楊 碩 武陽(yáng)春 劉鑫磊 唐曉飛 薛永國(guó) 曹 旦 王 婉 劉亭萱 祁 航 欒曉燕,* 邱麗娟1,,*

大豆蛋白含量主效位點(diǎn)的精細(xì)定位

楊 碩1,3,**武陽(yáng)春4,**劉鑫磊2唐曉飛2薛永國(guó)2曹 旦2王 婉3劉亭萱3祁 航3欒曉燕2,*邱麗娟1,3,*

1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150030;2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150030;3農(nóng)作物基因資源與遺傳改良國(guó)家重大科學(xué)工程 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;4吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 吉林長(zhǎng)春 130000

蛋白質(zhì)含量是大豆重要的品質(zhì)性狀, 受多基因控制, 定位大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)位點(diǎn)并挖掘候選基因, 對(duì)定向培育高蛋白含量大豆品種具有重要意義。本研究以優(yōu)良品種黑農(nóng)88作為母本與高蛋白優(yōu)異種質(zhì)P73-6B作為父本雜交, 構(gòu)建了一個(gè)由265個(gè)單株組成的F2群體, 利用中豆芯1號(hào)對(duì)F2群體進(jìn)行基因型鑒定并構(gòu)建圖譜, 結(jié)合蛋白質(zhì)含量表型數(shù)據(jù), 采用IciMapping 4.2軟件在20號(hào)染色體上定位了一個(gè)QTL, 物理距離為2.46 Mb, 在區(qū)間附近篩選出11個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記并分析群體, 將定位區(qū)間從2.46 Mb縮小至100.8 kb。增加Gm20_28349696、Gm20_30805913、Gm20_31341532和Gm20_31483719共4個(gè)SNP位點(diǎn), 進(jìn)一步將區(qū)間縮小到95.8 kb。對(duì)區(qū)間內(nèi)包含的4個(gè)基因的9個(gè)不同組織在Phytozome v13.1和PPRD RNA-seq 2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)量分析得到了2個(gè)候選基因, 分別為和基因, 本試驗(yàn)結(jié)果為大豆蛋白質(zhì)含量基因克隆及蛋白質(zhì)調(diào)控機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ), 為大豆高蛋白分子標(biāo)記育種提供材料和技術(shù)支撐。

大豆; 蛋白質(zhì)含量; QTL定位; 候選基因

大豆種子中富含蛋白質(zhì)[1-2], 約占大豆籽粒的40%。大豆蛋白質(zhì)擁有人類所需要的9種必需氨基酸, 是最為優(yōu)良的植物蛋白之一, 可以滿足人體的營(yíng)養(yǎng)需求。大豆蛋白作為植物食用蛋白的主要來(lái)源, 在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中有著重要的作用[3]。大豆蛋白含量是重要的經(jīng)濟(jì)性狀, 我國(guó)大豆嚴(yán)重依賴進(jìn)口, 對(duì)外依存度超過(guò)80%, 基本失去了制定大豆價(jià)格的主導(dǎo)權(quán)[4]。然而, 在我國(guó)經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展的大背景下, 人們對(duì)大豆蛋白制品的需求卻不斷增加, 豆腐、豆腐干、豆?jié){、腐竹等高蛋白豆制品已經(jīng)成為人們生活中的必需品[5], 為了改變現(xiàn)狀掌握大豆市場(chǎng)的主動(dòng)權(quán), 需要提高大豆蛋白質(zhì)含量, 改良大豆品種, 培育新的高蛋白優(yōu)質(zhì)品種。因此發(fā)掘調(diào)控大豆蛋白質(zhì)含量的相關(guān)基因?qū)τ谂嘤叩鞍状蠖蛊贩N有著重要意義。

大豆蛋白質(zhì)含量在大豆雜交后不能明確分組[6]且受環(huán)境因素影響很大, 因此對(duì)大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的基因挖掘難度較大。截止到2022年1月, 在SoyBase網(wǎng)站上(https://www.soybase.org/)有241個(gè)大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL, 分布在20條染色體上。劉代鈴等[7]利用‘南豆12’和‘九月黃’作為材料構(gòu)建的RIL群體為材料在3個(gè)環(huán)境下共檢測(cè)到10個(gè)蛋白相關(guān)QTL分布在9條染色體上, 表型貢獻(xiàn)率為5.63%～9.68%。Huang等[8]利用華春2號(hào)和華耀作為親本構(gòu)建了大小為196個(gè)的F7:8-10重組自交系群體, 2種環(huán)境下在3號(hào)、6號(hào)、10號(hào)、13號(hào)、14號(hào)、18號(hào)共6條染色體上共檢測(cè)到8個(gè)大豆蛋白含量相關(guān)QTL位點(diǎn), 其中有5個(gè)QTL位點(diǎn)在2種環(huán)境下都能檢測(cè)到, 可解釋的表型變異為3.73%～17.69%。李曙光等[9]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)的方法檢測(cè)到90個(gè)大豆蛋白相關(guān)QTL, 分布在20條染色體上, 共解釋45.60%的遺傳變異。張琦等[10]利用大豆染色體片段代換系將區(qū)間精細(xì)定位至852 kb, 區(qū)間內(nèi)注釋到15個(gè)基因, 并預(yù)測(cè)可能是蛋白質(zhì)相關(guān)候選基因。雖然大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)QTL已有眾多報(bào)道, 但是沒(méi)有克隆出相關(guān)基因, 精細(xì)定位研究也較少。

