張文宣 梁曉梅 戴 成 文 靜 易 斌 涂金星 沈金雄 傅廷棟 馬朝芝

利用CRISPR/Cas9技術突變基因降低甘藍型油菜的耐鹽性

張文宣 梁曉梅 戴 成 文 靜 易 斌 涂金星 沈金雄 傅廷棟 馬朝芝*

華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良全國重點實驗室 / 國家油菜工程技術研究中心 / 洪山實驗室, 湖北武漢 430070

甘藍型油菜是我國一種重要的油料作物。MPK6是一種絲裂原活化蛋白激酶, MAPK級聯(lián)途徑可以被各種脅迫激活, 進而調(diào)節(jié)植物對脅迫的響應, 在植物響應非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用, 但在甘藍型油菜鹽脅迫響應過程中的功能還尚不清楚?；蚪Y(jié)構(gòu)和蛋白序列分析表明, MAPK6在十字花科蕓薹屬植物種間分化相對保守, 基因結(jié)構(gòu)相似, 蛋白之間均有相同的STKc_TEY_MAPK結(jié)構(gòu)域, 與脅迫和生長發(fā)育相關。為探究其功能, 本研究利用CRISPR/Cas9技術對基因進行編輯, 通過農(nóng)桿菌介導的方法將基因轉(zhuǎn)入到甘藍型油菜中, 獲得了基因4個同源拷貝同時突變的材料:和。突變體表現(xiàn)出明顯的鹽敏感性: 在100 mmol L–1和150 mmol L–1濃度的NaCl溶液處理下, 功能缺失突變體長勢明顯緩慢, 并且株高和鮮重顯著低于野生型植株, 但根長無明顯差異。此外, 在鹽脅迫下, 功能缺失突變體體內(nèi)的活性氧和丙二醛含量的積累顯著高于野生型對照, 脯氨酸含量也明顯高于野生型植株。本研究結(jié)果表明,基因在鹽水脅迫下正向調(diào)控植株的生長和發(fā)育, 影響甘藍型油菜的耐鹽性。本研究不僅為基因調(diào)控甘藍型油菜鹽脅迫的研究提供了理論基礎, 而且為甘藍型油菜耐鹽性遺傳改良提供了一定的技術支持。

甘藍型油菜;; CRISPR/Cas9; 鹽脅迫

油菜是中國重要的油料作物[1], 我國主要種植是甘藍型油菜[2]?；贑RISPR/Cas9的基因編輯技術, 打破了傳統(tǒng)育種依靠誘變獲得突變體的限制, 可以定向改良作物的農(nóng)藝性狀, 已經(jīng)成為最熱門的生物技術之一[3]。CRISPR/Cas9技術通過設計特異的靶向性位點, 引導sgRNA與Cas9蛋白相結(jié)合, 進而對目標基因DNA序列進行剪切, 然后通過非同源末端連接的DNA修復方式, 造成序列的缺失、錯配和插入, 使基因發(fā)生突變[4-5]。由于其載體構(gòu)建簡單、編輯效率高等優(yōu)點, 已經(jīng)廣泛應用在水稻、擬南芥、玉米和油菜等作物中[6-9]。

