孫金芝 賈新超 高 偉 宋偉光 趙鵬宇 趙 劍*

(1.河北植物提取創(chuàng)新中心有限公司，邯鄲 057250；2.河北省植物源動物保健品技術(shù)創(chuàng)新中心，邯鄲 057250；3.河北省植物資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，邯鄲 057250)

葉黃素是一種含氧類胡蘿卜素，多項(xiàng)研究表明葉黃素沉積在視網(wǎng)膜黃斑，可以吸收藍(lán)光并通過淬滅氧自由基來保護(hù)視網(wǎng)膜免受光誘導(dǎo)的氧化損傷[1-2]。而作為飼料添加劑，葉黃素能沉積在雞蛋、肉雞和水產(chǎn)動物的皮膚中，滿足消費(fèi)者對畜禽產(chǎn)品色澤的偏好[3-4]。同時(shí)，與果蔬和補(bǔ)充劑等食物來源相比，通過生物體蓄積的葉黃素也有更好的生物利用度[5-6]。

天然葉黃素的主要工業(yè)來源是提取和皂化萬壽菊中的葉黃素酯獲得葉黃素單體?；莶Φ萚7]在大鼠上的研究認(rèn)為動物可以直接利用葉黃素酯，但其生物利用度僅相當(dāng)于葉黃素單體的18.55%。相反，黃小春等[8]研究表明，蛋雞對葉黃素酯和葉黃素的利用效率沒有顯著差異。本研究擬通過比較葉黃素酯和葉黃素在蛋雞體內(nèi)的消化和沉積情況，以及對蛋黃顏色的影響，探討葉黃素酯作為蛋雞飼料添加劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

葉黃素和葉黃素酯為萬壽菊提取，類胡蘿卜素含量均為2%；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(X6250)、玉米黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(14681)均為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取350日齡、健康的海蘭灰蛋雞72只，隨機(jī)分成2個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只雞。試驗(yàn)期共56 d，劃分為2個(gè)階段。階段1為28 d的耗竭期，期間飼喂粉狀小麥型基礎(chǔ)飼糧(表1)，其營養(yǎng)水平配制標(biāo)準(zhǔn)參照《海蘭灰商品蛋雞飼養(yǎng)管理手冊》。階段2為28 d的正試期，期間2個(gè)組分別飼喂在小麥型基礎(chǔ)飼糧中添加40 mg/kg葉黃素和葉黃素酯的試驗(yàn)飼糧。飼糧取樣后凍存于-80 ℃待測。試驗(yàn)期間的環(huán)境參數(shù)和日常管理參照《海蘭灰商品蛋雞飼養(yǎng)管理手冊》執(zhí)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

在階段1結(jié)束時(shí)，每個(gè)組隨機(jī)挑選6只蛋雞進(jìn)行翅靜脈采血并分離血清，之后屠宰取肝臟和卵巢樣品，另以重復(fù)為單位收集當(dāng)日的雞蛋，使用雞蛋品質(zhì)測定儀(以色列奧卡EA-01)對蛋黃顏色評分后將蛋黃勻漿均勻。在階段2的最后4 d，每日記錄產(chǎn)蛋數(shù)，對蛋黃顏色評分，并以重復(fù)為單位連續(xù)收集蛋黃和部分糞便及時(shí)凍存于-80 ℃。階段2結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選1只蛋雞采集血清、肝臟和卵巢樣品。

1.3 檢測指標(biāo)

飼糧、糞便、血清、肝臟、卵巢和蛋黃中的類胡蘿卜素含量使用高效液相色譜(HPLC)儀測定，儀器型號為沃特世E2695，使用Ultimate硅膠柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動相為正己烷∶乙酸乙酯∶異丙醇(730∶270∶15)，流速設(shè)置為1.4 mL/min，運(yùn)行時(shí)間20 min，柱溫40 ℃，紫外檢測器波長設(shè)置為474 nm。樣品中的類胡蘿卜素含量以葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品做單點(diǎn)定量法計(jì)算。

飼糧和糞便樣品的前處理參考GB/T 23187—2008《飼料中葉黃素的測定 高效液相色譜法》，但樣品不進(jìn)行皂化，即：稱取2 g左右的飼糧或10 g左右的糞便置于具塞三角瓶中，加入30 mL的萃取劑(正己烷:丙酮∶無水乙醇∶甲苯=34∶23∶20∶23)超聲萃取10 min后，再加入30 mL正己烷和50 mL的10%無水硫酸鈉溶液，劇烈振蕩1 min后離心(4 000 r/min，5 min)，然后抽取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上樣檢測。