本研究通過(guò)200K芯片測(cè)序構(gòu)建的圖譜在20號(hào)染色體上定位獲得大小為2.46 Mb的蛋白質(zhì)含量相關(guān)QTL, 在此基礎(chǔ)上利用F2群體的交換單株為材料將區(qū)間縮小至100.8 kb, 利用SNP和SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)和QTL IciMapping 4.2完備區(qū)間作圖法(inclusive composite interval mapping, ICIM), 最終將區(qū)間縮小至95.8 kb, 為挖掘大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)基因、解析相關(guān)基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 群體構(gòu)建和表型檢測(cè)

本試驗(yàn)材料以綜合性狀良好的品種黑農(nóng)88作為母本, 加拿大引進(jìn)的高蛋白品種P73-6B作為父本構(gòu)建F2分離群體共265株, 2019年在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所種植, 并進(jìn)行重組自交系(recombinant inbred lines, RIL)群體的構(gòu)建。使用德國(guó)公司Bruker品牌傅里葉變光近紅外光譜儀檢測(cè)大豆蛋白質(zhì)含量, 選擇成熟且大豆表皮完好的籽粒進(jìn)行蛋白質(zhì)含量檢測(cè), 使用由實(shí)驗(yàn)室先前已構(gòu)建完成的大豆蛋白含量檢測(cè)模型, OPUS軟件進(jìn)行樣品光譜數(shù)據(jù)分析, 每個(gè)樣品檢測(cè)3次重復(fù), 取平均值為蛋白質(zhì)含量。

1.2 基因組DNA提取

利用改良的CTAB法[11]提取基因組DNA, 取大豆新鮮葉片100 mg放入帶有直徑5 mm鋼珠的1.5mL離心管中并浸入液氮中, 用高通量組織研磨儀研磨30 s, 加入600mL已加入巰基乙醇并搖勻的CTAB溶液, 在65℃水浴鍋中水浴1.5 h, 取出后將其冷卻至室溫, 加入600mL酚氯仿并搖勻, 15,294′離心10 min。取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中加等體積異丙醇混勻, 放入-20℃冰箱20 min, 15,294′離心10 min, 棄上清液后加500mL 75%無(wú)水乙醇, 洗滌2次, 覆蓋無(wú)菌紙晾干殘留乙醇溶液, 加入300mL滅菌蒸餾水溶解DNA, 用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度。

1.3 芯片測(cè)序和蛋白質(zhì)含量QTL定位與驗(yàn)證

F2分離群體265個(gè)單株葉片樣品送北京康普森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行200K芯片檢測(cè), 將基因型和蛋白質(zhì)含量表型按照軟件模板格式輸入, 利用軟件QTL IciMapping 4.2完備區(qū)間作圖(inclusive composite interval mapping, ICIM)法[12], 對(duì)蛋白質(zhì)相關(guān)的QTL進(jìn)行定位, 將軟件計(jì)算的1000次排列試驗(yàn)得到的95%分位數(shù)LOD值作為95%顯著水平的LOD閾值, 在實(shí)際軟件計(jì)算時(shí)得到的LOD值高于閾值時(shí), 就認(rèn)為此時(shí)的區(qū)間內(nèi)存在一個(gè)QTL, 得到一個(gè)可解釋貢獻(xiàn)率為19.31%, 區(qū)間長(zhǎng)度為2.46 Mb的QTL, 進(jìn)一步縮短其區(qū)間長(zhǎng)度, 得到區(qū)間長(zhǎng)度為100.8 kb的QTL, 在此基礎(chǔ)上通過(guò)7個(gè)標(biāo)記結(jié)合F2群體大豆蛋白表型數(shù)據(jù)再次定位到該QTL, 并將其縮小至95.8 kb。

