韓 貝 孫思敏 孫偉男 楊細燕 張獻龍

綜述

植物體細胞胚胎發(fā)生的分子機制

韓 貝 孫思敏 孫偉男 楊細燕*張獻龍

華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良全國重點實驗室, 湖北武漢 430070

植物細胞的全能性是指每個細胞均具有該植物的全部遺傳信息, 其離體組織或細胞在適當培養(yǎng)條件下具有發(fā)育成完整植株的潛能。植物體細胞胚胎發(fā)生是最能體現(xiàn)植物細胞全能性的一種方式, 其在人工種子、單倍體育種、無性繁殖和種質保存等領域具有廣闊的應用前景, 其發(fā)生的機制也是基礎研究領域的熱點。近年來, 隨著技術的進步及研究的深入, 植物體細胞胚胎發(fā)生的分子調控機制取得了重要進展。植物體細胞胚胎發(fā)生是一系列基因在時空順序上表達調控的結果。本文系統(tǒng)綜述了體細胞胚胎發(fā)生過程中激素及逆境脅迫信號轉導、胚胎發(fā)育相關轉錄因子、胞外蛋白和表觀遺傳調控的作用, 并對本領域未來的研究重點及方向進行了展望。

體細胞胚胎發(fā)生; 激素及逆境脅迫信號轉導; 轉錄因子; 表觀遺傳修飾

植物體細胞胚胎發(fā)生是指由體細胞經(jīng)過離體培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體的過程, 該過程可直接從外植體表皮、亞表皮、懸浮細胞、原生質體發(fā)生, 也可以從脫分化的外植體形成愈傷組織的外部或內部產(chǎn)生。從體細胞向胚性細胞轉變是體細胞胚胎發(fā)生的前提, 該過程中離體的植物細胞經(jīng)歷脫分化形成愈傷組織, 然后脫分化狀態(tài)的愈傷組織和細胞經(jīng)歷再分化過程, 再度分化成不同類型的細胞、組織和器官, 甚至最終再生成完整的植株。這一過程涉及細胞的重編程、激活細胞周期、細胞分化及器官發(fā)育過程, 受到眾多轉錄因子、激素信號傳導途徑及表觀遺傳修飾等構成的復雜網(wǎng)絡調控。本研究就體細胞胚胎發(fā)生過程中關鍵基因的功能及調控機制、表觀遺傳機制及關鍵基因的應用等進行綜述, 為深入解析體細胞胚胎發(fā)生的分子機制及細胞全能性的研究提供理論依據(jù)。

1 激素信號轉導與植物體細胞胚胎發(fā)生

在體細胞胚胎發(fā)生過程中, 通過不同激素的配合使用可以有效調控體細胞胚胎發(fā)生的各個發(fā)育階段。比如, 通過調節(jié)生長素(auxin)與細胞分裂素(cytokinin, CTK)比率促進脫分化和愈傷增殖, 通過添加低濃度的乙烯(ethylene)促進體細胞胚胎發(fā)生, 通過赤霉素(gibberellins, GAs)調控胚性培養(yǎng)物到球形胚的轉化, 通過添加脫落酸(abscisic acid, ABA)來提高體細胞胚的質量等。外源激素對體細胞胚胎的作用主要是通過胞外或胞內的激素受體將外界刺激信號轉到核內, 從而調控基因的表達, 啟動發(fā)育程序。

1.1 生長素信號傳導及體細胞胚胎發(fā)生

生長素是誘導植物體細胞胚胎發(fā)生過程的重要植物生長調節(jié)劑。其中2,4-D在植物體細胞胚胎發(fā)生中的應用較為廣泛。一定濃度的生長素能夠促進愈傷組織的誘導和增殖。在棉花體細胞到胚性細胞的轉變中, 伴隨著內源生長素水平的升高, 表現(xiàn)為生長素信號途徑的激活[1]。與生長素合成、極性運輸和響應相關的基因被認為是植物體細胞胚胎發(fā)生的關鍵基因。目前已從不同植物中已解析出多個受生長素誘導表達的基因, 這些基因包括(Gretchen Hagen 3)、(Pin-formed)、生長素/吲哚乙酸蛋白基因(auxin/indole-3-acetic acid,)、生長素響應因子基因(auxin response factors,)和(small auxin-up RNAs)。生長素信號通路依賴生長素響應因子, 尤其是(jumonji C domain-containing protein 30)與和相互作用并直接與(lateral organ boundaries domain)家族基因(,等)的瞬時元件結合激活它們的表達,家族基因誘導的表達, 促進愈傷組織的增殖(圖1)[2-4]。另外, 在體細胞胚胎發(fā)生過程中, 外源生長素能激活胚胎發(fā)育相關轉錄因子調控網(wǎng)絡, 轉錄因子BABY BOOM (BBM)和LEC1- ABI3-FUS3-LEC2 (LAFL)復合物是體細胞胚胎發(fā)生的主要調節(jié)因子。BBM編碼AIL (aintegumenta-like)并直接調節(jié)所有LAFL基因[5]。同時LAFL基因也可以激活生長素合成和運輸進而調控體細胞胚胎發(fā)生。在體細胞胚胎發(fā)生過程中, 在SAM區(qū)域的較高濃度的生長素會誘導(WUSCHEL)基因的表達, 進而激活PIN1蛋白的極性定位, 促進體細胞胚胎的生長和發(fā)育[6]。

