試紙條檢測的準確性。表4數(shù)據(jù)顯示采用0.5 mg/mL和0.8 mg/mL包被濃度所制備的試紙條具有較好的檢測靈敏度、視覺檢測線。

表4 抗體包被濃度測試結(jié)果Table 4 The performance of antibody coating concentrations

由圖4信號測試結(jié)果可知，采用0.5 mg/mL的包被濃度所制備的試紙條檢測的最大信號值大于0.8 mg/mL的包被抗體濃度所制備試紙條檢測的最大信號值。這是因為NC膜承載抗體蛋白的量有限，當抗體蛋白過量后可能無法被固定在 NC膜上。因此實驗選擇0.5 mg/mL包被抗體濃度用于實驗。

圖4 五種包被濃度信號測試曲線Fig.4 Standard curves of five kinds of antibody coating concentrations

2.2.3 時間分辨熒光微球的篩選

EuNPs在標記蛋白過程中，微球的粒徑大小會影響抗體標記的效果。通過對微球標記前后的粒徑測試結(jié)果（表5）分析可知，時間分辨熒光微球在標記抗體后的粒徑會變大、分散性變差，這些都符合微球與抗體發(fā)生偶聯(lián)后的正常現(xiàn)象[32]，表明微球與抗體偶聯(lián)成功。

表5 EuNPs標記前后的參數(shù)Table 5 The parameters of EuNPs before and after coupling

通過對 2.0×103、2.0×105、2.0×107CFU/mL 這三個水平濃度樣品的檢測完成的信號檢測結(jié)果如圖5所示，基于EU 300 C型號微球所制備的試紙條對高、中、低三個濃度檢測出的信號值有明顯梯度趨勢，且其高濃度、低濃度的檢測線信號值高于其他兩種微球制備的試紙條檢測線的信號值。已有研究證明微球的粒徑與測試信號值靈敏度成正比關(guān)系，粒徑越大，單一微球包含的鑭系物質(zhì)越多，在免疫反應過程中發(fā)生的空間位阻效應更輕[32]。由于快速檢測試紙條對靈敏度要求高，因此選擇信號EU 300 C作為實驗測試微球。

圖5 三種型號EuNPs的信號測試結(jié)果Fig.5 The signal test results for three kinds of EuNPs

2.2.4 噴膜稀釋液的篩選

采用表2中的稀釋液分別對微球抗體偶聯(lián)物進行稀釋，通過對菌液濃度為0~2.0×106CFU/mL的樣本檢測進行噴膜稀釋液的篩選。

實驗結(jié)果如圖6，只有配方1處理后制備的試紙條在樣本菌液濃度為2.0×103CFU/mL時的檢測信號值＞2.1倍的空白樣本檢測出的信號值，因此使用配方1用于實驗制備出的試紙條信號檢測靈敏度為2.0×103CFU/mL。該條件下試紙條的檢測性能相比其他五種稀釋液的更好。因此選擇配方1的溶液反應體系用于實驗，制備出的試紙條具有最優(yōu)的檢測性能。

圖6 稀釋液的信號測試Fig.6 The signal test value of diluent

2.3 TRF-LFIA對副溶血性弧菌檢測的性能評價

2.3.1 TRF-LFIA檢測的靈敏度

在紫外光照下，含1.2×104CFU/mL的副溶血性弧菌的熒光強度與空白對照組明顯不同，讀卡區(qū)有兩條測試線出現(xiàn)，如圖7。因此，我們將1.2×104CFU/mL作為TRF-LFIA試紙條檢測的視覺檢測線。

圖7 試紙條靈敏度測試結(jié)果Fig.7 Sensitivity of TRF-LFIA for rapid detection of Vibrio parahaemolyticus

本實驗空白樣本檢測的信號值為0.048，根據(jù)最低檢出限的定義，陽性樣本檢測的信號值≥2.1倍的空白樣本檢測出的信號值其對應的最低菌濃度為該方法的檢出限，當菌液濃度為8.2×102CFU/mL時檢測出的信號值為0.103，稍大于2.1倍的空白樣本檢測出的信號值，所以 TRF-LFIA檢測方法的檢出限為8.2×102CFU/mL。熒光信號值隨檢測的副溶血性弧菌濃度增大而增大。如圖8所示，通過繪制相對熒光強度（Ht/Hc）與副溶血性弧菌濃度（1.8×101~1.8×107CFU/mL）之間的曲線可知，R2=0.969 8，熒光強度在1.8×103~1.8×107CFU/mL之間呈良好的線性關(guān)系。我們將所建立的方法與已報道的方法進行了比較（表6）。從表中可以看出，除了Xue等[35]報道的量子點檢測方法外，本研究方法的檢測靈敏度優(yōu)于其他的方法。但是，本研究中使用的標記材料EuNPs比量子點更環(huán)保[37]。研究證明，本研究建立的檢測方法具有靈敏度高、檢測特異性好等優(yōu)點，TRF-LFIA針對致病菌的大規(guī)?？焖贆z測具有良好的應用前景。