1.4 SSR標(biāo)記篩選

在大豆數(shù)據(jù)庫(kù)SoyBase (https://www.soybase. org/)網(wǎng)站上, 選擇20號(hào)染色體上初定位區(qū)間內(nèi)及附近的44對(duì)SSR標(biāo)記, 根據(jù)引物序列信息, 北京擎科生物技術(shù)有限公司合成上述標(biāo)記引物。利用母本黑農(nóng)88和父本P73-6B進(jìn)行引物多態(tài)性篩選, 得到11對(duì)親本間差異SSR引物(表1)。使用的PCR反應(yīng)體系為20mL, 體系包含2.0mL (20 ng μL–1) DNA、Easy酶2.0mL、10× Easybuffer 2.0mL、dNTPs 2.0mL、引物2.0mL (2.0mmol L–1)、無(wú)菌水10.0mL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 34個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min, 4℃條件保存。用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)SSR標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物。利用這11對(duì)標(biāo)記對(duì)黑農(nóng)88×P73-6B F2分離群體265個(gè)單株進(jìn)行基因型鑒定, 其中與母本黑農(nóng)88條帶相同的記為A, 與父本P73-6B條帶相同記為B, 對(duì)既有與父本相同也有與母本相同的條帶記為雜合H, 條帶缺失時(shí)記為-。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Word Processing System計(jì)算群體蛋白質(zhì)含量的最大值、最小值、平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、峰度、偏度、變異系數(shù)和表達(dá)量差異圖的繪制, SPSS19.0繪制蛋白質(zhì)含量分布圖并進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn), R語(yǔ)言對(duì)定位區(qū)間兩端標(biāo)記SNP30805914、BARCSOYSSR_ 20_0649結(jié)合蛋白質(zhì)含量表型數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。

1.6 候選基因預(yù)測(cè)

在SoyBase (https://www.soybase.org/)網(wǎng)站上查詢定位區(qū)間內(nèi)基因的功能注釋, 利用Phytozome網(wǎng)站在線查找并獲得區(qū)間內(nèi)基因的表達(dá)模式, 利用R語(yǔ)言軟件生成基因表達(dá)熱圖, 利用PRRD網(wǎng)站查找并獲得區(qū)間內(nèi)基因的表達(dá)模式, 利用Word Processing System生成表達(dá)量圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑農(nóng)88和P73-6B及其群體蛋白質(zhì)表型分析

低蛋白母本黑農(nóng)88蛋白質(zhì)含量是43.67%, 高蛋白父本P73-6B蛋白質(zhì)含量是49.64%, 雙親蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)極顯著差異(圖1), 適合作為蛋白質(zhì)含量QTL定位群體構(gòu)建的親本。由雙親雜交配制繁育獲得的265個(gè)F2群體后代蛋白質(zhì)含量分離較大, 最低為39.22%, 最高為53.25%, 平均值為47.01%, 變異范圍在39.22%～53.25%之間, 變異系數(shù)為8.48% (表2)。265個(gè)F2蛋白質(zhì)表型存在明顯的超親分離且呈現(xiàn)出連續(xù)的變異, 峰度為2.94>0 (峰度定義為四階中心矩除以方差的平方減去3)、偏度0.26>0, 整體峰圖呈現(xiàn)右偏尖峰分布, 與完全正態(tài)分布相比峰圖更陡峭且右側(cè)長(zhǎng)尾, 說(shuō)明在數(shù)據(jù)分布中, 含量中等和中等偏高蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)相對(duì)較多(圖1), 為大豆蛋白質(zhì)QTL的定位提供了基礎(chǔ)。

表1 精細(xì)定位所用SSR標(biāo)記

表2 親本及F2群體蛋白質(zhì)含量統(tǒng)計(jì)分析

圖1 親本及F2群體蛋白質(zhì)含量頻率分布直方圖

垂直虛線表示兩親本表型的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。曲線代表密度圖。***,<0.001。

Mean value and standard deviation of parental phenotypes are indicated by vertical dotted lines. Curve represents density plot. ***,< 0.001.

2.2 基于200K芯片的蛋白質(zhì)含量相關(guān)QTL定位

將F2群體265個(gè)單株的基因型結(jié)合蛋白質(zhì)含量表型數(shù)據(jù), 利用軟件QTL IciMapping 4.2完備區(qū)間作圖法對(duì)蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL進(jìn)行定位, 對(duì)20號(hào)染色體進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建, 共有1350個(gè)SNP標(biāo)記輸入軟件, 篩選刪除不連鎖標(biāo)記和冗余標(biāo)記, 最終使用266個(gè)SNP標(biāo)記作圖, 圖距152.97 cM, 標(biāo)記間平均距離0.57 cM, 在20號(hào)染色體上得到1個(gè)QTL位點(diǎn)(圖2), 位于Gm20_28349696和Gm20_30805913之間, LOD值為12.23, 閾值LOD值為2.5, 負(fù)的加性效應(yīng)說(shuō)明高蛋白等位基因來(lái)自父本P73-6B, QTL定位區(qū)間大小約2.46 Mb, 可解釋表型遺傳變異19.31% (表3), 包含42個(gè)基因。