植物在環(huán)境中不斷受到外界刺激信號的影響, 包括對植物生長發(fā)育不利的脅迫信號。其中, 非生物脅迫是制約植物生長、造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)下降、威脅糧食安全的主要原因之一。近年來, 由于極端天氣的不斷出現(xiàn), 進一步加劇了非生物脅迫對農(nóng)作物產(chǎn)量的影響[10]。土壤鹽堿化不僅大面積的影響了耕地面積, 造成總產(chǎn)量的下降, 而且引起的鹽離子毒害對作物的危害日益嚴重。鹽脅迫會引起滲透脅迫、氧化脅迫和離子毒害, 影響植物細胞活性[11]。SOS途徑是植物中的一種非生物脅迫信號轉(zhuǎn)導途徑[12], 與植物耐鹽性密切相關, 其主要功能是負責胞內(nèi)Na+外排[13]。在這個途徑中, SOS3感知鹽脅迫誘導的細胞內(nèi)游離鈣水平的增加, 并與SOS2相互作用形成SOS3-SOS2激酶復合體, 通過解除SOS1自抑制作用從而激活SOS1活性, 激活SOS1把Na+排出細胞外[14-15]。在SOS途徑中, MAPK6 (絲裂原活化蛋白激酶6)也參與此信號傳導途徑, MAPK6與磷脂酸結(jié)合進而被激活, 活化的MAPK6結(jié)合并激活SOS1, 完成Na+排出細胞外這一活動[16]。植物的MAPK激酶家族成員很多, MAP3Ks被刺激的質(zhì)膜受體激活, 激活MAP3Ks磷酸化并激活MAP2Ks, 進而磷酸化并激活MAPKs[17]。植物的MAPK級聯(lián)途徑在生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。近年來, 植物中有部分MAPK激酶信號級聯(lián)途徑已被闡明, 其中最具特征的是MAPK3、MAPK4和MAPK6, 它們參與逆境反應相關的各種信號級聯(lián)[18], 例如非生物脅迫[19], 早期的研究結(jié)果表明, MAPK6在低溫和鹽脅迫處理下可以被上游的MKK2所激活, 并存在一條磷酸化信號轉(zhuǎn)導途徑[20]; 乙烯反應[21], 乙烯作為一種重要的植物激素, 也參與脅迫下的調(diào)控, 在植物生長發(fā)育階段, 昆蟲口器和病原體都會引起乙烯含量的增加, 2003年, Ouaked等[22]發(fā)現(xiàn), MAPK6可以激活乙烯的表達, 2008年, Xu等[24]進一步確定了多種非生物脅迫和生物脅迫因素均可激活MAPK6的表達進而引起乙烯的產(chǎn)生[23]; 以及胚珠發(fā)育等, 表明植物信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡中MAPK級聯(lián)的復雜性。在擬南芥中的研究結(jié)果還表明MAPK6激酶可以被低溫、觸傷、滲透脅迫激活[25]。

雖然基因在植物應對各種脅迫過程中發(fā)揮著不同的調(diào)控功能, 但目前關于MAPK基因家族成員在甘藍型油菜非生物逆境脅迫響應過程中的作用報道較少。本研究利用實時熒光定量PCR分析了在鹽脅迫下的表達特征以及在各個組織中的表達模式, 同時采用CRISPR/Cas9技術對基因進行編輯, 通過農(nóng)桿菌介導的方法將基因轉(zhuǎn)入到甘藍型油菜中研究其耐鹽性, 為進一步研究基因在植物耐鹽性中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及生物學軟件

甘藍型油菜基因組參考BnPIR (http://cbi.hzau. edu.cn/bnapus/index.php)泛基因組數(shù)據(jù)庫; 白菜和甘藍基因組參考BRAD (http://brassicadb.org/brad/)數(shù)據(jù)庫; 擬南芥基因組參考TAIR (https://www.arabi-dopsis.org/); 基因序列重新預測其結(jié)構(gòu)使用網(wǎng)站Fgenesh-M (http://linux1.softberry.com/berry.phtml); 在InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/)網(wǎng)站對蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域進行分析; 使用MEGA7.0進行序列比對和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹; GeneDoc處理序列比對結(jié)果; 利用生物信息學軟件TBtools完成部分結(jié)果可視化。

1.2 試驗材料

以甘藍型油菜(L.)品系‘Westar’為主要植物材料, 由華中農(nóng)業(yè)大學油菜改良中心提供, 常規(guī)材料種植于華中農(nóng)業(yè)大學試驗田, 轉(zhuǎn)基因材料種植于溫室或轉(zhuǎn)基因試驗田, 所有材料按照田間管理辦法種植。

所用的載體質(zhì)粒骨架pKSE401由中國農(nóng)業(yè)大學陳其軍教授實驗室提供, 用于甘藍型油菜‘Westar’的遺傳轉(zhuǎn)化。本研究使用大腸桿菌宿主菌DH5α、農(nóng)桿菌菌株GV3101購自北京全式金生物技術有限公司。由北京擎科生物科技有限公司合成引物, 由安諾優(yōu)達基因科技有限公司完成測序。

1.3 植物葉片DNA提取

采用CTAB法[26]提取油菜材料的DNA, 所有材料均選取苗期鮮嫩葉片。用ddH2O調(diào)至50 ng μL–1儲存在–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA提取和qRT-PCR分析