血清樣品的前處理參考黃旸木等[9]的方法略作修改，即：移取0.5 mL血清至2 mL離心管中，加入0.5 mL的無水乙醇(含0.01%抗壞血酸)，渦旋1 min后再加入0.7 mL的正己烷，繼續(xù)渦旋2 min后3 000 r/min離心7 min，吸取上清液過0.22 μm濾膜后上樣檢測。

肝臟、卵巢和蛋黃樣品前處理參考GB 5009.248—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉黃素的測定》略作修改，即：肝臟、卵巢或蛋黃樣品勻漿后，稱取5 g左右至50 mL離心管中，加入20 mL混合溶劑(正己烷∶甲醇∶乙酸乙酯=1∶1∶1)，2 500 r/min下渦旋20 min，再加入10 mL正己烷和10 mL的10%無水硫酸鈉溶液，劇烈振蕩后4 000 r/min離心5 min，抽取上清液過濾上樣。

葉黃素和葉黃素酯的表觀消化率測定采用內(nèi)源指示劑法，以飼糧和糞便中的鹽酸不溶灰分作為內(nèi)源指示劑，其測定方法按GB/T 23742—2009《飼料中鹽酸不溶灰分的測定》執(zhí)行。

一是實(shí)施意識領(lǐng)先方略，強(qiáng)化水安全意識。充分重視水在社會經(jīng)濟(jì)中的重要基礎(chǔ)地位，提高水作為資源要素、環(huán)境要素、生態(tài)要素、安全要素的基本認(rèn)識，統(tǒng)籌謀劃水資源開發(fā)利用與社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展。進(jìn)一步落實(shí)領(lǐng)導(dǎo)責(zé)任，尤其是地方政府責(zé)任，把水安全責(zé)任落實(shí)作為干部政績考核、選拔任用的重要依據(jù)。建立健全節(jié)水社會動員參與機(jī)制，充分利用各類媒體，全面客觀介紹水資源危機(jī)、節(jié)水常識，保護(hù)水文化遺產(chǎn)，提高公眾節(jié)水意識。高度重視和發(fā)揮非政府組織在水安全中的積極作用，營造企業(yè)履行社會責(zé)任的社會環(huán)境。

飼糧中葉黃素或葉黃素酯沉積到蛋黃中的效率參考Karadas等[10]的方法計(jì)算，計(jì)算公式為：

葉黃素或葉黃素酯沉積效率(%)=雞蛋中的類胡蘿卜素(A)總量/飼糧中的類胡蘿卜素(B)總量。

式中：A=蛋黃重(g)×[試驗(yàn)組蛋黃中類胡蘿卜素含量(mg/kg)-耗竭期蛋黃中類胡蘿卜素含量(mg/kg)]；B=采食量(g)×飼糧中類胡蘿卜素含量×產(chǎn)蛋率(%)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，使用回歸-線性進(jìn)行相關(guān)性分析和方程擬合，以P<0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧和糞便中類胡蘿卜素含量及表觀消化率

葉黃素和玉米黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品在本試驗(yàn)色譜條件下的保留時(shí)間分別為10.26和11.39 min；萬壽菊來源葉黃素酯的酯基為多種脂肪酸，無標(biāo)準(zhǔn)品，其保留時(shí)間需根據(jù)葉黃素酯樣品皂化前后色譜峰的變化情況確定，在本試驗(yàn)的色譜條件下其保留時(shí)間為2.33 min。

圖1和圖2分別展示了飼糧和糞便中類胡蘿卜素的出峰情況。從圖中可見，飼糧中保留時(shí)間2.33 min的為葉黃素酯，10.26 min的為葉黃素，11.39 min的為玉米黃質(zhì)；糞便中還有保留時(shí)間3.39 min的物質(zhì)；與葉黃素酯組飼糧不同，該組糞便中葉黃素酯和葉黃素都可檢出。表2列出了飼糧和糞便中類胡蘿卜素含量。由表中數(shù)據(jù)可知，小麥型基礎(chǔ)飼糧和耗竭期蛋雞糞便中類胡蘿卜素含量很低。添加葉黃素或葉黃素酯飼糧的類胡蘿卜素含量檢測結(jié)果與理論添加量(40 mg/kg)較一致。