2.3 蛋白質(zhì)含量QTL精細(xì)定位

在定位區(qū)間內(nèi)及附近選擇SSR標(biāo)記, 共選擇BARCSOYSSR_20_0606至BARCSOYSSR_20_0649之間的44個(gè)SSR標(biāo)記, 篩選出19個(gè)親本間具有多態(tài)性SSR標(biāo)記, 選擇其中11個(gè)條帶清晰的SSR標(biāo)記分析群體(表1)。將QTL區(qū)間定位至BARCSOYSSR_ 20_0647至BARCSOYSSR_20_0649之間(圖3), 進(jìn)一步縮短其區(qū)間長(zhǎng)度, 得到區(qū)間長(zhǎng)度為100.8 kb的QTL, 命名為, 區(qū)間內(nèi)含有5個(gè)基因。為了進(jìn)一步縮小定位區(qū)間, 利用200K芯片測(cè)序數(shù)據(jù), 篩選在定位區(qū)間內(nèi)及附近的親本間存在多態(tài)性差異的SNP標(biāo)記位點(diǎn)并獲取該位點(diǎn)F2群體基因型, 共篩選得到4個(gè)SNP標(biāo)記位點(diǎn), 分別為Gm20_28349696、Gm20_30805913、Gm20_31341532和Gm20_31483719。挑選區(qū)間內(nèi)3個(gè)已完成F2群體基因型分析鑒定的SSR標(biāo)記BARCSOYSSR_20_0636、BARCSOYSSR_20_0647, 結(jié)合這7個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的F2群體基因型和大豆蛋白質(zhì)含量數(shù)據(jù), 對(duì)QTL進(jìn)行精細(xì)定位, 在100.8 kb大小的區(qū)間基礎(chǔ)上(圖3), 進(jìn)一步將定位區(qū)間縮小至Gm20_30805913–BARCSOYSSR_20_0649之間(圖4),大小為95.8 kb (圖4), 區(qū)間內(nèi)包含4個(gè)基因, 表型貢率由19.31%提升至21.44% (表4)。

圖2 用黑農(nóng)88和P73-6B構(gòu)成的F2群體在大豆20號(hào)染色體定位蛋白質(zhì)QTL

表3 在黑農(nóng)88×P73-6B F2群體鑒定到的QTL

圖3 蛋白含量QTL qPRO-20-1的精細(xì)定位

A: 利用HN88×P73-6B F2200K芯片測(cè)序數(shù)據(jù)遺傳圖譜構(gòu)建定位的QTL位點(diǎn)在SNP2839696～SNP30805913之間。B: 利用BARCSOYSSR_20_0608、BARCSOYSSR_20_0613、BARCSOYSSR_20_0616、BARCSOYSSR_20_0618、BARCSOYSSR_20_0619、BARCSOYSSR_20_0629、BARCSOYSSR_20_0636、BARCSOYSSR_20_0638、BARCSOYSSR_20_0644、BARCSOYSSR_20_0647、BARCSOYSSR_20_0649共11個(gè)標(biāo)記鑒定5個(gè)交換單株(297、272、68、72和209)的基因型, 并驗(yàn)證并初定位。C: 利用芯片數(shù)據(jù)SNP位點(diǎn)標(biāo)記28349696、30805913、31343532、31483719和3個(gè)SSR標(biāo)記BARCSOYSSR_20_0636、BARCSOYSSR_20_0647、BARCSOYSSR_20_0649將區(qū)間精細(xì)定位至標(biāo)記30805913～BARCSOYSSR_20_0649之間。D: 獲得4個(gè)候選基因、、、。

A: construct a genetic map to locate the QTL sitebetween SNP 2839696–SNP 30805913 using Heinong 88×P73-6B F2200K chip sequencing data. B: the genotypes of five exchange monocultures (297, 272, 68, 72, and 209) were identified using a total of 11 markers BARCSOYSSR_20_0608, BARCSOYSSR_20_0613, BARCSOYSSR_20_0616, BARCSOYSSR_20_0618, BARCSOYSSR_20_0619, BARCSOYSSR_20_0629, BARCSOYSSR_20_0636, BARCSOYSSR_20_0638, BARCSOYSSR_20_0644, BARCSOYSSR_20_0647, BARCSOYSSR_20_0649; the genotypes were verified and primed. C: the interval was finely localized to the SNP marker 30805913–BARCSOYSSR_20_0636, BARCSOYSSR_20_0649 using the chip data bits SNP locus markers 28349696, 30805913, 31343532, 31483719, and the three SSR markers (BARCSOYSSR_20_0636, BARCSOYSSR_20_0647, BARCSOYSSR_20_0649). D: four candidate genes of,,, andwere obtained.