選取飽滿的野生型種子進行萌發(fā), 待種子萌發(fā)7 d后, 選取長勢一致的幼苗, 將幼苗分為4組, 每組分成3個重復, 每個重復3株單株。將幼苗根部浸入100 mmol L–1NaCl的水溶液中進行鹽水脅迫處理, 在0、1、3和6 h分別剪取葉片和根部進行RNA提取。利用SV Total RNA Isolation System (Z3100, Promega)試劑盒提取植物組織RNA, 利用Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser (RR047, TaKaKa)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋50倍作為模板。使用Perl Primer設計引物,為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應體系為SYBR Realtime Mix 10 μL, 包含上下游引物各0.8 μL、cDNA模板8.4 μL。qRT-PCR反應程序為95℃預變性3 min; 95℃變性10 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 共45個循環(huán)。每個處理3個生物學重復, 并使用2–ΔΔCT方法計算基因的相對表達量。相關引物見表1。

1.5 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

利用甘藍型油菜基因組參考BnPIR (http://cbi. hzau.edu.cn/bnapus/index.php)泛基因組數(shù)據(jù)庫進行blast比較分析, 鑒定出4個同源拷貝, 分別為()、()、()和()。采用靶點設計網(wǎng)站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)分別在()和()的第4個外顯子以及()和()的第5個外顯子的保守序列位置設計2個sgRNA, 將2個靶點構(gòu)建到載體中。

1.6 農(nóng)桿菌介導的甘藍型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌介導的下胚軸暗光培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化方法, 將構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體導入到油菜的受體材料‘Westar’的下胚軸中, 經(jīng)過組織培養(yǎng)的繼代轉(zhuǎn)化方式獲得陽性苗[27]。

1.7 HI-TOM高通量測序確定突變單株的突變基因型

為進一步確定陽性苗的突變類型, 本研究利用HI-TOM (High-throughput Tracking of Mutations)測序。按照2輪PCR擴增的方式: 第1輪PCR使用靶點特異性引物擴增目標序列; 第2輪PCR以第1輪PCR產(chǎn)物為模版, 使用通用引物進行擴增(文章作者提供序列)[28], 最后將第2輪PCR產(chǎn)物混合并純化回收, 送安諾優(yōu)達公司進行二代高通量測序, 測序得到的數(shù)據(jù)通過在線網(wǎng)站Hi-Tom (http://www.hi-tom.net/hi- tom/)分析每個單株的具體突變類型[28]。相關引物序列見表2。

表1 qRT-PCR引物序列

表2 高通量測序引物序列

1.8 BnaMPK6功能缺失突變體在鹽脅迫下生理指標的測定

1.8.1 丙二醛和脯氨酸含量測定 選取T1代功能缺失突變體和野生型對照種子同時萌發(fā), 7 d后進行水培培養(yǎng), 培養(yǎng)14 d后進行100 mmol L–1和150 mmol L–1濃度的NaCl溶液處理, 處理7 d后對其株高、根長和鮮重表型進行觀察。之后, 取0.5 g植株葉片充分研磨后測定丙二醛和脯氨酸的含量[29]。

1.8.2 NBT染色步驟 稱取0.05 g NBT粉末, 加入磷酸緩沖液(pH 7.5) 500 μL震蕩溶解, 加水定容至50 mL。將葉片浸于NBT染液中并抽真空30 min, 室溫下黑暗染色8 h, 在90%無水乙醇中80℃煮沸脫色。后置于光學顯微鏡下照相觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 MAPK6基因結(jié)構(gòu)分析和進化樹構(gòu)建

在擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫TAIR查找到1個基因的核苷酸和蛋白質(zhì)序列; 在油菜數(shù)據(jù)庫BnPIR中獲得Westar的全基因組數(shù)據(jù)(westar.all. v0); 在蕓薹屬數(shù)據(jù)庫BRAD中下載白菜(Brapa_ genome_v3.0)和甘藍(Brassica_oleracea_JZS_v2)全基因組數(shù)據(jù)。基于AtMPK6的蛋白序列, 使用TBtools軟件的BLAST功能, 分析出油菜、白菜和甘藍全基因組所有潛在的基因。用MEGA7.0使用最大似然值的分析方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 研究在擬南芥、甘藍型油菜、白菜型油菜和甘藍進化水平上的關系。從系統(tǒng)進化樹可以看出, 甘藍型油菜、白菜型油菜和甘藍具有較高的同源性, 種間分化相對保守?；蚪Y(jié)構(gòu)可視化分析發(fā)現(xiàn),基因在內(nèi)含子和外顯子數(shù)量上具有較大相似性, 其中、、、和有6個外顯子,、和有5個外顯子(圖1)。