圖1 生長素信號傳導及體細胞胚胎發(fā)生

1.2 細胞分裂素信號與愈傷組織的增殖

在植物體細胞胚胎發(fā)生過程中, 大部分情況下生長素不是獨立發(fā)揮作用, 只有當生長素和細胞分裂素維持在合適的比例時, 才能促進愈傷組織的產(chǎn)生[7]。細胞分裂素信號轉導是一個“磷酸接力傳遞”的過程。細胞分裂素首先結合受體組氨酸激酶(histidine kinases, HK)并使其磷酸化, 將磷酸基團轉移給胞質中的磷酸轉運蛋白(histidine-phosphotransfer protein, HP), 磷酸化的HP進入細胞核并將磷酸基團轉移到A型和B型反應調節(jié)因子(Arabidopsis response regulator, ARR)上, 進而進行信號的傳遞和激活。擬南芥中超表達促使細胞周期相關基因的表達, 從而促進愈傷組織的分裂與增殖[8]。細胞分裂素信號的抑制基因和的超表達會抑制擬南芥根系頂端分生組織的起始和擬南芥的體細胞胚胎發(fā)生, 在擬南芥細胞分裂素受體基因和雙突變體中, 再生體細胞胚的根尖和莖尖發(fā)育畸形[9]。

1.3 乙烯信號與體細胞胚胎發(fā)生

植株的再生能力與乙烯的敏感性有一定的關聯(lián), 乙烯含量的升高及其信號途徑的激活有利于體細胞胚胎發(fā)生[10]。擬南芥中的研究表明, 用乙烯合成抑制劑處理或超表達乙烯合成抑制基因(ethylene- overproducer 1)會降低外植體的再生能力, 乙烯不敏感突變體(、等)的再生能力下降, 而乙烯響應負相關因子突變體(、)的再生能力增強[11]。在大豆體細胞胚胎發(fā)生過程中, 添加一定濃度的乙烯合成前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocylopropane-1-carboxylic acid, ACC)顯著促進大豆的體細胞胚胎發(fā)生效率, 而利用乙烯抑制劑氨基乙氧基乙烯甘氨酸(aminoethoxyvinylglycine, AVG)等處理則顯著抑制大豆的體細胞胚胎發(fā)生效率[12]; 在棉花中, 乙烯及其信號對愈傷組織的增殖起著正向調控作用。超表達(squamosa- promoter binding protein-like 10)促使乙烯合成酶相關基因(1-aminocyclopropane carboxylic acid oxidases)的表達, 從而提高愈傷組織的增殖率, 乙烯合成抑制劑AVG抑制處理降低乙烯的含量并顯著抑制愈傷組織的增殖; 而乙烯合成前體ACC處理則顯著促進外植體愈傷組織的增殖[13]。

2 逆境脅迫信號與愈傷組織再生

理論上所有離體植物細胞在合適的外界環(huán)境下均可表現(xiàn)全能性。外界環(huán)境因素(特別是逆境因素)是體細胞胚胎發(fā)生的重要影響因素。逆境因子(包括機械損傷)在體細胞胚胎發(fā)生的幾個主要階段都起著重要的作用, 很多研究者都將逆境因子的調控作為優(yōu)化體細胞胚胎發(fā)生體系的重要手段。在現(xiàn)有的誘導愈傷組織體系中, 培養(yǎng)基多采用MS培養(yǎng)基, 相對于維持植株正常生長或萌發(fā)胚生根成苗的含有逆境因子的低糖、低鹽、低滲的SH培養(yǎng)基及1/2 MS培養(yǎng)基來說, MS培養(yǎng)基無機鹽含量較高, 微量元素種類較全, 濃度也較高。另外, 很多物種, 包括胡蘿卜、苜蓿、煙草等, 均有通過利用逆境處理來促進體細胞胚胎形成及發(fā)育的研究, 涉及到的逆境因素也多種多樣, 主要有ABA處理、饑餓處理、滲透脅迫、高溫處理等[14-15]。