圖1 飼糧中類胡蘿卜素色譜圖Fig.1 Chromatogram of carotenoids in diet

圖2 糞便中類胡蘿卜素色譜圖Fig.2 Chromatogram of carotenoids in excrement

表2顯示，葉黃素和葉黃素酯的表觀消化率分別為81.76%和84.80%，但差異不顯著(P>0.05)。

2.2 肝臟中類胡蘿卜素含量

圖3展示了肝臟中類胡蘿卜素的種類。從圖中可見，3個(gè)肝臟樣品中類胡蘿卜素種類一致。肝臟中類胡蘿卜素主要以葉黃素酯的形式存在，除葉黃素酯、葉黃素和玉米黃質(zhì)外，在3～5 min還有物質(zhì)出峰，可能是類胡蘿卜素經(jīng)肝臟代謝后的產(chǎn)物。由表2中數(shù)據(jù)可知，正試期內(nèi)葉黃素組和葉黃素酯組蛋雞肝臟中類胡蘿卜素含量遠(yuǎn)高于耗竭期，但2組間沒有顯著差異(P>0.05)。

圖3 肝臟中類胡蘿卜素色譜圖Fig.3 Chromatogram of carotenoids in liver

表2 不同樣品中類胡蘿卜素含量以及蛋黃色澤評分、類胡蘿卜素表觀消化率和沉積效率測定結(jié)果Table 2 Determination results of different samples for carotenoids content,yolk color score,apparent digestibility and deposition efficiency of carotenoids

2.3 血清、卵巢和蛋黃中類胡蘿卜素含量

圖4 血清中類胡蘿卜素色譜圖Fig.4 Chromatogram of carotenoids in serum

圖5 卵巢中類胡蘿卜素色譜圖Fig.5 Chromatogram of carotenoids in ovarium

圖6 蛋黃中類胡蘿卜素色譜圖Fig.6 Chromatogram of carotenoids in yolk

由表2中數(shù)據(jù)可知，飼喂添加葉黃素或葉黃素酯飼糧28 d后，其血清、卵巢和蛋黃中類胡蘿卜素含量比耗竭期明顯提高；正試期內(nèi)，葉黃素組和葉黃素酯組之間血清中類胡蘿卜素含量沒有顯著差異(P>0.05)，但卵巢和蛋黃中類胡蘿卜素含量則表現(xiàn)為葉黃素酯組顯著高于葉黃素組(P<0.05)。葉黃素組和葉黃素酯組類胡蘿卜素沉積到蛋黃中的效率分別是11.27%和16.70%，2組間差異顯著(P<0.05)。蛋黃中類胡蘿卜素含量(X)和蛋黃色澤評分(Y)的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.912，擬合線性方程為Y=0.182X+1.343(P<0.05)。

3 討 論

3.1 葉黃素酯在蛋雞體內(nèi)的消化

一般認(rèn)為，葉黃素酯會在消化道脂肪酶的作用下水解成葉黃素單體和脂肪酸而被吸收，但葉黃素酯與葉黃素單體的吸收效率孰高還存在爭議?；莶Φ萚7]的研究認(rèn)為，大鼠對葉黃素酯的生物利用度是葉黃素單體的18.55%。Hencken[11]評估葉黃素酯在肉仔雞的吸收效率為葉黃素單體的40%～60%。但是在蛋雞上的一些研究顯示，不論是從利用率還是蛋黃色澤，都表明蛋雞對葉黃素酯的吸收效率更高，至少是與葉黃素單體沒有明顯差異[8,12]。在本研究中，葉黃素酯組蛋雞的類胡蘿卜素表觀消化率及血清中類胡蘿卜素含量與葉黃素組相比均沒有顯著差異。由此可見，動物對葉黃素酯的利用率與動物種類和動物生長階段有關(guān)，成年家禽可以充分消化吸收葉黃素酯。