圖1 擬南芥、甘藍型油菜、白菜型油菜和甘藍MPK6基因的系統(tǒng)進化樹及基因結(jié)構(gòu)

2.2 MAPK6蛋白質(zhì)序列以及保守結(jié)構(gòu)域分析

利用BnPIR數(shù)據(jù)庫, AtMPK6蛋白序列在線BLAST冬性油菜Westar、白菜型油菜和甘藍全基因組。將蛋白序列進行對比, 并定位保守結(jié)構(gòu)域。對其保守結(jié)構(gòu)域進行分析發(fā)現(xiàn), MAPK6在甘藍型油菜、擬南芥、白菜型油菜和甘藍中具有相同的STKc_ TEY_MAPK結(jié)構(gòu)域, 屬于MAPK基因家族TEY亞型A亞家族, 是不穩(wěn)定的脂溶性親水酸性蛋白, 與逆境脅迫、生長發(fā)育和激素相關。統(tǒng)計結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基差值發(fā)現(xiàn), BnaC03.MPK6、BnaC04.MPK6、BnaA05.MPK6和BnaA03.MPK6與AtMPK6、BolMPK6、BraA03.MPK6和BraA05.MPK6的氨基酸殘基差異僅在2%左右, 具有很微小的差異。對比蛋白全長序列, BnaC03.MPK6、BnaA03.MPK6、BolMPK6、BraA05.MPK6與AtMPK6相比僅有2%左右的差異, 缺失了3個氨基酸殘基, BnaC04. MPK6、BnaA05.MPK6、BraA03.MPK6與AtMPK6相比僅有2%左右的差異, 缺失了5個氨基酸殘基(圖2)。

2.3 BnaMPK6基因表達模式分析

2.3.1基因在不同組織中表達模式分析 為研究不同組織中的表達情況, 以苗期‘Westar’多個組織的cDNA為模板, 通過qRT-PCR確定表達量。在各組織中均有表達。在各個營養(yǎng)組織中(根、莖、葉、芽),、以及均有較高的表達量, 其中在所有拷貝中表達量最高。在營養(yǎng)組織中表達量均比較低, 是4個拷貝中表達量最低的。總體來看,是一個泛表達的基因, 其中、和在各組織中均有高表達,在各組織中均維持較低表達水平(圖3-A)。

2.3.2基因在不同的鹽水處理時間下表達模式分析 為了解基因在鹽水脅迫處理下表達量的差異, 以脅迫處理后幼苗cDNA為模版, 進行qRT-PCR試驗分析其表達模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在根和葉中的表達量最高, 在根中不同處理時間下的表達量無顯著差異, 在葉片處理3 h和6 h時, 表達量較未處理時有顯著升高。在根和葉中的表達量均為最低, 在根和葉中不同處理時間下的表達量無顯著差異。在根中處理1 h時, 表達量較未處理時有所降低, 但在3 h時表達量又升高到與未處理時相近的表達量, 在6 h時又降低到與3 h相近的表達量; 在葉片中處理1、3和6 h時, 表達量較未處理時有顯著升高。在根和葉片中隨著處理時間的變長, 表達量逐漸升高, 在根中處理6 h時顯著升高, 在葉片中處理1、3和6 h時, 表達量較未處理時有顯著升高?？傮w來看,基因在葉片中的表達量差異顯著, 在根中差異不顯著, 并且一直都有最高表達量。因此本研究推測,基因在鹽水脅迫時主要影響植株的地上組織部分, 對鹽水脅迫響應敏感(圖3-B)。