機械損傷是愈傷組織誘導原初誘導觸發(fā)因子[16]。再生的發(fā)生一般都是在創(chuàng)傷部位開始的。創(chuàng)傷可以誘導許多細胞反應, 包括激素的積累(茉莉酸)、Ca2+快速流入、活性氧(reactive oxygen species, ROS)爆發(fā)、細胞間遠程通訊中斷等。擬南芥(WIND1 WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION 1)及其同源物WIND2～WIND4是這一過程的中心調節(jié)因子。WIND1～WIND4是AP2/ERF轉錄因子家族成員, 在愈傷組織誘導過程中會在受傷處誘導迅速表達, 并促進細胞的脫分化及愈傷組織增殖。異位表達可使成熟的體細胞擺脫正常的分化程序而啟動誘導在組織和結構上無定形的細胞增殖, 以及保持其脫分化狀態(tài)[17]。轉基因植株()細胞狀態(tài)與2,4-D所誘導的愈傷組織細胞類似。WIND1蛋白是細胞分裂素應答的正調節(jié)因子, 主要通過對B型基因促進細胞分裂素信號傳導并直接激活(enhancer of shoot regeneration1)從而促進愈傷組織的形成(圖2)[17]。在損傷時也會誘導(sopentenyltransferase 3)、(lonely guy 1)、(lonely guy 4)和(lonely guy 5)并提高細胞分裂素水平, 進而通過(D-type cyclin 3;1)重新激活細胞周期[18]。其他(APETALA2/ethylene response factor)基因, 如和(PLETHORA3)、、也在傷口誘導的愈傷組織形成過程中上調表達, 并且還發(fā)現(xiàn)AP2/ERF和CTK介導的途徑調控網(wǎng)絡廣泛串聯(lián)[19]。

圖2 機械損傷通過調節(jié)因子WINs調控愈傷組織形成

3 轉錄因子與體細胞胚胎發(fā)生

雖然體細胞胚胎發(fā)生過程受諸多外界環(huán)境因素的影響, 但歸根結底是在各種因素的作用下, 體細胞中某些特異的基因啟動表達, 從而使體細胞脫分化并再分化轉變?yōu)榕咝约毎?。許多研究人員致力于解析體細胞胚胎發(fā)生過程的相關基因, 目前已鑒定和克隆了大量與體細胞胚胎發(fā)生相關的轉錄因子, 其中許多參與調節(jié)合子胚發(fā)生、分生組織分化和維持的轉錄因子都在體細胞胚胎發(fā)生過程中起著重要用。

3.1 核因子Y (nuclear factor Y, NF-Y)

核因子Y (nuclear factor Y, NF-Y), 又稱CCAAT盒結合因子(CCAAT-binding factor, CBF)或亞鐵血紅素激活蛋白(heme activator protein, HAP), 是一類普遍存在于酵母、動物、植物等真核生物中的轉錄因子, 通常由3種不同亞基組成, 即NF-YA (CBF-B或HAP2)、NF-YB (CBF-A或HAP3)和NF-YC (CBF-C或HAP5) 3個家族[20]。植物NF-YB對胚胎發(fā)生具有重要作用[21]。擬南芥中NF-YB家族共有13個成員, 分為LEAFY COTYLEDON 1 (LEC1)類和非LEC1 2類蛋白, 其中LEC1類包括LEC1和LEC1-LIKE (L1L), 是植物胚胎形成的中樞調控因子[22]。在胚性細胞、體細胞胚和未成熟種子中高表達, 并可賦予體細胞向胚性細胞發(fā)育的能力, 在體細胞胚胎發(fā)育的早期能維持胚性細胞的命運, 目前在多個物種中將其作為體細胞胚胎發(fā)生的標記基因[23-24]。與類似, 在胚性愈傷組織、體細胞胚和未成熟種子中高表達, 而在非胚性愈傷組織、營養(yǎng)組織中表達量較低,的異位表達可以代替發(fā)揮作用, 在柑橘營養(yǎng)組織中異位表達會誘導出胚[25]。

3.2 B3結構域轉錄因子

B3結構域轉錄因子家族屬于植物特異性轉錄因子家族。其中、(FUSCA3)和是含有B3結構域的與胚胎發(fā)育相關的調控因子, 是一類胚胎發(fā)育相關的標志基因, 與存在協(xié)同調控作用[26-27]。過量表達(或異位表達)基因調控、、、(abscisic acid-insensitive 3)和(wrinkeled 1)等轉錄因子基因的表達, 并促使體細胞向胚性細胞的轉變, 從而使轉基因植物具有了胚胎的特性[27]。與促進胚性細胞的形成不同,可直接誘導形成體細胞胚胎, 兩者可能激活不同的調控路徑[28]。同樣,基因在頂端分生組織特異表達, 可以促使轉基因植物在頂端分生組織產(chǎn)生體細胞胚[27]。、和的下調則顯著抑制直接和間接體細胞胚胎發(fā)生[5]。、和同時受生長素的誘導表達, 而且也可以對生長素合成基因(YUCCA4)直接調控, 同時激活生長素響應基因的表達, 進而激活生長素信號傳導途徑[29]。