圖4 利用7個(gè)分子標(biāo)記定位黑農(nóng)88×P73-6B大豆F2群體20號(hào)染色體的蛋白質(zhì)QTL

表4 在黑農(nóng)88×P73-6B F2群體驗(yàn)證得到的QTL

2.4 qPRO-20-1位點(diǎn)兩端標(biāo)記蛋白質(zhì)表型和基因型差異顯著性分析

對(duì)F2群體位點(diǎn)兩側(cè)的2個(gè)基因型標(biāo)記與蛋白質(zhì)表型(圖5)進(jìn)行分析, Gm20_30805913標(biāo)記位點(diǎn)具有黑農(nóng)88 (A)基因型的有62個(gè), 蛋白質(zhì)表型含量范圍為40.01%～52.36%, 平均值為44.38%。Gm20_ 30805913標(biāo)記具有P73-6B (B)基因型的有67個(gè), 蛋白質(zhì)表型含量范圍為43.90%～52.90%之間, 平均值為47.95%。BARCSOYSSR_20_0649標(biāo)記具有黑農(nóng)88 (A)基因型的有60個(gè), 蛋白質(zhì)表型含量范圍在40.02%～ 52.35%, 平均值為44.33%。BARCSOYSSR_20_0649標(biāo)記位點(diǎn)具有P73-6B (B)基因型的有68個(gè), 蛋白質(zhì)表型含量范圍在43.67%～52.90%之間, 平均值為47.89%。2個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)不同等位基因的蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)極顯著差異, 這也說(shuō)明這個(gè)標(biāo)記與蛋白質(zhì)含量緊密相關(guān)。

2.5 候選基因預(yù)測(cè)分析

根據(jù)區(qū)間定位結(jié)果在SoyBase (https://www. soybase.org/)網(wǎng)站上搜查, 在區(qū)間內(nèi)有4個(gè)基因(表5), 在Phytozome v13.1網(wǎng)站查找4個(gè)基因在9個(gè)不同時(shí)期及部位的表達(dá)模式, 利用R語(yǔ)言軟件生成對(duì)基因在不同組織中的表達(dá)量熱圖(圖6)。和基因在大豆莖、花、根毛、葉片、根瘤、莢、種子、頂端分生組織以及根中均有表達(dá)。基因在大豆9個(gè)不同的時(shí)期及部位均無(wú)表達(dá)。基因只在大豆種子中有表達(dá)。大豆蛋白質(zhì)是大豆籽粒中重要的組成成分, 蛋白質(zhì)來(lái)源大豆籽粒,、和基因均在大豆種子中有表達(dá), 但表達(dá)以基因最高為16.86, 以基因最低為1.60, 表達(dá)量大小為>>, 在PPRD RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://ipf.sustech.edu.cn/pub/plantrna/), 查找區(qū)間內(nèi)4個(gè)基因在9個(gè)不同組織的表達(dá)量(圖7), 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn), 在和基因中9個(gè)時(shí)期的表達(dá)量都較高,基因在這9個(gè)組織的表達(dá)量都極低,基因在9個(gè)不同的時(shí)期及部位幾乎無(wú)表達(dá)。在大豆籽粒中基因表達(dá)量19.21>基因15.55, 結(jié)合2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果分析, 初步確定基因和基因可能與大豆蛋白質(zhì)含量有關(guān)。

圖5 F2群體中qPRO-20-1位點(diǎn)兩側(cè)標(biāo)記Gm20_30805913與BARCSOYSSR_20_0649的基因型與蛋白質(zhì)表型相關(guān)性分析

A: Gm20_30805913的基因型與表型相關(guān)性分析; B: BARCSOYSSR_20_0649的基因型與表型相關(guān)性分析。圖中橫坐標(biāo)為基因型, 低蛋白為a, 高蛋白為b, 縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)含量。***:< 0.001。

A: genotype and phenotype correlation of Gm20_30805913; B: genotype and phenotype correlation of BARCSOYSSR_20_0649. The abscissa is the genotype, the high protein is denoted as b, the low protein is denoted as a, and the vertical ordinate is protein content. ***:< 0.001.