圖2 擬南芥、甘藍型油菜、白菜型油菜和甘藍MPK6的蛋白序列和保守結(jié)構(gòu)域

2.4 BnaMPK6功能缺失突變體的獲得

為研究油菜的基因功能, 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對的4個拷貝進行敲除?；赪estar參考基因組, 將基因序列提交到CRISPR-P (http://crispr.hzau.edu.cn/ CRISPR2/), 篩選位置合適且得分高的sgRNA, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在a基因序列內(nèi)有符合要求的靶點, 雙靶點序列定位于和的第4個外顯子以及和的第5個外顯子上。高通量建庫測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn), T0代株系均為雜合突變, 其中和為雜合四拷貝突變體, 經(jīng)過測序篩選出相對穩(wěn)定遺傳的T1代四突變體材料和, sgRNA處發(fā)生了堿基的缺失和插入, 編輯類型如圖4-B。圖4-C匯總了部分株系的的編輯情況。設計的靶點被成功編輯, 氨基酸序列翻譯過程會提前終止(圖4)。

2.5 BnaMPK6基因影響鹽脅迫下植株長勢

為探究基因正向調(diào)控鹽水脅迫并影響植株發(fā)育, 進行了苗期不同濃度的鹽水脅迫處理。苗期是植株發(fā)育的初期, 對鹽水脅迫十分敏感, 研究鹽水脅迫下苗期的植株發(fā)育對于植物的耐鹽機制的研究具有重大意義。本試驗選取飽滿的突變體材料、和野生型種子進行萌發(fā), 待種子萌發(fā)7 d后, 選取長勢一致的幼苗, 在營養(yǎng)液中繼續(xù)進行培養(yǎng), 待長出4～5片真葉開始施加100 mmol L-1和150 mmol L-1濃度的NaCl溶液, 每組設置3個生物學重復, 處理7 d后, 拍照并對其長勢進行觀察, 統(tǒng)計株高、根長和鮮重。結(jié)果顯示, 在100 mmol L-1和150 mmol L-1濃度的NaCl溶液處理下, 與野生型相比較,和植株受到脅迫, 植株矮小, 長勢顯著緩慢。尤其是地上部分, 隨著鹽濃度的升高, 株高逐漸受到抑制, 在150 mmol L-1NaCl溶液處理后,和株高比野生型降低約50%; 根長無顯著變化, 長勢基本一致; 鮮重明顯降低, 僅是野生型植株的1/2 (表3)。由此推測對鹽水響應敏感, 抑制其表達會影響鹽脅迫下植株的生理發(fā)育(圖5)。

圖3 BnaMPK6基因表達模式分析

A:在4個不同組織的表達模式; B、C:在不同的鹽水處理時間下的表達模式。數(shù)據(jù)計算采取2-DDCt法, 每個數(shù)據(jù)3個重復,的相對表達量設定為200。以0 h處理為對照, 使用檢驗進行顯著性分析, 星號(*)代表< 0.05時顯著性情況。

A: the relative expression patterns of6 genes in four different tissues; B, C: the relative expression pattern ofgenes under different salt treatment time. The data was calculated in the light of the 2–DDCtmethod and the mRNA levels ofgenes set to 200. 0 hour is used as control, the asterisk (*) are significantly different (-test: *,< 0.05).

圖4 cr-bnampk6突變體編輯情況

A:基因結(jié)構(gòu)可視化和靶點位置; B:單株T1代基因靶點突變情況; C:株系T0代和T1代部分基因編輯類型統(tǒng)計。藍色代表變異; 紅色和綠色代表靶點序列。d#: 缺失#個堿基; i#: 插入#個堿基; wt: 野生型。

A: the visualization ofgene structure and the target sites; B: the mutation of targeted sites ofhomoulogous inT1plants; C: the partial editing results of T0and T1generation of. The blue parts indicate mutations; the red and green parts indicate target sites. d#: # of bp deleted from target site; i#: # of bp inserted from target site; wt: wild type.