3.3 AP2/ERF結構域蛋白

AP2/ERF結構域蛋白是植物特異性轉錄因子家族, 它們參與許多發(fā)育過程的調節(jié)。有幾個AP2/ ERF家族成員參與調控體細胞胚胎發(fā)生, 其中研究得最多的是BBM。最初是從甘藍型油菜花粉體細胞胚中分離得到的, 并在花粉體細胞胚和合子胚中表達。在擬南芥、辣椒、毛白楊等物種中的研究表明基因是植物細胞全能性的關鍵調控因子, 在體細胞胚胎發(fā)生過程中該基因能促進細胞分裂和形態(tài)發(fā)生, 異位表達基因或者擬南芥基因能在沒有外源植物生長調節(jié)劑或脅迫的情況下誘導體細胞胚胎的發(fā)生[30]。BBM能結合基因的啟動子, 從而調控這些基因的表達, 進而調控(WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX 2)和等早期胚胎發(fā)生基因; 反過來,的表達也受到LAFL蛋白質的調節(jié), 它們形成交互網(wǎng)絡共同促進體細胞胚胎發(fā)生[31-32]。另一個成員是擬南芥(EMBRYO MAKER)在胚發(fā)育的早期和成熟胚中表達, 異位表達促進擬南芥子葉體細胞胚胎發(fā)生的啟動[33]。在機械損傷部分提到過的也是AP2/ERF轉錄因子家族中調控體細胞胚胎發(fā)生的成員,可以與途徑相互作用,與單獨激活或相比, 在外植體中按順序依次激活和能誘導出更多的胚性愈傷[19]。

3.4 同源異形域轉錄因子

同源異形域(homeodomain, HD)是指真核生物中一個由約60個氨基酸組成的高度保守的具有轉錄因子特征的DNA結合域, 其最早是在果蠅體節(jié)發(fā)育中發(fā)現(xiàn)并命名的, 之后在高等植物中發(fā)現(xiàn)包含該類結構域的基因有重要作用。其中WOX轉錄因子家族在胚的發(fā)育、頂端分生組織建成和器官形成中發(fā)揮重要作用。是WOX家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員, 在分生組織階段該基因的表達受生長素和細胞分裂素的誘導, 調控分生組織維持的特性; 反之,基因調控體細胞胚胎發(fā)生過程中生長素依賴的營養(yǎng)組織向胚性組織轉變[34-35]。超表達會誘導體細胞胚胎發(fā)生及莖尖和根尖器官發(fā)生, 異位表達基因可使那些難以誘導體細胞胚胎發(fā)生的頑拗型材料去分化產(chǎn)生不定芽和體細胞胚[35-36]?；蚴羌毎至阉貞鸬呢撜{節(jié)因子, 通過抑制A型基因的表達, 與細胞分裂素信號傳導途徑協(xié)同作用, 進而決定體細胞胚胎過程中某些細胞的命運[37]。另外由于可以穿過頂細胞層并激活其負調控因子(CLAVATA3)的轉錄, 這種WUS-CLV的反饋回路可以維持干細胞庫的穩(wěn)定和頂端分生組織的發(fā)育[34,36]。WOX家族其他成員也被發(fā)現(xiàn)具有調控體細胞胚胎發(fā)生的功能。在擬南芥中,是胚胎發(fā)育中細胞命運決定和頂端分化的調控因子, 包括頂端分生組織干細胞的啟動, 發(fā)育后期還參與側生器官的形成和分離[38]。在松樹中被作為體細胞胚胎發(fā)生的標志基因[39]。(SHOOT MERISTEMLESS)是同源異性域轉錄因子KNOXI (KNOTTED1-like homeobox I)家族的成員, 與和共同作用保持頂端分生組織的干細胞微環(huán)境, 并調節(jié)細胞增殖和分化的平衡[40]。甘藍型油菜中的異位表達可以調節(jié)對外源生長素的敏感性并促進擬南芥體細胞胚胎發(fā)生[41]。

4 體細胞胚胎發(fā)生過程中的信號轉導

4.1 類受體激酶與體細胞胚胎發(fā)生

SERK (somatic embryogenesis receptor-like kinase)是體細胞胚胎發(fā)生過程中促進體細胞向胚性細胞轉變的關鍵激酶。它首先是在研究胡蘿卜體細胞向胚性細胞轉變的過程中發(fā)現(xiàn)的, 其僅在胚性細胞的球形期表達, 而在非胚性細胞或其他時期的體細胞胚胎中均不表達[42]。SERK屬于富含亮氨酸重復序列受體類似激酶(leucine-rich repeat receptor-like kinase, LRR-RLK)亞家族的成員, 通過識別分子信號進而介導其蛋白的LRR結構域與胞外蛋白結合, 誘導細胞內的信號級聯(lián)放大。這些信號可識別不同的靶標, 并利用染色質重塑提高體細胞胚胎發(fā)生早期響應基因的表達(如和), 從而誘導組織或體細胞向胚性細胞發(fā)生轉變[43]。異位表達擬南芥基因可促進其體細胞胚胎發(fā)生,該基因可作為體細胞胚胎發(fā)生過程中標記基因[44]。植物激素對SERK基因的表達和信號轉導起重要作用。的表達受到生長素和細胞分裂素的協(xié)同調控,和則參與生長素特異性反應, 并且和與油菜素內酯信號傳導有關[45]。也是屬于LRR- RLK亞家族的成員, 雖與SERK同屬一個家族, 但它們在體細胞胚胎發(fā)生中的功能卻是相反的, 在蕓薹屬植物中,抑制體細胞胚胎發(fā)生轉錄因子(如)的表達進而抑制體細胞胚胎發(fā)生[38]。