圖8 副溶血性弧菌檢測標準曲線Fig.8 Standard curve of Vibrio parahaemolyticus based on TRF-LFIA

表6 不同檢測方法的比較Table 6 The comparison of different methods

2.3.2 TRF-LFIA檢測的特異性

TRF-LFIA對不同菌株的特異性測試結(jié)果如表7，對所提供的8株測試菌，TRF-LFIA對副溶血性弧菌檢測結(jié)果陽性，對其它7株非目標菌株檢測結(jié)果陰性，說明所制備的TRF-LFIA試紙條對其它菌的檢測無交叉反應，特異性好。

表7 TRF-LFIA檢測方法的特異性測試Table 7 The specificity of TRF-LFIA assay

2.3.3 TRF-LFIA檢測的準確度

回收率試驗是用于評價檢測準確度的指標，理論上回收率越高，越接近 100%，檢測結(jié)果越準確。結(jié)果如表8，試紙條檢測的回收率在84.25%~105.13%之間。當菌液濃度為1.2×107CFU/mL時，同一批試紙條與不同一批試紙條的回收率分別為 104.52%、105.13%，而在菌液濃度為2.0×103CFU/mL時，同一批試紙條與不同一批試紙條的回收率分別只有86.65%、84.25%，可以看出濃度越低，偏離真實值的可能性越大。無論是用哪一批次大板制備的試紙條，其檢測結(jié)果的變異系數(shù)都小于10%，說明TRF-LFIA試紙條檢測的準確度較好且可以批量生產(chǎn)，這滿足現(xiàn)場副溶血性弧菌檢測的需求。

表8 TRF-LFIA檢測方法的準確度測試Table 8 The accuracy of TRF-LFIA assay

2.4 TRF-LFIA對實際樣品的檢測

采用TRF-LFIA和ELISA對人工污染蝦樣品進行檢測，考察TRF-LFIA對人工蝦污染樣品中副溶血性弧菌檢測的適用性。檢測結(jié)果如表9所示，TRF-LFIA對人工污染蝦樣品的檢測的回收率在 81.47%~103.52%之間，高于ELISA檢測的回收率，且采用TRF-LFIA對菌濃度為3.4×103CFU/mL的樣本檢測結(jié)果陽性，而ELISA未檢測出。在低濃度1.2×102CFU/mL時，TRF-LFIA試紙條不能進行污染樣的定量檢測，這是因為其測試濃度低于試紙條的檢出限，這符合預期實驗結(jié)果。研究證明，TRF-LFIA在測試范圍內(nèi)可以很好地用于對蝦樣品中副溶血性弧菌的檢測。

表9 TRF-LFIA和ELISA對不同濃度副溶血性弧菌污染的樣品檢測結(jié)果Table 9 The test results of TRF-LFIA and ELISA for samples contaminated with Vibrio parahaemolyticus

3 結(jié)論

本研究通過重建傳統(tǒng)TRF-LFIA的試紙條結(jié)構(gòu)及優(yōu)化實驗參數(shù)，最終建立了適于副溶血性弧菌快速檢測的TRF-LFIA檢測方法。該方法將EuNPs與標記抗體偶聯(lián)作為特異性免疫熒光探針，并使用噴膜稀釋液將特異性免疫熒光探針固定在結(jié)合墊上，這有利于提高試紙條檢測的準確度、簡化實驗操作流程、節(jié)約實驗原料的使用?；赥RF-LFIA檢測方法制備的試紙條可以批量生產(chǎn)，便于運輸，為現(xiàn)場檢測提供了便利。本研究建立的檢測方法具有操作簡單、檢測快速、特異性好以及靈敏度高等優(yōu)點，以期為食源性致病菌的現(xiàn)場大規(guī)模快速檢測提供有力的工具。