表5 定位區(qū)間內(nèi)候選基因注釋

圖6 用Phytozome v13.1獲得4個(gè)基因的表達(dá)譜

圖7 用PPRD數(shù)據(jù)庫(kù)獲得4個(gè)基因在大豆9個(gè)不同組織的表達(dá)量

3 討論

3.1 大豆20號(hào)染色體蛋白質(zhì)含量QTL定位

大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)QTL報(bào)道較多, 到2021年1月7號(hào)為止, 在SoyBase (https://www.soybase. org/)網(wǎng)站上已公布了241個(gè)QTL, 分布在20條染色體, 其中20號(hào)染色體定位蛋白質(zhì)含量位點(diǎn)的數(shù)量最多, 有24個(gè), 9個(gè)QTL的定位區(qū)間包含本研究得到的位點(diǎn)。分別是Seed protein 1-1 (25,275,083～34,302,228) 9.03 Mb、Seed protein 1-2 (24,177,772～34,302,228) 10.12 Mb、Seed protein 15-1 (27,664,504～33,590,931) 5.93 Mb、Seed protein 30-1(2,047,603～35,362,576) 33.31 Mb、Seed protein 31-1 (8,169,252～33,590,931) 25.42 Mb、Seed protein 34-11 (25,498,552～35,362,576) 9.86 Mb、Seed protein 36-26 (2,615,587～41,195,418) 38.58 Mb、Seed protein 37-8 (3,725,849～34,052,339) 30.33 Mb、Seed protein 39-4 (25,275,083～34,052,339) 9.78 Mb。在這9個(gè)QTL定位區(qū)間內(nèi)最大的為Mao等[13]定位的38.58 Mb, 最小的為Chung等[14]定位的5.93 Mb。魏荷等[15]通過(guò)查詢整理蛋白質(zhì)含量相關(guān)QTL并對(duì)其進(jìn)行連鎖遺傳繪圖發(fā)現(xiàn), 在20號(hào)染色體278,844,457～31,972,955 bp區(qū)段的蛋白質(zhì)QTL位點(diǎn)檢測(cè)頻率最高, 本試驗(yàn)定位得到的QTL在大豆蛋白質(zhì)QTL定位數(shù)量最多的20號(hào)染色體, 所在的區(qū)段又是在定位熱點(diǎn)區(qū)段, 也間接證明了本試驗(yàn)定位結(jié)果的正確性以及具有的重要研究?jī)r(jià)值。

3.2 大豆蛋白質(zhì)含量QTL精細(xì)定位

大豆蛋白質(zhì)含量是典型的數(shù)量性狀, 受到多基因控制[16], 盡管前人對(duì)大豆蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL進(jìn)行大量研究, 但關(guān)于蛋白質(zhì)含量相關(guān)QTL的精細(xì)定位研究較少。目前蛋白質(zhì)含量QTL精細(xì)定位主要有2種方法, 一種是利用構(gòu)建傳統(tǒng)遺傳群體的方式, 常見(jiàn)重組自交系(RIL)群體、染色體片段置換系(chromosome segment substitution lines, CSSL)群體等永久性群體的方式進(jìn)行QTL精細(xì)定位, 如武陽(yáng)春等[17]通過(guò)構(gòu)建RIL群體結(jié)合BSA構(gòu)建混池的方式在19號(hào)染色體定位到大小為384 kb的新位點(diǎn), 并有2個(gè)候選基因; Yang等[18]通過(guò)染色體片段置換群體, 將QTL精細(xì)定位在329 kb區(qū)間內(nèi), 區(qū)間內(nèi)包含42個(gè)基因。另一種是利用自然群體全基因組關(guān)聯(lián)分析的方式, 如Zhang等[19]利用GWAS分析在15號(hào)染色體基因間區(qū)得到一個(gè)38.7 kb的區(qū)間。而本研究利用200K芯片獲得基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行圖譜構(gòu)建, 在20號(hào)染色體上得到的2.46 Mb的初定位區(qū)間并結(jié)合F2群體和SSR分子標(biāo)記將區(qū)間縮小至95.8 kb, 可解釋21.44%的遺傳變異, 該QTL是目前在20號(hào)染色體定位區(qū)間最小貢獻(xiàn)率較大的主效QTL, 位點(diǎn)基因也與已報(bào)到的不同, 研究結(jié)果為大豆蛋白質(zhì)相關(guān)主效基因的挖掘和克隆奠定了基礎(chǔ)。