4.2 鈣信號與體細胞胚胎發(fā)生

Ca2+作為第二信使, 在植物生長發(fā)育及環(huán)境響應中起著重要的作用。有研究認為液泡Ca2+濃度增加是識別胚胎發(fā)生細胞的原初信號, 胚性細胞啟動胚胎發(fā)育時伴隨著較大的Ca2+濃度的波動, Ca2+的梯度調控胚胎發(fā)育階段極性分化及器官建成[46]。較高濃度的Ca2+提高胚性愈傷組織的形成和胚胎發(fā)生的頻率, 缺乏Ca2+會阻止體細胞胚的形成。

細胞Ca2+信號由Ca2+感受器進行感受并傳遞。植物中存在3種主要的Ca2+感受器。被熟知的是鈣調素(calmodulin, CaM)和類鈣調素蛋白(calmodulin- like proteins, CMLs)[47]。CaM受生長素誘導表達, 并在誘導體細胞胚胎發(fā)生后期(胚性愈傷到胚發(fā)育階段)特異性表達, 一般定位于發(fā)育中胚胎的分生組織區(qū)域。CaM具有促進細胞增殖的作用; 采用鈣調素抑制劑W7 [-(6-氨基己基)-5-氯-1-萘磺胺鹽酸鹽]處理則會抑制體細胞胚胎發(fā)生。鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase, CDPK)是第2類Ca2+感受器, 它包含一個C-末端CaM樣結構域, 可以直接結合Ca2+并進行下游信號的傳遞, 阻斷CDPK介導的信號通路抑制胚胎發(fā)生[48]。第3類Ca2+感受器是鈣調磷酸酶B亞基類似蛋白(calcineurin B-like protein, CBL)家族, 與CaM不同, CBLs只在高等植物中存在, 并特異與蛋白質激酶CIPKs (CBL-interacting protein kinases)家族相互作用進行鈣信號轉導[49]。在棉花體細胞胚胎發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)和家族基因差異表達, 超表達基因影響棉花體細胞的脫分化過程, 并可能與生長素信號通路存在交叉互作[1]。

5 胞外蛋白與體細胞胚胎發(fā)生

為了在植物中誘導體細胞胚胎發(fā)生, 已經(jīng)開發(fā)了多種誘導系統(tǒng)。這些系統(tǒng)中的分子有助于激發(fā)植物細胞的胚性潛能, 促進體細胞胚胎的發(fā)生。在此過程中也篩選到一些胚胎特異性基因作為區(qū)分胚性和非胚性細胞培養(yǎng)物的標記, 并發(fā)現(xiàn)了許多胞外蛋白也可作為胚胎發(fā)生潛力的標記物或調控體細胞胚胎發(fā)生的信號分子[47]。

5.1 阿拉伯半乳糖蛋白

阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan-proteins, AGPs)是一類富含羥脯氨酸或脯氨酸的糖蛋白, 廣泛存在于植物的細胞壁、細胞膜和組織的細胞間隙, 并可以分泌到培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中[50]。AGPs能促進多個物種的體細胞胚胎發(fā)生, 有些可作為細胞能否進行體細胞胚胎發(fā)生的早期標志。添加外源AGPs提高胡蘿卜、仙客來、云杉、香蕉和小麥非胚性細胞系的胚性能力, 增加體細胞胚胎的數(shù)量[51-52]。去除細胞壁上的AGPs會使原生質體形成體細胞胚胎的能力下降, 而加入胞外AGPs則會逆轉去除細胞壁的部分效果。添加從胡蘿卜種子AGP中分離的可使失去體細胞胚胎發(fā)育能力的細胞系重新啟動胚形成, 添加與AGP特異結合的抑制劑Yariv (1,3,5-三[4-β- D葡吡喃糖基-氧化苯基-偶氮基]-2,4,6-三羥基苯)導致細胞增殖受阻, 抑制體細胞胚胎發(fā)生[53-54]。AGPs調節(jié)體細胞胚胎發(fā)生的作用機制可能體現(xiàn)在兩方面: (1) AGPs一般存在于胞外或膜的界面, 與細胞壁非共價結合, 能快速移動、降解, 可作為信號分子影響細胞識別及信號傳遞, 進而影響細胞增殖、分化, 導致發(fā)育軌跡的改變; (2) AGP可作為多種酶的底物, 裂解后產(chǎn)生不同種類的寡糖分子, 寡糖分子作為信號分子參與發(fā)育調控。有研究表明同時添加幾丁質酶和AGP能進一步加快體細胞胚胎發(fā)生的頻率, 幾丁質酶能裂解AGP的寡糖基鏈, 產(chǎn)生信號分子, 促進體細胞胚胎的發(fā)生[55]。