2.6 BnaMPK6基因影響鹽脅迫下植株體內(nèi)活性氧和脯氨酸的含量

為探究鹽水脅迫后抑制基因表達導致植物長勢緩慢的可能因素, 測定了相關指標的變化。本試驗對100 mmol L–1和150 mmol L–1濃度NaCl溶液處理后的植株進行活性氧、丙二醛和脯氨酸含量的測定表明, 在鹽水脅迫處理后植株體內(nèi)的活性氧大量積累, 相較于野生型,和葉片染色顏色加深, 表明功能缺失突變體植株體內(nèi)有嚴重的氧化損傷發(fā)生。鹽水脅迫后植株體內(nèi)丙二醛(MDA)含量增, 說明膜質(zhì)過氧化加劇, 與野生型做比較,和丙二醛(MDA)含量明顯增加, 說明體內(nèi)遭受了嚴重的鹽脅迫并最終導致植株長勢顯著緩慢。與對照相比,和脯氨酸含量顯著升高, 表明植物受到了鹽水脅迫導致脯氨酸含量升高以響應滲透脅迫, 保護植物正常發(fā)育和生長(圖6)。

表3 不同濃度NaCl溶液處理后cr-bnampk6表型分析

表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差; 同一行的相同處理中不同小寫字母表示在< 0.05水平存在顯著差異(樣本數(shù)= 20)。

Data indicate mean±SD; The different lowercase letters in the same treatment of the same line indicate the phenotypic difference is significant at the 0.05 probability level (=20). WT: wild type.

圖5 不同濃度NaCl溶液處理后BnaMPK6基因耐鹽性分析

A: WT和植株鹽脅迫下的表型; B: WT和植株在鹽脅迫下根長分析; C: WT和植株在鹽脅迫下鮮重分析; D: WT和植株在鹽脅迫下株高分析。以WT為對照, 使用檢驗進行顯著性分析, 星號(*)代表< 0.05時顯著性情況。

A:WT andplants phenotypes under salt stress; B:root length of WT andplants under salt stress; C:fresh weight of WT andplants under salt stress; D:plant height of WT andplants under salt stress. WT are used as control, the asterisk (*) are significantly different (-test: *,< 0.05).

圖6 不同濃度NaCl溶液處理后cr-bnampk6植株的活性氧和脯氨酸含量分析

A: NBT染色分析植株活性氧含量; B:植株丙二醛含量分析; C:植株脯氨酸含量分析。ROS: 活性氧; MDA: 丙二醛; Pro: 脯氨酸。以WT為對照, 使用檢驗進行顯著性分析, 星號(*)代表< 0.05時顯著性情況。

A:the accumulation of ROS ofplants by NBT; B:the accumulation of MDA ofplants; C:the accumulation of proline ofplants. ROS: reactive oxygen species; MDA: malondialdehyde; WT are used as control, the asterisk (*) are significantly different (-test: *,< 0.05).

3 討論

近幾年, CRISPR/Cas9基因編輯技術已經(jīng)在各種農(nóng)作物中得到廣泛應用, 并且其創(chuàng)造的功能缺失突變體可以得到穩(wěn)定遺傳, 為基因功能研究提供了良好的技術支持。根據(jù)前人的研究, 發(fā)現(xiàn)利用基因編輯技術敲除基因可以創(chuàng)造出脅迫敏感突變體[30]。本研究利用Westar基因組中同源基因的保守序列選擇了2個靶點, 分別靶向基因的4個同源拷貝的保守的外顯子序列。高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn), 根據(jù)2個靶點設計的sgRNA實現(xiàn)了目標位點的編輯突變。本研究選擇其中4個拷貝同時被編輯的單株和進行后續(xù)的試驗, 并且在T1代獲得了穩(wěn)定遺傳的純合突變體材料。

土壤鹽濃度過高對幾乎所有重要的作物都會產(chǎn)生影響, 影響其生長發(fā)育[28], 因此植物進化了各種耐鹽機制, 例如MAPK級聯(lián)途徑。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)在植物中廣泛存在并表達, 在植物抵抗生物和非生物脅迫, 例如高鹽、冷害、干旱和病害以及在植物胚胎發(fā)育等過程中發(fā)現(xiàn)了多個,其中對、和研究較多[19,30]。目前已經(jīng)在多種作物中相繼報道了敲除和過表達基因, 會影響植物應對不利環(huán)境[31-32], 例如在甘薯中過表達基因, 會提高植物對低溫脅迫的耐受性[33]; 在擬南芥中敲除基因, 會降低植物對冷脅迫的耐受性[31]; 在UV-B處理下, 與野生型相比,敲除突變體表現(xiàn)出更強烈的耐受性[34]; 利用JA處理敲除突變體后, 植株根長長勢緩慢, 表現(xiàn)出明顯的不耐受性[35], 但是在甘藍型油菜中的研究很少。因此, 研究油菜缺失基因的表達在鹽水脅迫下相關的生理指標和生長情況的變化, 可以為研究植物的耐鹽性提供新的遺傳學基礎。