3.3 大豆蛋白質(zhì)含量候選基因

大豆蛋白質(zhì)的合成代謝是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程, 有2條主要的代謝途徑, 一條是氮素和碳素的合成, 是調(diào)控氨基酸合成的代謝途徑[20], 在該途徑中, 大豆吸收空氣中的氮?dú)獠⑼ㄟ^(guò)谷氨酰胺合成酶等調(diào)控模式將其轉(zhuǎn)化為氨基, 并為氨基酸合成提供原料[21], 而氨基酸又是蛋白質(zhì)合成的基本單位。氨基酸的種類多樣, 多數(shù)都有自己的合成途徑, 在合成通路中受到眾多酶和基因的影響, 具體的反應(yīng)發(fā)起位點(diǎn), 在組織細(xì)胞中如何發(fā)生變化, 目前尚無(wú)定論[22]。另一條是儲(chǔ)藏蛋白基因的合成轉(zhuǎn)錄、翻譯和加工[23]。大豆儲(chǔ)藏蛋白是大豆種子總蛋白中的主要組成部分,主要分為4種包括2S、7S、11S、15S蛋白[24], 其中大豆種子7S和11S又是種子儲(chǔ)藏蛋白的主要成分, 約為70%。它們的合成方式略有不同, 主要途徑是經(jīng)過(guò)顆粒型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成前體、高爾基體分選、囊泡運(yùn)輸、液泡中貯存通過(guò)酶加工等方式轉(zhuǎn)化合成為成熟貯藏蛋白質(zhì)[25-28]。

因?yàn)榇蠖沟鞍踪|(zhì)含量與大豆種子時(shí)期的相關(guān)基因表達(dá)量有關(guān)聯(lián), 所以對(duì)本研究得到的4個(gè)基因不同組織進(jìn)行表達(dá)量分析, 利用Phytozome v13.1網(wǎng)站和R語(yǔ)言軟件獲得表達(dá)量并生成熱圖, 結(jié)果表明、和這3個(gè)基因在大豆的種子發(fā)育時(shí)期表達(dá), 可能與蛋白質(zhì)含量有關(guān)。

基因注釋表明(表4),是PantherFam黃嘌呤尿嘧啶/維生素C滲透酶家族成員之一, 又屬于NCS2或NAT家族, 已預(yù)測(cè)有2000個(gè)成員以上, 在主要的生物類群中均有分布[29], 其中僅有較少成員在功能上被鑒定, 如在大腸桿菌中的黃嘌呤通透酶XanQ經(jīng)常被用作為極性殘基的誘變底物, 尿嘧啶同源物的研究[30], 尿酸/黃嘌呤通透UAPA的缺乏轉(zhuǎn)運(yùn)不影響其對(duì)黃嘌呤的親和力但可降低尿酸并可導(dǎo)致與其他嘌呤相錯(cuò)誤結(jié)合幾率增加[31]。而在擬南芥的同源物中進(jìn)行的鑒定, 由于效能低等原因, 功能暫時(shí)未知[32]。尚無(wú)功能預(yù)測(cè)相關(guān)報(bào)道。是帶有RNA結(jié)構(gòu)域的NTF2超家族蛋白, NTF2超家族蛋白是一組有共同折疊的通用蛋白結(jié)構(gòu)域, 沒(méi)有共同的基序, 這些結(jié)構(gòu)域在不同蛋白質(zhì)中具有不同的功能[33]。據(jù)報(bào)道[34]在擬南芥中NTF2蛋白參與物質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的運(yùn)輸過(guò)程, 通過(guò)識(shí)別核定位信號(hào)(NLS)來(lái)輸入核蛋白, 也在紡錘體形成、核膜組件等起到作用[35-36], 在小麥中通過(guò)對(duì)NTF2沉默降低了小麥條銹病的抗性[37]。其同源基因在藍(lán)藻的氮素和光合作用相關(guān)途徑中被預(yù)測(cè)為microRNAs (miRNA)的靶基因之一[38], 而大豆蛋白質(zhì)的基本組成單位氨基酸, 其氨基的來(lái)源又是與氮素有關(guān), 該基因是否與是大豆蛋白含量相關(guān)候選基因還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4 大豆高蛋白種質(zhì)篩選