5.2 脂質轉運蛋白

脂質轉運蛋白(lipid transfer protein, LTP)是一類分子量小于10 kD的小分子可溶性堿性蛋白[56]。在動物中, 有些LTP蛋白參與癌細胞增殖的調控。植物中LTP含量高, 占可溶性蛋白的4%左右。有些非特異性基因在幼嫩組織、營養(yǎng)生長時期的分生組織、幼胚中優(yōu)勢表達, 并在體細胞胚胎發(fā)生過程進行富集, 被認為是體細胞胚胎發(fā)生誘導的早期標記[58]。(extracellular protein 2)是胡蘿卜胚性培養(yǎng)中第一個被分離和鑒定的編碼LTP的基因, 其分泌到胞外,在原胚性細胞中高表達, 而在非胚性細胞中不表達[57-58]。棉花基因在下胚軸、非胚性細胞組織和植株中不表達, 但在胚性細胞、球形胚高量表達, 而在球后期體細胞胚胎中表達量又下降[59]。是葡萄體細胞胚胎發(fā)育過程中表皮原形成的標志, 異位表達導致胚胎嚴重畸形, 導致表皮層出現(xiàn)異常[60]。

6 體細胞胚胎發(fā)生的表觀遺傳調控

一般認為, 植物體細胞比動物體細胞具有更強的可塑性, 已分化的離體植物細胞在一定培養(yǎng)條件下可脫分化并獲得全能性或亞全能性, 在這個過程中, 植物細胞必須獲得改變細胞發(fā)育命運的潛能, 這一過程也伴隨著染色質水平和基因表達水平的重編程, DNA甲基化、組蛋白去乙?；?甲基化、miRNA等重要的表觀調控因子也是影響體細胞胚胎發(fā)生的重要因素[61]。

6.1 DNA甲基化

植物體細胞胚胎發(fā)生過程受DNA甲基化的調控。一般來說, 非胚性愈傷組織基因組甲基化水平高, 而胚性愈傷組織的基因組甲基化水平較低, 這一現(xiàn)象在刺五加、甜菜、棉花、黑松等中都能觀察到[62]。體細胞胚的發(fā)育過程也伴隨著DNA甲基化水平的變化, 體細胞胚胎發(fā)育早期階段較低, 隨著體細胞胚胎的發(fā)育逐漸增加, 到子葉胚階段達到最高值[63]。在擬南芥等中發(fā)現(xiàn)體細胞胚胎發(fā)生過程的調節(jié)需要一定水平的DNA甲基化維持, 甲基化抑制劑5-氮雜胞苷(5-azacitidine, 5-AzaC)處理誘導DNA胞嘧啶甲基化水平降低, 抑制非胚性愈傷組織的增殖或胚性愈傷組織的體細胞胚胎發(fā)生能力[64]。DNA甲基化可通過引起胚胎發(fā)生特定基因的啟動進而影響體細胞胚胎發(fā)生。基因啟動子在體細胞中被甲基化, 隨著外源培養(yǎng)條件的施加, 其甲基化狀態(tài)被消除, 促進體細胞向胚性細胞的轉變及體細胞胚的產(chǎn)生, 隨后在胚胎發(fā)育成熟后再次被甲基化[65]; 同樣, 在擬南芥中, 5-AzaC處理顯著抑制外植體的體細胞胚胎發(fā)生能力, 處理后體細胞胚胎發(fā)生調節(jié)基因、和等的表達也均顯著降低, 但在DNA甲基化酶基因(和)突變體中這些基因明顯上調表達并提高體細胞胚胎發(fā)生頻率[64]。DNA甲基化受2,4-D的調控, 在誘導階段, 高濃度的2,4-D通過DNA甲基化關閉原有分化細胞內基因的表達; 去除2,4-D后使DNA去甲基化。

6.2 組蛋白甲基化

在體細胞胚胎發(fā)生過程中, 發(fā)現(xiàn)DNA甲基化作用的同時也發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化對體細胞胚胎形成的影響。兩個研究得較多的組蛋白甲基化修飾是關于組蛋白H3的第27位賴氨酸的三甲基化(H3K27me3)和第4位賴氨酸的三甲基化(H3K4me3), H3K27me3是動、植物發(fā)育重要基因的沉默基因轉錄標記物, 而H3K4me3是轉錄激活標記物。

組蛋白甲基化由組蛋白甲基轉移酶完成。擬南芥中, 組蛋白甲基轉移酶PRC2通過H3K27me3來抑制相關基因的表達, 從而促進細胞分化, 反之則引起細胞脫分化, 誘導體細胞胚胎發(fā)生[66]。在擬南芥中(Polycomb repressive complex 2)基因(CURLY LEAF,和SWINGER,)或(VERNALIZATION 2,和EMBRYONIC FLOWER 2,)雙突變體在莖尖脫分化形成愈傷組織, 間接導致體細胞胚胎發(fā)生并形成異位根[67],與野生型相比,的突變體在營養(yǎng)組織中顯示出更高的體細胞胚胎誘導能力[68]。大部分胚性相關基因、、和以及分生組織調節(jié)因子、和等基因的染色質區(qū)域都含有H3K27me3等甲基化位點[69]。而和與胚胎發(fā)生轉錄抑制因子和等互作, 并通過表觀修飾抑制胚胎發(fā)生相關靶標基因的表達從而抑制愈傷組織的形成和體細胞胚胎發(fā)生。除了H3K27me3在體細胞胚胎發(fā)生發(fā)揮功能外, 在擬南芥還發(fā)現(xiàn)賴氨酸特異性去甲基酶LDL3可以在愈傷組織形成過程中特異性消除H3K4me2, 進一步使愈傷組織具有芽分化的能力[70]。