本研究發(fā)現(xiàn),基因在鹽水處理后表達量上調(diào)。當鹽水處理其功能缺失突變體后, 株系的長勢以及鮮重等生理指標顯著低于野生型。在和植株中還發(fā)現(xiàn)了氧化物質(zhì)的積累和保護性物質(zhì)的增加。在正常生長環(huán)境下, 植物會通過抗氧化機制和過氧化機制調(diào)節(jié)體內(nèi)的ROS含量。但當植株處理逆境脅迫下時, 植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)會被激活, 會導致活性氧(ROS)的積累, 進而導致氧化應激反應的發(fā)生和細胞損傷[36-37]。受到氧化脅迫后, 活性氧產(chǎn)生的損傷進而會導致植物體內(nèi)的丙二醛(MDA)含量增加, 其含量的高低通常能代表植物細胞受到脅迫的水平[38]。但當植物處于脅迫環(huán)境中時, 植物為了維持自身生長發(fā)育的穩(wěn)定性, 會積累大量的保護性物質(zhì)來調(diào)節(jié)體內(nèi)的滲透壓, 脯氨酸可以作為滲透保護物質(zhì)進行滲透調(diào)節(jié), 維持植物在逆境下的穩(wěn)定性, 因此脯氨酸的含量可以作為植物脅迫下的重要生理指標,可以在一定程度反映植物的抗逆性。可見,基因不僅會影響植物對鹽脅迫的耐受性, 進而影響其生長發(fā)育, 還與植物體內(nèi)抗氧化機制的活性有關。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9技術有效編輯了基因的所有同源拷貝, 并驗證了油菜缺失基因后, 會導致植物體內(nèi)發(fā)生氧化損傷和保護性物質(zhì)的增加, 進而抑制了植物苗期的生長發(fā)育。因此,基因在油菜中可能參與逆境脅迫過程, 正向調(diào)控植物的耐鹽機制。本研究獲得的鹽敏感突變體材料, 對油菜抗逆相關的基礎性研究和抗逆育種都具有重要意義。

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Genome editing ofgene by CRISPR/Cas9 for loss of salt tolerance inL

ZHANG Wen-Xuan, LIANG Xiao-Mei, DAI Cheng, WEN Jing, YI Bin, TU Jin-Xing, SHEN Jin-Xiong, FU Ting-Dong, and MA Chao-Zhi*

National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University / National Engineering Research Center of Rapeseed / Hongshan Laboratory, Wuhan 430070, Hubei, China

L. is an important oil crop. MPK6 (Mitogen-Activated Protein Kinases 6) is activated by various stresses to control plant stress tolerance, which is the key gene in response to abiotic stresses. However, the function of MAPK6 instress tolerance is still unclear. Gene structure and protein sequence analysis showed thatgene structures were similar, and all proteins had the same STKc_TEY_MAPK domain in.To explore the potential role of, themutants were generated by CRISPR/Cas9 genome editing technology. Two quadruple mutants,and, were obtained.mutant lines were hypersensitive to salt treatment (100 mmol L–1and 150 mmol L–1), the growth of the mutant was strongly inhibited after salt treatment, and the plant height and fresh weight were significantly lower than those of wild-type plants, but there was no significant difference in root length. In addition, reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA), and free proline were more accumulated inmutant lines. In conclusion, these results revealed thatgene positively regulated salt tolerance in, providing theoretical and technical supports for genetic improvement of salt tolerance in

L.;; CRISPR/Cas9; salt stress

10.3724/SP.J.1006.2023.24013

本研究由中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項基金(2662020ZKPY020)和國家重點研發(fā)計劃項目(2020BBB061)資助。

This study was supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities (2662020ZKPY020) and the National Key Research and Development Program of China (2020BBB061).

馬朝芝, E-mail: yuanbeauty@mail.hzau.edu.cn

E-mail: 18645272827@163.com

2022-01-10;

2022-06-07;

2022-07-08.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220707.1125.003.html

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