大豆蛋白質(zhì)含豐富的營(yíng)養(yǎng), 價(jià)值頗高, 高蛋白大豆種質(zhì)篩選在育種中具有重要的意義[39]。我國(guó)大豆主要是食用, 高蛋白育種是重要的方向。本研究所用母本黑農(nóng)88和父本P73-6B蛋白質(zhì)含量均大于國(guó)家(省)品種審定所劃定的高蛋白(43%)的界限, 且差異大于6%, 母本F2群體蛋白質(zhì)含量均值高達(dá)47.01%, 變異范圍廣達(dá)14.03%, 超親分離現(xiàn)象明顯, 高于43%的優(yōu)異高蛋白含量個(gè)體有111個(gè), 約占42%。這個(gè)群體不僅僅是一個(gè)定位群體, 更是一個(gè)難得的高蛋白育種群體。相比于其他構(gòu)建蛋白質(zhì)群體定位的研究, 如閆海波等[40]所構(gòu)建的群體雙親蛋白質(zhì)含量分別為40.20%和42.20%, 變異范圍為2.2%, 后代群體蛋白質(zhì)含量平均值為40.7%, 變異范圍9.9%。Huang等[41]等利用蛋白質(zhì)含量41.5%的Huachun 2和42.9% Wayao構(gòu)建了分離群體, 其后代群體在4個(gè)環(huán)境下蛋白質(zhì)含量平均值最低為42.9%, 最高為45.6%, 平均為43.7%, 平均變異范圍為7.8%。Kaleri等[42]利用Heihe 36 (蛋白質(zhì)含量39.80%)和Dongnong L13 (蛋白質(zhì)含量45.50%)、Henong 60 (蛋白質(zhì)含量38.47%)和Dongnong L13 (蛋白質(zhì)含量45.50%), 分別組成2個(gè)重組自交系, 后代群體的平均蛋白質(zhì)含量為42.78%, 蛋白質(zhì)含量最小值為37.67%, 最大值為45.47%, 變異范圍為7.80%。本試驗(yàn)所構(gòu)建的群體相比上述這3個(gè)群體, 雙親蛋白質(zhì)含量更高且親本間蛋白質(zhì)含量差距也較大, 在后代群體中蛋白質(zhì)含量的平均值更高、變異范圍更廣, 在總體的蛋白質(zhì)含量和分布上在高蛋白育種上更有優(yōu)勢(shì)。該群體不僅包含本研究定位的QTL外, 還包括其他QTL, 利用分子標(biāo)記聚合多個(gè)高蛋白QTL, 有助于培育高產(chǎn)高蛋白新種質(zhì)和新品種。

4 結(jié)論

利用黑農(nóng)88×P73-6B構(gòu)建的265個(gè)F2分離群體進(jìn)行200K芯片分析, 獲得基因型數(shù)據(jù)并構(gòu)建遺傳圖譜, 在20號(hào)染色體定位到一個(gè)大小為2.46 Mb的大豆蛋白質(zhì)相關(guān)的QTL, 通過(guò)定位區(qū)間引物加密, 進(jìn)一步縮短區(qū)間長(zhǎng)度, 得到區(qū)間長(zhǎng)度為100.8 kb的QTL, 在此基礎(chǔ)上通過(guò)7個(gè)標(biāo)記結(jié)合F2群體大豆蛋白表型數(shù)據(jù)再次定位到該QTL, 最終將QTL縮小至Gm20_30805913–BARCSOYSSR_20_0649之間, 大小為95.8 kb, 貢獻(xiàn)率為21.44%。對(duì)區(qū)間內(nèi)包含的4個(gè)基因的9個(gè)不同組織, 在Phytozome v13.1和PPRD RNA-seq兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)量分析, 得到了2個(gè)候選基因, 分別為、。

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Fine mapping ofrelated to high protein content in soybean

YANG Shuo1,3,**, WU Yang-Chun4,**, LIU Xin-Lei2, TANG Xiao-Fei2, XUE Yong-Guo2, CAO Dan2, WANG Wan3, LIU Ting-Xuan3, QI Hang3, LUAN Xiao-Yan2,*, and QIU Li-Juan1,3,*

1College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China;2Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150030, Heilongjiang, China;3College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China;3National Key Facility for Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Crop Germplasm Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;4College of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130000, Jinlin, China

Protein content is a crucial quality trait of soybean, which is controlled by multiple genes. It is of great significance to locate soybean protein content-related loci and mine candidate genes for directional breeding of soybean varieties with high protein content. In this study, an F2population consisting of 265 individual plants was constructed by crossing the excellent variety Heinong 88 as the female parent with the high-protein germplasm P73-6B as the male parent. The genotypes of F2population were identified by using high-density SNP chip of “ZDX1” and the physical map was constructed. Combined with the protein content phenotypic data, the initial mapping interval of a 2.46 Mb QTL was located on chromosome 20 using the IciMapping 4.2 software. Using 11 polymorphic SSR markers screened out, the mapping range was narrowed from 2.46 Mb to 100.8 kb. Adding four SNP markers (Gm20_28349696, Gm20_30805913, Gm20_31341532, and Gm20_31483719), the interval was further reduced to 95.8 kb. The relative expression levels of the four genes contained in the interval in nine different tissues in both databases Phytozome v13.1 and PPRD RNA-seq yielded two candidate genes (and). These results provide a theoretical basis for soybean protein content gene cloning and protein regulation mechanism research, as well as elite material and molecular marker for breeding high protein soybean.

soybean; protein content; QTL mapping; candidate genes

10.3724/SP.J.1006.2023.24015

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31960408), 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(S2022ZD02)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31960408), the Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund (S2022ZD02), and the Agricultural Science and Technology Innovation Program.

邱麗娟, E-mail: qiulijuan@caas.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

楊碩, E-mail: 857813782@qq.com

2022-01-10;

2022-06-07;

2022-07-08.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220707.1133.005.html

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