6.3 組蛋白去乙?；?/h3>

組蛋白去乙酰化也是一種與植物體細胞胚胎發(fā)生密切關聯(lián)的組蛋白修飾。在激素誘導下組蛋白乙酰化水平和組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)的活性在體細胞胚胎發(fā)生過程中會發(fā)生明顯變化。而且組蛋白H3和H4的乙?；瘯龠M體細胞胚胎發(fā)生。組蛋白乙?；乃胶臀恢檬艿浇M蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase, HAT)和組蛋白去乙?；傅膰栏窨刂? 并影響植物的許多發(fā)育過程[71]。HDAC抑制劑曲古抑菌素A (trichostatin A, TSA)處理小麥培養(yǎng)物可增加胚性愈傷誘導率和芽分化率[72]。HDAC雙突變體或TSA處理誘導胚性標記基因、和的上調表達, 促進體細胞胚胎發(fā)生[73]。在擬南芥利用成熟的合子胚進行體外培養(yǎng)時, 經(jīng)過TSA處理無需額外施加生長素便能夠誘導體細胞胚形成, 這可能是由于TSA處理后生長素合成通路基因(、)、胚胎發(fā)育相關轉錄因子(、、)及脅迫響應因子/等顯著上調表達引起的[74-75]。HDA6和HDA19分別特異性結合VAL1 (VP1/abscisic acid insensitive 3-like1)和VAL2 (VP1/abscisic acid insensitive 3-like2), 并通過表觀修飾抑制胚胎發(fā)生相關靶標基因的表達從而抑制愈傷組織形成和體細胞胚胎發(fā)生[76]。(PICKLE)是擬南芥中主要的染色質重塑因子, 在抑制細胞過度增殖中起核心作用。其突變體在種子萌發(fā)后形成愈傷組織, 在突變體中和的H3K27me3水平下降導致甲基化抑制解除; 其另一突變體易誘導形成愈傷組織, 而該表型可被外施TSA模擬[77]。

6.4 miRNA的調控作用

植物的miRNA通過轉錄和轉錄后水平的基因沉默對植物細胞發(fā)育命運進行調控[78]。水稻中發(fā)現(xiàn)在分化的胚性愈傷比未分化的胚性愈傷中有更高的表達量; 而表達則相反[79]。柑橘和棉花等物種中也發(fā)現(xiàn)類似結果, 同時發(fā)現(xiàn)、、、、等也在體細胞胚胎發(fā)生過程中差異表達[78]。通過調控其靶基因的表達參與調控體細胞胚胎發(fā)生。在柑橘中超表達或敲除其2個靶基因和株系的體細胞胚的數(shù)量顯著高于對照[80], 而且在體細胞胚胎發(fā)生的標志基因的超表達材料中可以發(fā)現(xiàn)miR156a在整個體細胞胚胎過程均顯著上調[81]。是的另一個成員。棉花中對及其靶標研究發(fā)現(xiàn)其通過調控乙烯信號和類黃酮生物合成調控逆境下棉花體細胞胚胎發(fā)育[13]。miRNA的調控體細胞胚胎發(fā)生可能通過2個方面: (1) miRNA參與植物激素信號的轉導。植物體細胞胚胎發(fā)生過程中多個激素信號途徑相關基因被發(fā)現(xiàn)受miRNA調控; (2) 體細胞胚胎發(fā)生過程中一些重要轉錄因子可作為miRNA的直接靶標。miRNA可通過降解互補的mRNA或影響mRNA翻譯降低蛋白水平。

7 關鍵基因在體細胞胚胎發(fā)生和遺傳轉化中的應用

隨著研究的不斷深入和新技術的涌現(xiàn), 體細胞胚胎發(fā)生所涉及的激素信號轉導, 基因轉錄調控、表觀遺傳修飾與代謝物動態(tài)變化等復雜分子生物學過程都在逐步深入地闡釋。然而, 目前雖然通過對組織培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染等方法的優(yōu)化, 擬南芥、楊樹、水稻、玉米、棉花等植物的遺傳轉化體系得以成功建立, 但植物的高效遺傳轉化仍存在許多問題, 如基因型依賴性嚴重、轉化效率不高。隨著對體細胞胚胎發(fā)生機制深入研究, 一些調控體細胞胚胎發(fā)生的關鍵基因被發(fā)現(xiàn)并逐漸用于改進植物遺傳轉化體系和再生植株的效率, 從而實現(xiàn)植物的高效遺傳轉化[82]。