3.2 葉黃素在蛋雞組織里的沉積

飼料中的葉黃素或葉黃素酯在體內(nèi)的吸收可分為4個(gè)階段，即從食物中被消化釋放、與脂類形成水溶性膠束、被小腸上皮細(xì)胞吸收、通過淋巴系統(tǒng)運(yùn)輸至血液。但因家禽的淋巴系統(tǒng)不發(fā)達(dá)，包含類胡蘿卜素的乳糜微?？赡苤苯舆M(jìn)入腸系膜靜脈匯至門靜脈運(yùn)送至肝臟，微粒粒徑太大不會通過肝區(qū)毛細(xì)血管直接沉積，而由血液循環(huán)至其他組織[13-16]，在人上的研究顯示運(yùn)輸載體是高密度脂蛋白和低密度脂蛋白[17]，而在禽上則可能是極低密度脂蛋白[18]。Breithaupt等[12]總結(jié)認(rèn)為，葉黃素在血液中以單體形式運(yùn)輸，但在沉積部位會被該組織的酶重新酯化。對產(chǎn)蛋家禽而言，卵巢不合成脂類物質(zhì)[16]，故蛋雞血清、卵巢和蛋黃中的類胡蘿卜素種類一致，以葉黃素單體形式為主。相反，肝臟是體內(nèi)主要的葉黃素及其代謝物的儲存器官[17,19]。對產(chǎn)蛋家禽而言，肝臟的脂肪合成最為活躍[20]。本研究也證實(shí)，蛋雞肝臟中葉黃素酯為優(yōu)勢形式。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，蛋雞肝臟的類胡蘿卜素HPLC圖譜比飼糧類胡蘿卜素HPLC圖譜在3～5 min多3個(gè)出峰物質(zhì)，推測應(yīng)是葉黃素的代謝產(chǎn)物。葉黃素在體內(nèi)可發(fā)生C-3和C-3’氧化形成酮式類胡蘿卜素，按氧化程度和異構(gòu)劃分主要有3種，即：3-羥基-β,ε-3’酮基類胡蘿卜素、3-羥基-ε,ε-3’酮基類胡蘿卜素、ε,ε-3,3’二酮基類胡蘿卜素[19]。

3.3 葉黃素或葉黃素酯對蛋黃色澤的影響

蛋雞飼喂不添加色素的麥類飼糧的情況中，其蛋黃顏色羅氏色度為3～4。添加12 mg/kg的葉黃素后，蛋黃顏色評分在第5天即達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[21]。同樣的添加劑量在鵪鶉中，蛋黃顏色評分達(dá)到穩(wěn)定需要7 d，而蛋黃中的類胡蘿卜素含量達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)則需要11 d[22]。在本研究中，蛋黃的采樣時(shí)間為正試期的第28天，其顏色評分和類胡蘿卜素含量都處于穩(wěn)定狀態(tài)。此時(shí)，蛋黃顏色評分與蛋黃中類胡蘿卜素含量呈線性相關(guān)，意味著飼糧中添加的葉黃素或葉黃素酯在蛋黃中的沉積效率將決定著蛋黃色澤。

同時(shí)比較葉黃素和葉黃素酯在蛋雞中沉積效率的定量研究尚缺乏。有研究表明，添加12 mg/kg的葉黃素可使蛋黃中類胡蘿卜素含量分別達(dá)到37.87和39.01 mg/kg，其沉積效率分別為38%和36%[10,21]。在本研究中，添加40 mg/kg的葉黃素其蛋黃中類胡蘿卜素含量為26.35 mg/kg，沉積效率只有11.27%。Islam等[22]研究表明，飼喂添加40 mg/kg葉黃素酯的小麥型飼糧的蛋雞，蛋黃中總類胡蘿卜素含量為18.01 mg/kg。而本研究中相同添加劑量的葉黃素酯則使蛋黃中類胡蘿卜素含量達(dá)到了38.72 mg/kg。葉黃素或葉黃素酯的沉積效率受色素原料、使用劑量、試驗(yàn)動物品種、日齡、飼糧配方等的影響[10,22]，使不同研究的結(jié)果可比性較差。

本研究發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，葉黃素酯在蛋雞上的表觀消化率和在蛋黃中的沉積效率都高于葉黃素，從而使蛋黃色澤評分更高，提示這2種不同加工工藝的葉黃素產(chǎn)品存在吸收利用上的差異。相較于葉黃素單體，葉黃素酯沒有經(jīng)過皂化工藝，保留了脂肪酸、磷脂等成分。而這些成分使葉黃素形成的膠束更容易被吸收[23]。此外，皂化還會造成葉黃素產(chǎn)品中天然維生素E含量的損失。維生素E有促進(jìn)腸道吸收葉黃素的作用[22]，其原因可能是葉黃素易被氧化，而這種氧化可以被其他抗氧化物質(zhì)緩解，如添加100 IU/kg的維生素E可提高蛋黃色澤和葉黃素轉(zhuǎn)化率[24]。

4 結(jié) 論

① 葉黃素在蛋雞血液、卵巢和蛋黃中主要以單體的形式存在，而在肝臟中則主要以酯的形式存在。

② 葉黃素酯可以被蛋雞充分利用，且應(yīng)用效果不差于葉黃素單體。

③ 蛋黃中類胡蘿卜素含量與蛋黃顏色評分有顯著的線性關(guān)系。