和是2個提高植物遺傳轉化效率的關鍵基因。在玉米中用和兩個基因共轉化未成熟胚時, 愈傷組織的比例顯著提升, 且在多個不易轉化的玉米自交系中取得較高的轉化效率[83]。此外, 在水稻、高粱中利用和的共轉化也實現(xiàn)轉化效率提高[83]。在雙子葉植物甜椒中, Heidmann等[84]發(fā)現(xiàn)瞬時表達基因可高效誘導體細胞再生, 并分化出大量可發(fā)育成完整植株的體細胞胚胎; 將和或和共轉化煙草、番茄、葡萄等植物中可實現(xiàn)了芽的原位誘導[85]。因此解析體細胞胚胎發(fā)生過程中關鍵基因的功能及調控機制, 開發(fā)更高效的遺傳轉化方法, 有望實現(xiàn)更多植物的遺傳高效再生體系建立。

8 總結與展望

體細胞胚胎發(fā)生是體細胞在沒有受精的情況下再生為胚狀體的過程, 是展現(xiàn)植物細胞具有全能性的一個重要途徑。自20世紀50年代以來, 體細胞胚胎發(fā)生的研究經(jīng)歷了從經(jīng)驗方法到系統(tǒng)性理論研究的發(fā)展, 并在多個物種成功建立起再生體系[86]。對于體細胞胚胎發(fā)生的研究, 從最開始通過對外植體的選擇、培養(yǎng)基類型、激素含量的配比及組合等進行優(yōu)化開展研究; 發(fā)展到對植物體細胞胚胎發(fā)生調控基因的研究, 并利用調控體細胞胚胎發(fā)生的關鍵基因去提高植物的轉化及再生效率; 再到對植物體細胞胚胎發(fā)生過程基因的調控網(wǎng)絡、代謝物質的變化、表觀遺傳調控機制的研究, 說明對體細胞胚胎發(fā)生的分子機制不斷深入及完善。

隨著分子生物學的進步和測序技術的發(fā)展。多組學技術的應用加速了對植物體細胞胚胎發(fā)生分子機制的解析。利用RNA-seq揭示體細胞胚胎發(fā)生過程中基因的動態(tài)變化, 借助代謝組技術解析體胚發(fā)育各個階段的內源物質變化, 并通過對表觀組學的研究揭示體細胞胚胎發(fā)生過程中表觀遺傳機制(DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白去乙?；癿iRNA)對基因表達調節(jié)。并且隨著將來單細胞測序技術、空間轉錄組等新技術在植物體細胞胚胎發(fā)生上的應用, 體細胞胚胎發(fā)生起源單細胞還是多細胞的問題有可能得到解決。此外, 隨著轉基因技術及基因編輯技術利用, 對植物體細胞胚胎過程中基因型依賴嚴重、轉化效率低等問題也在逐步得到改善。

盡管當前體細胞胚胎發(fā)生的研究進展迅速, 但仍然存在許多謎團。2005年,創(chuàng)刊125周年之際公布了125個最具挑戰(zhàn)性的科學問題, 其中植物細胞全能性被列入最重要的25個科學問題。2021年9月,公布了植物細胞生物學15個最重要的問題, 其中有多個問題都涉及到植物細胞全能性和多能性的表達。理論上, 只要條件合適, 所有的植物細胞都可以表現(xiàn)全能性, 得到再生植株。然而, 植物細胞再生實際上只能在有限的植物中實現(xiàn); 而且離體細胞胚胎發(fā)生和器官再生的細胞學和分子機理的研究都不夠完善。體細胞胚胎發(fā)生的起源是單細胞還是多細胞？在不同的發(fā)生體系中究竟是哪一類或哪幾類細胞如何被選中進行重編程, 從而再生？雖然已有研究表明這些再生大都來源于植物的干細胞, 但植物的干細胞究竟如何界定？表觀遺傳修飾如何參與并協(xié)調再生過程？這些問題都是未來研究中的重點。

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Molecular mechanisms of somatic embryogenesis in plants

HAN Bei, SUN Si-Min, SUN Wei-Nan, YANG Xi-Yan*, and ZHANG Xian-Long

National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China

Plant cell totipotency refers to that each cell has all the genetic information of the plant, andtissues or cells has the potential to develop into a whole plant under appropriate culture conditions. Somatic embryogenesis is the most efficient way to reflect the totipotency of plant cells. It has broad application prospects in the fields of artificial seeds, haploid breeding, asexual reproduction, and germplasm preservation, and its mechanism is also a hotspot in basic research. In recent years, with the deve-lopment of technology and in-depth research, the molecular regulation mechanism of plant somatic embryogenesis has made important progress. Plant somatic embryogenesis is the result of the expression and regulation of a series of genes in spatiotemporal order. In this review, we systematically reviewed the roles of hormones and stress signal transduction, embryonic development related transcription factors, extracellular proteins, and epigenetic regulation in somatic embryogenesis, and prospected future research priorities and directions in this field.

somatic embryogenesis; hormone and stress signaling transduction pathways; transcription factor; epigenetic regulation

10.3724/SP.J.1006.2023.24103

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD1000907)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD1000907).

楊細燕, E-mail: yxy@mail.hzau.edu.cn

E-mail: bhan_z@163.com

2022-04-08;

2022-08-01;

2022-08-09.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220808.1609.002.html

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